五芝液抗肿瘤作用的药理研究

1、五芝液体内抗肿瘤作用与免疫调节作用20 世纪 70 年代，日本学者最先发现灵芝提取物和灵芝多糖体内给药对动物移植性肿瘤有显著的抑制作用，并提出灵芝的抗肿瘤作用是“宿主中介性的”，可能是通过增强机体的免疫功能而实现的。经一系列研究证明：灵芝提取物及其所含多糖肽灌胃可抑制小鼠移植性肿瘤S18。人肺癌（PG、Lewis肺癌的生长， 但直接加到体外培养的 S180 或人白血病细胞的培养液中，对肿瘤细胞生长无抑制作用。提示灵芝制剂在体内抑制肿瘤生长的作用确实是 “宿主中介性的”增强机体的抗肿瘤免疫力可能是其中重要的一环。随后的研究证明，灵芝多糖肽可直接作用于单核巨噬细胞、树突状细胞和细胞毒T- 细胞，增

2、强其功能。促进 TNF-a mRNA口 IFN- 丫 mRN俵达，增力口 TNF-a 和 IFN-丫生成，也促进IL-1和IL-6等细胞因子生成， 增强细胞因子的活性，从而抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，最终杀死肿瘤细胞。在小鼠骨髓来源的树突状细胞（ DC） 体外培养体系中，加入灵芝多糖 Gl-PS （0.8、3.2或12.8 g/ml ）可明显促进DC表面DC11汲I-A/I-E 分子的共表达、明显 增加IL-12 40亚基mRNA口蛋白表达、促进DC诱导的 混合淋巴反应（MLC ,表明灵芝多糖能促进 DC的成 熟、分化和功能。在经P815肿瘤细胞裂解物冲击致敏 小鼠骨髓来源的DC导产生

3、的特异性细胞毒T淋巴细 胞（ CTL） 模型，在冲击致敏阶段与不同浓度的灵芝多糖（Gl-PS）共培养，收集CTL及细胞培养上清液，以 释放入CTL与P815肿瘤细胞共培养体系细胞培养上清 液中的乳酸脱氢酶（ LDH） 活性代表 CTL 的特异性杀伤活性；同时用RT-PCFfe检测CTL中IFN- 丫及颗粒幅B 的mRNA1达；用ELISA法检测细胞培养上清液中IFN- 丫蛋白含量；用Western Blot法检测CTL表达的颗粒 酶 B 的蛋白含量。结果显示：当DC经P815肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏 后,其诱导产生的CTLXt P815肿瘤细胞具有杀伤作用， 灵芝多糖(Gl-PS) (0.8、

4、3.2 或 12.8 g/ml )可增 强此作用，使释放入培养上清液中的 LDH活性显著增 强。进一步研究发现，同上浓度的灵芝多糖可明显增加DC诱导CTL的IFN- 丫蛋白含量增加。上述浓度的灵芝多糖还可明显增加DC诱导的CTL的颗粒酶BmRNA 及蛋白表达。这些结果提示，灵芝多糖在DC成熟阶段， 增强DC对肿瘤抗原的捕获、处理、递呈能力，增强 DC诱导的牛异性CTL的细胞毒活性。而灵芝多糖促进 活化CTL的IFN- 丫 mRNA专录及蛋白表达，使IFN- 丫 生成增加， 后者通过其直接和间接作用发挥抑瘤作用。颗粒酶参与促进CTL及N心田胞介导的细胞凋亡。颗粒酶家族中，以颗粒酶B 功能最强。灵

5、芝多糖促进CTL的颗粒酶B mRNA蛋白质表达，与其增强CTL的细胞 毒活性有关。二、五芝液中灵芝多糖增强细胞因子诱导的杀伤细胞活性继应用淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK细胞）于肿瘤 的过继免疫治疗之后，将人外周血淋巴细胞在体外与多种细胞因子共培养后，获得一群异质细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）,具有增值力强、杀瘤活性 高、 杀瘤谱广、 对多重耐药肿瘤细胞同样敏感等特点，且明显优于LAK细胞，比LAK细胞更适合于肿瘤的过 继免疫治疗。是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。有研究者按常规方法制备小鼠的 CIK细胞小 鼠脾细胞培养中加入IFN- 丫（1000kU/L）、抗CD即 抗（50m

6、g/L）、IL-2 （300Ku/L）和 IL-1（100Ku/L）, 当培养中加入灵芝多糖 （Gl-PS） （100和400 w g/ml ） 后，可明显降低CIK细胞培养中的白介素-2 （IL-2） 和抗CD弹抗的用量（分别为未加灵芝多糖的对照组 的 75%和 50%） 。 但与对照组相似， 能诱导和大量扩增CIK细胞，且此CIK细胞在体外杀伤 YAC-1和P815肿 瘤细胞的杀伤率亦与常规对照组无明显差异。同样将此CIK细胞静脉输注给荷S180或荷H22肝肉瘤小鼠 后，其体内抗肿瘤疗效与常规 CIK细胞治疗组比较亦无差异。研究者还发现，灵芝多糖在降低抗 CD”抗 和IL-2用量50%口

7、75%勺条件下，能促进CIK细胞颗 粒幅B以及穿孔素mRN刖蛋白的表达。这表明灵芝多 糖通过增加颗粒酶B 和穿孔素的表达，从而增强 CIK细胞杀伤肿瘤细胞的活性。研究者的试验还证明，淋巴细胞表面的补体3型(CR3受体介与灵芝多糖对 CIK细胞的作用。关于免疫细胞上灵芝多糖作用的受体还有一些研究。Chen 等研究发现， 灵芝多糖 ( F3) 结合巨噬细胞膜上TLR受体后，通过蛋白酪氨酸激幅PTK/PLCr 1/蛋白激 幅C (PKC /丝裂原激活的蛋白激幅1(MEK1)/胞外信 号调节激酶(ERK)， PTK(Sac)/Rac1/PAK/p38 和PIK/Rac1/PAK/JNK 信号转导途径，

8、 诱导细胞因子IL-1产生。具有(1-6) - B -D-葡聚糖分支结构的灵芝多糖 PSG 10 w g/ml )能够促进人单核细胞来源的树突状细胞 (D。 表达CD80 CD86 CD83 CD40 CD54人白细胞抗原（HLA -DR,以及IL-12、IL-10 蛋白及其 mRNA抑制DC的内吞活性；止匕外，经PS-G作用后的DC细胞刺激T细胞的活性增强，促进T细胞分泌IFN-丫、IL-10。 抗TLR4抗体中和实验表明，抗TLR4抗体可抑制PS-G 诱导的IL-12、IL-10的分泌，提示PS-G作用于DC 的信号通路中，TLR4发挥了关键作用。一项研究表明，荧光胺标记的黄芪多糖（ fl

9、-APS ）以TLR4依赖方式结合人和小鼠的巨噬细胞，流式细胞仪 检测显示分子量为5.849X105的灵芝多糖（Gl-PS）可 竞争性地抑制 fl-APS 和小鼠腹腔巨噬细胞的结合， 提 示Gl-PS能够结合巨噬细胞膜表面的TLR4受体。进一 步研究证明，GL-PS诱导Bal b/c小鼠腹腔巨噬细胞 产生IL-1 B，但不能刺激C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬细胞 分泌IL-1 B ,而IFN- 丫仍可刺激IL-1 B的分泌；由 于C3H/HeJ小鼠的TLR4基因有一个碱基突变导致TLR4受体胞浆区一个氨基酸由脯氨酸突变导致TLR4受体胞浆区一个氨基酸由脯氨酸突变成组氨酸，使TLR4丧失信号转导功能

10、。因此提示 GL-PS可能通过TLR4激活巨噬细胞。另外，发现兔抗小鼠Ig抗体明显抑制 Gl-PS 诱导的小鼠脾细胞增殖（ Gl-PS 可显著促进纯化的小鼠 B 细胞而非 T 细胞增殖），而对照正常兔 IgG 则无此作用。抗小鼠 Ig 抗体浓度即使达到30|ig/ml,对ConA诱导的脾细胞增殖没有显著影响，结果说明小鼠 B 细胞膜表面Ig 分子参与 Gl-PS 对 B细胞的活化过程，为B细胞表面Gl-PS受体分子之一。比较Bal b/c和C3H/HeJ小鼠脾细胞对Gl-PS的反应 性，发现与LPS类似，Gl-PS可明显刺激Bal b/c小 鼠脾细胞增殖，但对C3H/HeJ小鼠脾细胞无刺激作用

11、，表明TLR4参与Gl-PS对小鼠B细胞的活化过程，介导 Gl-PS促进B细胞的增殖作用。这些结果说明TLR4是 B 细胞和巨噬细胞表面重要的 Gl-PS 受体分子。三、五芝液中灵芝成分抑制体外培养的肿瘤细胞增殖 及其机制 近十余年发现灵芝及其有效成分对体外培养的肿瘤细胞具有抑制作用。如发现灵芝（赤芝、紫芝、松杉灵芝）子实体提取物抑制体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7 MDA-MB-231 曾殖；灵芝提取物 GLE-1 （主要含多糖）和GLE-2 （主要含三菇类）抑制人结肠癌细胞SW480曾殖，且后者的作用强于前者。从灵芝子实体中提取的三种羊毛甾烷型三萜lucialdehydeA-C ）其中 l

12、ucialdehydeB 和 C对 Lewis 肺肉瘤（LLC）、T47D S180和Meth-A肿瘤细胞株具 有细胞毒作用。 lucialdehydeC 对试验细胞株的细胞毒性最强，对LLG T470 S180和Meth-A这4种肿瘤 细胞的 ED0为 10.7、4.7、7.1 和 3.8 g/ml o一项研究是观察富含三萜组分的灵芝提取物对 26 种人癌细胞株的抗增殖活性，结果发现6 种造血细胞株最敏感，其 ED。（ w g/ml ）分别为：HL-60 （26）、U937 （ 63）、K562（ 50）、Blin-1 （ 38）、 Nalm-6（ 30）和RPMI8226（40）。细胞周期

13、分析显示肿瘤细胞生长停止在G2期或M期，以HL-60细胞最为明显。其中4种造血细胞株（HL-60、Blin-1、U937和 RPMI8226可见 21%-92%的细胞凋亡。在灵芝提取物作用下，HL-60细胞变成多核细胞，且其 DN给量增加。结果指出， 富含三萜组分的灵芝提取物对白血病、 淋巴癌、多发性骨髓瘤有明显抑制作用。灵芝抱子粉的乙醇提取物I和m显著抑制Hela细胞生长。提取物田能阻断细胞周期从 G期S期的转变，并使细胞内钙水平显著降低。提示提取物可能通过影响细胞周期和细胞内钙信号转导而抑制肿瘤细胞生长。从灵芝菌丝中制备的富含三菇组分 WEES-G6E体外可抑制人肉瘤Huh-7细胞生长。用

14、 WEES-G处理细胞可是细胞生长调节蛋白PKC的活性降低，并抑制p38MAp激酶的活化，并因此延长细胞周期的 G期，抑制肝肉瘤细胞生长。灵芝乙醇提取物可剂量和时间依赖性地抑制MCF-7肿瘤细胞增殖， 这可能与其上调 p21/Waf1 和下调 cyclin D1 有关。此外，它还可通过上调前凋亡蛋白Bax 诱导MCF-7细胞凋亡。从鹿角灵芝提取的一种四环三萜Ganoderiol F（ GolF）可诱导高度增殖的肿瘤细胞株老化，使HepG2、 Huh7和K562肿瘤细胞生长停止，但对肝肉瘤Hep3B和正常 成纤维细胞MRC5Z具非常弱的作用，而对末梢血单核 细胞无作用。除Hep3B外，用GolF

15、处理体外培养的癌 细胞，导致DN始成迅速抑制，细胞周期停止进行， 然而， 在与药物作用 24 小时后， 洗去培养液中的药物，HepG2ffl胞生长仍可恢复。用 30 mol/L GolF连续处 理HepG2ffl%18天之后，可见超过50%勺细胞变大、 变平，老化细胞呈现B-半乳糖昔幅阳性。GolF在体 外可抑制拓扑异构幅，这可能与其抑制细胞DN*成有关。 在 GolF 处理的早期， 可见丝裂原活化的蛋白激幅EKR舌化以及上调周期素（cyclin ）依赖的蛋白激幅抑制因子p16,推测这与引起细胞周期停滞以及触 发HepG2ffl胞早老有关。GolF引起肿瘤细胞生长停滞 和老化提示它有潜在的抗肿

16、瘤作用。鹿角灵芝的甲醇提取物抑制人肝肉瘤 HuH-7细胞、结 肠肉瘤HCT-116细胞、Burkitt ' s淋巴瘤Raji细胞 和人急性白血病细胞( HL-60) 的生长， 半数抑制浓度(IC50)为82.2-135.3 wg/ml。一些成分在体外还能 抑制拓扑异构酶I和口 a的活性。其中最强的是羊毛 密烷三菇类的灵芝酸 X (GAX 3 a-hydroxy-15 a -acetoxy-lanosta-7 ， 9( 11)， 24-trien-26-oic acid) , GAX寸 HuH-K HCT-116 Raji、HL-60 细胞 的 IC50分别为 20.3 ii g/ml、

17、38.3 g/ml、39.2 g/ml 和26.5 l g/ml o用GA炮理人用f肉瘤HuH-7细胞立即 引起DN蛤成抑制，也抑制ERKF口 JNK丝裂原-活化蛋 白激酶的活化， 并诱导细胞凋亡。 初步实验结果提示，GAXI§导肿瘤细胞凋亡的分子机制与其促使染色体 DNAt裂、降低Bcl-xL水平、使线粒体膜破裂、促使细胞质中细胞色素C释放和caspase-3活化有关。该作者认为，GAX卬制拓扑异构幅及使敏感细胞凋亡与 其抗肿瘤作用有关。最近发现， 灵芝三萜提取物（ GLT） 抑制体外培养的人结肠癌细胞HT-29增殖，并抑制裸鼠移植性结肠肿瘤的生长。GLT的这些作用与细胞周期的 G

18、/Gi期相阻滞及诱导结肠癌细胞n型自吞噬（autophagy）程序死亡有关。研究者发现，GLT诱导结肠癌细胞中出现自吞噬空泡，并上调 Beclin-1 表达（增加 1.3 倍）以及LC-3 蛋白表达（增加 7.3 倍），移植性结肠肿瘤模型裸鼠Beclin-1增加3.9倍，LC-3增加1.9倍。自吞噬是由p38丝裂原活化蛋白激幅（p38MApK被抑制而产生，p38MAp柳制剂SB20219CM引起癌细胞自吞噬，并使 Beclin-1 和 LC-3 表达分别增加 1.2 倍和 7.4 倍。GLTW制结肠癌细胞P38MAPKI酸化可达60%通过用流式细胞仪测量细胞活力、细胞周期。用 DNA断裂定量检测细胞凋亡， 用 Western-blot 法检测细胞内凋亡蛋白和激酶的变化，研究灵芝子实体提取物和甲醇提取物经柱层析半纯化的组分诱导 NB4人白血病细胞的毒性及凋亡作用。结果可见，灵芝子实体提取物稍微降低