慢性应激大鼠肝郁脾虚证水通道蛋白的表达

1、慢性应激大鼠肝郁脾虚证水通道蛋白的表达 陈婷婷1，宋炜熙*12，曾光12，唐燕萍12，陈北阳3，张国民3 （1湖南中医药大学中西结合学院内儿科教研室，2分子病理实验室，3病理教研室 湖南 长沙 410208) 摘要 目的 观测水通道蛋白在慢性应激肝郁脾虚证模型大鼠组织中的表达，研究逍遥丸对其表达的影响。方法 30只大鼠随机分为正常组、模型组及中药组，慢性应激抑郁模型加过度疲劳及饮食失节法复制大鼠肝郁脾虚证；中药组造模第7天始每天1次逍遥丸灌胃。以免疫组化研究AQP4及AQP3、AQP8在大鼠海马及胃肠中的表达。结果 模型组海马区AQP4下调，与正常组相比，差异有统计学意义（P<0.05）

2、，3组平均光密度分别为0.25±0.03、0.21±0.06、0.23±0.07；中药组小肠黏膜中AQP3的表达上调，3组小肠黏膜黏膜的平均光密度分别为0.15±0.02、0.17±0.02、0.21±0.02，与正常组相比，差异有统计学意义(P<0.05）；，AQP8在模型组肠黏膜及中药组胃、结肠粘膜中表达上调，差异有统计学意义（P<0.05）。3组胃黏膜的平均光密度为0.15±0.01、0.16±0.01、0.16±0.01，小肠黏膜的平均光密度分别为0.19±0.04、0.21

3、±0.04、0.22±0.04，结肠黏膜的平均光密度分别为0.22±0.06、0.19±0.01、0.21±0.04。结论：抑郁症肝郁脾虚模型大鼠AQPs的表达出现异常，逍遥丸能调节AQPs的表达。 关键词：AQPs；大鼠；肝郁脾虚证；逍遥丸；抑郁症中图分类号：R ；R 文献标识码： 收稿日期：2010-00-00*基金项目：湖南省中医药管理局（60010288）；从AQPs的表达探讨抑郁症肝郁气滞、肝郁脾虚证的发病机制与差异。通信作者 宋炜熙，E-mail：songweixi911，Tel:者简介 陈婷婷，女，1

4、988年生，在读研究生，湖南中医药大学中西结合学院 The impact of Xiao Yao Wan on the expressions of aquaporins in Spleen Deficiency of chronic stress depressive rats*CHEN ting-ting; SONG wei-xi;ZENG guang; TANG yan-ping; CHEN bei-yang; ZHANG guo-ming (1.Hunan University of Traditional Chinese Medicine Institute of TCM diagn

5、osis, Changsha,Hunan Province 410208, P.R.China;2.Pediatric and Internal Department of Integrative Medicine College, 3.Molecular Pathology Laboratory, Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan Province 410208, P.R.China)Abstract: 【Objective】 Observe aquaporins expressions in ch

6、ronic stress liver stagnation and spleen deficiency model rats research the expressions of Xiao Yao Wans affection.【Methods】Liver stagnation and spleen deficiency model rats were replicated by chronic milled unpredicted stress and fatigue and diet disloyal. 30 rats were randomly divided into normal

7、control group, model control group and Chinese intervention group, from the 7th day of making model, Chinese medicine group was intragastric administration Xiao Yao Wan one time everyday. AQP4 and AQP3, AQP8 expressions on hippocampus of rats model and gastrointestinal were detected by immunochemica

8、l staining method.【Results】The expressions of AQP4 of the model group was down-regulation on the hippocampus, Three groups average optical density were 0.25±0.03、0.21±0.06、0.23±0.07 respectively (P<0.05). AQP3 on small intestinal mucosa of chinese intervention was up-regulation. Av

9、erage optical density of 3 groups were 0.15±0.02、0.17±0.02、0.21±0.02 respectively ( P<0.05); Compared with normal group, The expressions of AQP8 on the intestinal mucosa of model group and on the gastric、colonic mucosa of chinese intervention group were up-regulation. Three groups

10、average optical density in gastric mucosa were 0.15±0.01、0.19±0.04、0.22±0.06 respectively, ( P<0.05), and small intestinal mucosa were 0.16±0.01、0.21±0.04、0.19±0.01 respectively (P<0.05), colonic mucosa were 0.16±0.01、0.22±0.04、0.21±0.04 respectivel

11、y（P <0.05）,the differences were significant statistically. 【Conclusions】The expressions of AQPS on spleen deficiency of chronic stress depressive rats were abnormal, and Xiao Yao Wan can treat the depression and liver stagnation and spleen deficiency by regulating the expressions of AQPS.Key word

12、s: Aquaporins；Rats；Liver stagnation and Spleen deficiency；Xiao Yao Wan；Depression 肝郁脾虚证是中医郁证中常见的一种类型，常因肝失疏泄，致脾失健运，在郁证中占有重要地位1。水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是一族在细胞膜上组成“孔道”并控制水进出的蛋白质，存在于不同的组织器官中,对于维持机体水的平衡起着重要作用。本实验观察AQPs在慢性应激肝郁脾虚证大鼠海马及胃肠黏膜中的表达，并观察逍遥丸对其表达的调节作用,以探讨逍遥丸的抗抑郁作用机制和治疗肝郁脾虚证的机理。1 资料与方法1.1 材料与试剂1.1.1动物

13、：健康Sprague-Dawley系大白鼠（清洁级），雄性，体质量（211.5±23.5）g，由湖南中医药大学动物实验中心提供。驯养一周后，实验前用旷场分析试验（Open-field法）对每只大鼠进行行为学评分，选择各项行为学指标得分相近的30只大鼠，严格控制条件下饲养：自由饮食、光/暗周期为12h/12h（光照时间为6：00-18：00），背景噪音（40dB±10dB），温度(20±3)，湿度40%-70%。1.1.2主要仪器及试剂：旷场分析试验所用敞箱参照文献2制作而成，高40cm，底边长100cm，内壁及底面均漆为黑色，底面分隔成面积相等的25个方格；Mod

14、tic数码显微摄像系统；北航MIAS医学图像分析软件；所用试剂盒及玻片均委托鼎国生物科技有限公司购买自Bioss Biosynthesis Biotechnology有限公司。逍遥丸由湖南九芝堂股份有限公司提供，生产批号：国药准字：Z43020469，每8丸约等于生药3g：蒸馏水配制成生药浓度为0.45g/ml的药液。1.2 试验方法1.2.1动物分组：将大鼠随机分为正常对照组（以下简称正常组）、肝郁脾虚证模型组（以下简称模型组），中药干预组（以下简称中药组）每组10只。正常组每笼5只，模型组及中药组单笼饲养。 1.2.2肝郁脾虚证模型：参照文献2-3加以改进,以慢性轻度不可预见性的应激模型（

15、chronic unpredicted mild stress）造模。方法：断水（24 h）；夹尾（1min）；45环境（5min）；昼夜颠倒；电击足底（电压50mv,每隔50s刺激1次，每次持续10s，共30次）；居住环境改变（潮湿垫料、鼠笼倾斜）；陌生气味；陌生物品噪音干扰1500Hz，95dB，1h/d；禁食24h。将这几种不同的应激因子在实验全程中应用，顺序随机，使大鼠不能预料刺激的发生，以避免发生适应性，平均每种刺激使用两次，在此基础上，予大鼠每天在温水(22±1)中游泳10分钟。隔日喂食(隔日禁食，隔日足量给食)，连续3周。 1.2.3给药方法：正常组不做任何处理，每日正

16、常进水、进食。其他组接受21天各种不同的应激，从第8天每日8：00灌胃，灌胃剂量45mlkg1，模型组以蒸馏水灌胃，中药组灌服逍遥丸药液，剂量约生药量2gkg1；相当于70kg成人临床用药等效剂量。 1.2.4实验大鼠脑及胃肠标本制备：造模第21天，对大鼠进行最后一次称重，将25%乌拉坦用生理盐水按每千克体重5ml配比后对动物进行腹腔麻醉，断颈处死动物，取下大脑及胃肠组织，放置于2%多聚甲醛中固定。 1.2.5免疫组织化学染色法及图像分析：石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，洗蜡，晾干；蒸馏水冲洗，过氧化氢中灭活，修片，山羊血清封片。抗AQPS（兔）稀释后加入大脑及胃肠组织切片中，4过夜，加二抗（兔），

17、加辣根酶，加染色剂，显色，固定切片。结果判定阳性细胞胞浆呈棕黄色。结果图像分析：待测切片在显微镜下用数码相机显微照相。运用MIAS医学图像分析软件进行图像分析。1.3 统计学分析 所有数据均采用均数±标准差（）表示。多组总体比较用方差分析，均数间比较选用q检验，检验水准=0.05，采用SPSS17.0统计软件包对数据进行统计分析。2 结果2.1 3组大鼠大脑中AQP4的表达模型组大脑海马区AQP4表达下调，与正常组相比，差异有统计学意义（P<0.05）,中药组与正常组和模型组比较，无明显统计学差异。见表1表1 3组在大鼠大脑中APQ4平均光密度值的比较（，n=10）注：与正常组

18、相比，*P <0.05。 组别 剂量mlkg1 大脑 正常组 - 0.25±0.03 模型组 4.5 0.21±0.06* 中药组 4.5 0.23±0.042.2 3组大鼠胃肠黏膜中AQP3的表达 三组AQP3在胃及结肠黏膜中的表达经统计学处理，组间及组内无差异。（P>0.05）； 在小肠黏膜中，模型组与正常组比较，无统计学意义，但中药组AQP3的表达上调，与其他两组比较，差异有统计学意义。（P<0.05）。见表2。表2 3组AQP3在大鼠胃肠中平均光密度值的比较（,n=10） 组别 剂量mlkg1 胃 小肠 结肠 正常组 - 0.19

19、7;0.03 0.15±0.02 0.16±0.05 模型组 4.5 0.16±0.03 0.17±0.02 0.21±0.07 中药组 4.5 0.21±0.03 0.21±0.02* 0.23±0.01 注：与正常组及模型组相比，*P <0.05。2.3 3组大鼠胃肠黏膜中AQP8的表达模型组肠黏膜AQP8表达上调，中药组胃及结肠粘膜AQP8表达俱上调，与正常组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。表3 3组大鼠胃肠黏膜中AQP8表达的平均光密度值的比较（，n=10） 组别 剂量mlkg1

20、 胃 小肠 结肠 正常组 - 0.15±0.01 0.16±0.01 0.16±0.01 模型组 4.5 0.19±0.04 0.21±0.04* 0.22±0.04* 中药组 4.5 0.22±0.06* 0.19±0.01 0.21±0.04* 注：与正常组相比，*P<0.05。图A-C 免疫组化示AQP3在小肠黏膜中的表达，SP法（P=9000）×100倍，A：正常组，B：模型组，C：中药组；图D-F为AQP3在结肠黏膜中的表达：D：正常组，E：模型组，F：中药组。图J-K为AQP8

21、 在小肠黏膜中的表达：J：正常组，K：模型组，L：中药组；图M-O为AQP8 在结肠黏膜中的表达：M：正常组，N：模型组，O：中药组；3 讨论AQPs是维持体内水代谢平衡的分子生物学基础,是水通过生物膜的主要方式,如果不同组织细胞膜上的AQPs表达超过或低于正常水平,都会影响水的分泌或吸收,出现局部的或全身的水平衡紊乱4。 在哺乳动物的神经系统中，AQP4主要在星形胶质细胞细胞膜及胞浆中高度表达5。AQP4 在脑内的分布特点及其对水跨膜转运的高度选择性，表明AQP4 在脑水肿的过程中发挥着重要作用6。AQP3在胃腺表面黏膜上皮细胞的基侧膜和小肠绒毛顶端微量表达；在末端结肠和直肠的吸收上皮细胞的

22、基侧膜上大量表达7,有研究表明AQP3在慢传输型便秘大鼠的升结肠黏膜中表达下调,对水吸收起调节作用8。AQP8分布于十二指肠、空肠、结肠的吸收上皮细胞的顶质膜7。腹泻状态下大鼠结肠黏膜AQP8 表达下调, 提示表达于细胞膜上的AQP8参与了结肠对肠腔内水分的重吸收, 其表达量的变化可能参与了肠道水代谢紊乱性疾病的病理生理过程9。逍遥丸能散肝气之郁，临床研究发现逍遥丸治疗抑郁症疗效好，不良反应少而轻，治疗依从性高，复发率低10。我们的前期研究发现逍遥丸能下调抑郁症模型大鼠海马神经元内突触素的表达11。肝郁脾虚证是抑郁症最常见的证型之一,胡随瑜等1研究调查发现肝郁脾虚证在其调查的1977例抑郁症患

23、者中占24.5%，居第二位。其基本病机为肝失疏泄，脾不健运，致水湿内生。当前肝郁脾虚证模型复制方法众多，主要有慢性束缚方法12、慢性束缚应激+过度疲劳+饮食失节的复合方法2-3、慢性夹尾激怒加高浓度大黄灌胃法造模13、塑料夹夹尾+ 隔日禁食+ 禁食14等。这些方法部分地体现了肝郁脾虚证的发病机制。本研究从病证结合方面着手，根据抑郁症的发病机理，采用慢性轻度不可预见性的应激复制抑郁症大鼠模型；同时也考虑了肝郁脾虚证的发病本质为肝脾不调，即情志失调，致肝失调达，木不疏土，或脾土本虚，肝气易郁；故加过度疲劳及饮食失节的方法复制抑郁症肝郁脾虚证模型。造模后，大鼠水平运动次数和垂直运动次数明显减少，造模

24、14天后，摄食量明显减少，体质量增加缓慢，糖水消耗量明显减少，糖水偏爱降低，且大便性状常表现为溏泄等改变等的症状，提示造模成功，同时逍遥丸组水平与垂直运动次数、摄食量、体质量及糖水消耗量明显较模型组增加，且大鼠大便性状无明显改变，提示逍遥丸有抗抑郁症及改善肝郁脾虚证的作用。 近来有不少AQPs与中医证型关系的研究，如梅武轩等15研究显示慢性胃炎中医证型不同, 胃黏膜AQP3、AQP4 基因表达不同，胃粘膜AQP3、AQP4可能成为脾虚湿困、寒湿困脾、脾胃湿热、胃阴不足等病证的发生机制之一；王良等16湿阻中焦证AQP9在胃贲门黏膜下组织表达增加，提示其可能是湿阻中焦证湿阻碍气机，脾胃散输水津失调

25、，津液不正常输布产生口干不欲饮的分子基础之一。但尚未见肝郁脾虚证与AQPs关系研究的报道。 本研究结果显示，与正常组相比，模型组大脑海马区AQP4下调，提示抑郁症的发生可能伴有大脑的水液代谢异常，但逍遥丸组表达与正常组无明显差别，提示逍遥丸已经调节了AQP4的表达；AQP3、8的表达与抑郁症出现胃肠功能紊乱有关，模型组胃结肠黏膜中AQP3在的表达无明显变化，而中药组小肠黏膜中AQP3表达上调；提示逍遥丸能促进抑郁模型大鼠的消化吸收功能，有“见肝之病，当先实脾”的功效；模型组小肠及结肠黏膜AQP8上调，但中药组胃、结肠粘膜中AQP8表达上调，提示逍遥丸已经开始通过调节AQP8的表达，从而调节了结肠对肠腔内水分的重吸收。本研究显示逍遥丸能从调节AQPs表达来治疗肝郁脾虚证，但调节机理有待更深入的研究。参考文献：1 胡随瑜,张宏耕,郑林,张海男,陈泽奇,陈昌华,赵志付,王新本,刘发荣,李顺民,黄信初,俸建林,张捷.1977例抑郁症患者中医不同证候构成比分析.中国医师杂志,2003, 5(10):1312-1314 2 宋炜熙,胡随瑜.慢性应激抑郁模型大鼠海马突触素及多巴胺转运体mRNA表达的初步研究.中华行为医学与脑科学,2009,18(7):586-588.3 李艳彦，谢鸣，陈禹，王洪海 肝郁脾虚证大鼠模型复制