【北大课件】3原核生物DNA的复制[1]

1、原核生物原核生物DNA的复制的复制In 1963, John Cairns Technique: Grew E. coli in 3H thymidine Waited till cells were in the middle of replication Lysed the cells very very gently Spread the lysate on an EM grid Exposed the grid to X-ray film for TWO months.Replication of the E. coli chromosomeWhat Cairns experiment

2、 (1963) showed: E. coli has a circular chromosome. E. coli has a single origin of replication. In E. coli, replication and unwinding are simultaneous.What Cairns did not show: Is replication UNIdirectional or BIdirectional?Bidirectional Replication(双向复制双向复制) 无论是原核生物还是真核生物，无论是原核生物还是真核生物，DNA的的复制复制主要是主

3、要是从固定的起始点以从固定的起始点以双向等速双向等速复复制方式进行的制方式进行的。 复制叉以复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。点，向两个方向等速生长前进。 Bidirectional Replication (双向复制双向复制)起始点起始点复制叉复制叉复制叉复制叉DNA Synthesis 由于由于DNA双螺旋的两条链双螺旋的两条链是反向平行的，因此两个是反向平行的，因此两个模板极性不同。模板极性不同。 所有已知所有已知DNA聚合酶的合聚合酶的合成方向都是成方向都是53，为了解释为了解释DNA的等速复的等速复制 现 象制 现 象 , 日 本

4、学 者 冈 崎日 本 学 者 冈 崎(Okazaki)等提出了等提出了DNA的的半不连续复制模型半不连续复制模型(semi-discontinuous replication) .半不连续复制半不连续复制 Semi-discontinuous replication 冈崎片段冈崎片段Okazaki fragmentLeading strandLagging strandReplication fork前导链的连续复制前导链的连续复制和和滞后链的不连续复制滞后链的不连续复制在生物界是有在生物界是有普遍性的，因而称之为普遍性的，因而称之为DNA的半不连续复制的半不连续复制。1、用、用3H脱氧胸苷短

5、时间标记后提取脱氧胸苷短时间标记后提取DNA， 得到不少平均长度为得到不少平均长度为2-3kb DNA片段片段。2、用、用DNA连接酶温度敏感突变株进行实验，在连接酶温度敏感突变株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，有大量小片段累积，连接酶不起作用的温度下，有大量小片段累积，说明复制过程中至少有一条链首先合成较短的片说明复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再生成大分子段，然后再生成大分子DNA。3H Thymidine pulse-chase labeling and alkaline sucrose gradient: discovery of semi-discontinous

6、replicationDNA的半不连续复制的半不连续复制（semi-discontinuous replication）The short discontinuous segments are called Okazaki Fragments. In bacteria they are approximately 1000 nt in length; in eukaryotes they are approximately 200 nt in length. 亲代亲代DNA分子为模板分子为模板 四种脱氧三磷酸核苷四种脱氧三磷酸核苷(dNTP)为底物为底物 提供提供3-OH末端的引物末端的引物

7、多种酶及蛋白质多种酶及蛋白质 DNA拓扑异构酶、拓扑异构酶、DNA解链酶、单链结合解链酶、单链结合蛋白、引物酶、蛋白、引物酶、 DNA聚合酶、聚合酶、RNA酶以及酶以及DNA连接酶等连接酶等DNA 复制的体系复制的体系DNA复制的基本过程复制的基本过程 复制的起始复制的起始 (initiation) DNA链的延伸链的延伸 (elongation) 复制的终止复制的终止 (termination)1. DNA复制的起始复制的起始 复制起始原点复制起始原点 DNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋 复制的引发复制的引发 大肠杆菌大肠杆菌(E. coli)的的 OriC 复制原复制原点点大肠杆菌基因组的复制

8、原点位于天冬酰胺合大肠杆菌基因组的复制原点位于天冬酰胺合酶和酶和ATP合酶操纵子之间，全长合酶操纵子之间，全长245 bp, 称为称为oriC。参与参与DNA复制起始和引发的蛋白质复制起始和引发的蛋白质 DNA解旋酶解旋酶(DNA helicase) 催化催化DNA双链的解链过程。双链的解链过程。 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single strand DNA binding protein)： 以四聚体形式存在于复制叉处，只保持单链的存在，以四聚体形式存在于复制叉处，只保持单链的存在，并不能起解链作用。并不能起解链作用。 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase)

9、消除消除DNA双链的超螺旋堆积。双链的超螺旋堆积。 引物酶引物酶(primase) 合成一小段合成一小段RNA引物，为引物，为DNA新链的合成提供新链的合成提供3-OH末端。末端。DNA helicases separate the two strands of the double helixDNADNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋Binding of SSB to DNA inhibits the formation of intramolecular base pairsDNADNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋Action of topoisomerase at the replication

10、forkTopoisomerase rapidly remove the positive supercoils accumulate in front of the replication fork.DNA聚合酶只能延长已存在的聚合酶只能延长已存在的DNA链，而不能从头合成链，而不能从头合成DNA链，链，那么，新那么，新DNA的复制是怎样开始的的复制是怎样开始的呢？呢？ DNA polymerase requires a 3-OH end to initiate replicationThe 3OH end is called a primer.A primer is a short seq

11、uence (often of RNA) that is paired with one strand of DNA and provides a free 3 -OH end at which a DNA polymerase starts synthesis of a deoxyribonucleotide chain.The primase is a type of RNA polymerase that synthesizes short segments of RNA that will be used as primers for DNA replication.Substrate

12、s required for DNA synthesis由大肠杆菌由大肠杆菌oriC复制起始点复制起始点处引发的处引发的DNA复制过程复制过程大约大约20个个DnaA蛋白在蛋白在ATP的作用下的作用下与与oriC处的处的4个个9 bp保守序列相结合。保守序列相结合。在在Hu蛋白和蛋白和ATP的共同作用下，的共同作用下， DnaA复制起始复合物使复制起始复合物使3x13 bp直接直接重复序列变形，形成开链。重复序列变形，形成开链。DnaB（解链酶）六体分别与单链（解链酶）六体分别与单链DNA相结合（需要相结合（需要DnaC的帮助）进的帮助）进一步解开一步解开DNA双链。双链。与引物结合，起始与引

13、物结合，起始DNA复制。复制。DNA链的延伸需要的蛋白质链的延伸需要的蛋白质: DNA聚合酶聚合酶 滑动夹（滑动夹（Sliding DNA clamp） RNA酶酶(RNase H 等等) 在复制完成后切除在复制完成后切除RNA引物。引物。 DNA连接酶连接酶 (DNA ligase) 通过生成通过生成35-磷酸二酯键连接两条磷酸二酯键连接两条DNA链。链。2. DNA链的延伸链的延伸DNA polymerase use a single active site to catalyze DNA synthesisDNA polymerase bound to a primer:template

14、 junctionpalmProcessivity (持续合成能力持续合成能力) Processivity is a characteristic of enzymes that operate on polymeric substrates. For DNA polymerase, the degree of processivity is defined as the average number of nucleotides added each time the enzyme binds a primer:template junction (a few50,000). Structu

15、re of a sliding DNA clampSliding DNA clamps encircle the newly replicated DNA produced by an associated DNA polymerase.Sliding clamps dramatically increase DNA polymerase processivity (持续合成能力持续合成能力)The composition of the DNA Pol III holoenzyme Three enzymes: Two copies of the DNA Pol III core enzyme

16、 One copy of the -complexThe “trombone” model for coordinating replication by two DNA polymerase at the E. coli replication forkSteps in the synthesis of the lagging strandRemoval of RNA primers from newly synthesized DNARNAse H removes all of the RNA primer except the ribonucleotide directly linked

17、 to the DNA end.An exonuclease removes the final ribonucleotide.DNA polymerase fills the gap, leaving a a break in the backbone between the 3OH and 5 phosphate of the repaired strand.DNA ligase repaires this “nick”.当复制叉前移，遇到当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列重复性终止子序列( (Ter) )时，时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续复合物能阻挡复制叉的继续前移，

18、等到相反方向的复制叉到达后在前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓拓扑异构酶扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。 ter3. 复制的终止复制的终止原核生物原核生物DNA的复制特点的复制特点OriginTerminusDaughter DNA structure 细菌染色体的复制是作为一个单位从唯一细菌染色体的复制是作为一个单位从唯一的复制起点开始，双向进行的。的复制起点开始，双向进行的。DNA聚合酶聚合酶 大肠杆菌中主要有大肠杆菌中主要有DNA聚合酶聚合酶I、II、III 、IV和和V。Arthur KornbergDiscovered an e

19、nzyme in E. coli that could catalyse the synthesis of DNA He called it DNA Polymerase Now known as DNA polymerase I 1959 - Nobel prize in Physiology or MedicineDNA聚合酶聚合酶I (coded by polA)不是复制大肠杆菌染色体不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，它有的主要聚合酶，它有 3 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性,保证了保证了DNA复制的准确性复制的准确性。DNA Polymerase I它的它的5 3核酸外切酶活性也可用

20、来除去冈崎片段核酸外切酶活性也可用来除去冈崎片段5端端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段保证连接酶将片段连接起来连接起来。DNA聚合酶聚合酶II (coded by polB)的活性很的活性很低，只有低，只有DNA聚合酶聚合酶I的的5%，所以也不，所以也不是复制中主要的酶。是复制中主要的酶。生理功能主要是生理功能主要是起修复起修复DNA的作用的作用。DNA Polymerase II DNA聚合酶聚合酶III (coded by polC)包含有包含有7种种不同的亚单位和不同的亚单位和9个个亚基，其生物活性形亚基，其生物活性形式为式为二聚体二聚体。C

21、ore enzyme & holoenzymeCore enzyme & holoenzymeDNA Polymerase III 它的它的聚合活性较强聚合活性较强，为，为DNA聚合酶聚合酶I的的15倍，聚合酶倍，聚合酶II的的300倍。倍。 它能在引物的它能在引物的3OH上以每分钟约上以每分钟约5万个万个核苷酸的速率延长新生的核苷酸的速率延长新生的DNA链，是大肠杆链，是大肠杆菌菌DNA复制中链延长反应的复制中链延长反应的主导聚合酶主导聚合酶。DNA Polymerase IIIThe holoenzyme consists of:The core enzyme ,The s

22、liding clamp - The clamp loader complex A processivity switch - DNA聚合酶聚合酶I(DNA损伤的修复）损伤的修复）DNA聚合酶聚合酶I、II、III(a proofreading activity)DNA聚合酶聚合酶III DNA聚合酶聚合酶IV和和V分别由分别由dinB和和umuD2C基因编码，基因编码， 主要在主要在SOS修复过程修复过程中发挥功能。中发挥功能。DNA Polymerase IV& V1 1、都以、都以dNTP为底物为底物。2、都需要、都需要Mg2+激活激活。3、聚合时必须有、聚合时必须有模板链模板链

23、和具有和具有 3-OH末端的末端的引物链引物链。4、链的延伸都方向为、链的延伸都方向为53。DNA聚合酶的共同点：聚合酶的共同点：真核生物真核生物DNA的复制的复制真核生物真核生物DNA的复制特点的复制特点 有有多处复制起始点多处复制起始点； 在全部完成复制之前，各个起始点上在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始；的复制不能再开始； DNA复制复制只在只在S期进行期进行。 复制子相对较小复制子相对较小，为，为40-100千碱基对。千碱基对。真核生物真核生物DNA的的复制子复制子被称为被称为ARS (autonomously replicating sequences)，长约长约

24、150bp左右，包括数个复制起始必左右，包括数个复制起始必需的保守区。需的保守区。真核生物真核生物DNA复制的起始需要复制的起始需要起始点识别复合物起始点识别复合物（origin recognition complex，ORC）参与，）参与，ORC结合于结合于ARS，它是由，它是由6种蛋白质组成的启动复合物。种蛋白质组成的启动复合物。 真核生物真核生物DNA复制叉的移动速度大复制叉的移动速度大约只有约只有50bp/秒。秒。 因此，人类因此，人类DNA中每隔中每隔30,000-300,000bp就有一个复制起始位点。就有一个复制起始位点。已发现的真核生物已发现的真核生物DNA聚合酶有聚合酶有15

25、种以上。种以上。在哺乳动物细胞中主要有在哺乳动物细胞中主要有5种种DNA聚合酶聚合酶，分别称为，分别称为DNA聚合聚合酶酶、和和 。真核生物真核生物DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较性质性质DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶亚基数亚基数4122-31在细胞内在细胞内分布分布核内核内核内核内线粒体线粒体核内核内核内核内(?)功能功能DNA引物合引物合成成损伤修损伤修复复线粒体线粒体DNA复制复制主要主要DNA复复制酶制酶DNA复复制制(?)35外外切切无无无无有有有有有有53外外切切无无无无无无无无无无 DNA聚合酶聚合酶主要参与主要参

26、与引物合成引物合成。DNA聚合酶聚合酶活性水平稳定，主要在活性水平稳定，主要在DNA损损伤的修复伤的修复中起作用。中起作用。DNA聚合酶聚合酶主要负责主要负责DNA的复制。的复制。DNA聚合酶聚合酶与后随链合成有关，在与后随链合成有关，在DNA合合成过程中核苷切除以及碱基的切除修复中成过程中核苷切除以及碱基的切除修复中起着重要的作用。起着重要的作用。DNA聚合酶聚合酶 在线粒体在线粒体DNA的复制中发挥的复制中发挥作用。作用。 真核生物中还存在真核生物中还存在 、 、 和和 等等几种几种DNA聚合酶，它们承担着聚合酶，它们承担着修修复损伤复损伤的功能，但这些修复酶的的功能，但这些修复酶的忠实性

27、都很低。忠实性都很低。 Key Concepts A replication fork has 1 complex of DNA polymerase /primase and 2 complexes of DNA polymerase and/or . The DNA polymerase /primase complex initiates the synthesis of both DNA strands. DNA polymerase elongates the leading strand and a second DNA polymerase or DNA polymerase e

28、longates the lagging strand.复制的几种主要方式复制的几种主要方式 环状环状DNA双链的复制双链的复制 (1)型型 (2) 滚环型滚环型(rolling circle) (3) D-环型环型(D-loop)大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒DNADNA双向复制双向复制的模式与实验验证。的模式与实验验证。左：左：形复制模式图；右：形复制模式图；右：3 3H H标记质粒标记质粒DNADNA合成图。合成图。环状环状DNA双链的复制双链的复制- 型型环状环状DNADNA可以通过可以通过滚环式滚环式复制复制产生多单元单链产生多单元单链DNADNA双链环状双链环状DNA复制起始于某复制起始

29、于某一条一条DNA链上链上新生新生DNA链延伸，链延伸，不断取代母链不断取代母链复制一圈，产生复制一圈，产生单位长度的线性单位长度的线性DNA链链若复制继续进行，若复制继续进行，可产生多单元线可产生多单元线性性DNA链链单向复制单向复制的特殊方式X174的双链DNA复制型(RF)滚环式复制滚环式复制首先在动物首先在动物线粒体线粒体中被发现。中被发现。一条短一条短RNA与一条与一条DNA互补，取互补，取代了该区域原来的互补的代了该区域原来的互补的DNA链，链，使得两条链的合成高度不对称，使得两条链的合成高度不对称，一条链上迅速合成出互补链，另一条链上迅速合成出互补链，另一条链则为游离的单环。一条

30、链则为游离的单环。D loops单向复制单向复制的特殊方式的特殊方式DNA修复修复(DNA Repair) Mutation Replication Fidelity(复制的精确性复制的精确性)MutagensMutagenesis(诱变诱变)（突变）（突变）( (诱变剂诱变剂) )MutationMutation: Permanent, heritable alterations in the base sequence of DNA.The substitution mutation(替换突变替换突变) Transition(转换转换): Purine or pyrimidine is r

31、eplaced by the other.Transversion(颠换颠换): a purine is replaced by a pyrimidine or vice verse.无义突变错义突变 沉默突变Deletion or Insertion（缺失或插入）（缺失或插入）The elimination or addition of one or more nucleotides in a DNA region. It may cause frameshift(移码突变移码突变) producing a non-functional protein. Real examples of d

32、eletion mutations which cause diseases In CFTR geneIn CFTR geneIn FIX geneIn APC gene囊性纤维跨膜电导调节因子凝血因子IX9号结肠腺癌性息肉Serious Consequences of Insertion MutationReplication fidelity(复制的精确性复制的精确性)Mutation relevant Spontaneous errors in DNA replication is very rare, one error per 1010 base in E. coli, which

33、is much less than the error that DNA polymerase III introduced. Important for preserve the genetic information from one generation to the nextThis increased accuracy in vivo is largely due to the proofreading function of E. coli DNA polymerasesProofreading refers to any mechanism for correcting erro

34、rs in protein or nucleic acid synthesis that involves scrutiny of individual units after they have been added to the chain.Experimental demonstration of the proofreading function of E. coli DNA polymerase I. Proofreading function of E. coli DNA polymerases See A. Kornberg and T. A. Baker, 1992, DNA

35、Replication, 2d ed., W. H. Freeman and Company.Proofreading function of E. coli DNA polymerases When an incorrect base is incorporated during DNA synthesis, the polymerase pauses, then transfers the 3 end of the growing chain to the exonuclease site where the mispaired base is removed. Then the 3 en

36、d flips back into the polymerase site, where this region is copied correctly. Proofreading play a critical role in maintaining sequence fidelity during replication E. coli DNA polymerase I (3 5 exonuclease activity ) and DNA polymerase III ( subunit of the core polymerase ) have proofreading activit

37、y. In animal cells, both of the and DNA polymerases, but not the polymerase, have proofreading activity. 由于染色体由于染色体DNA在生命过程中占有在生命过程中占有至高无上的地位，至高无上的地位，DNA复制的准确性复制的准确性以及以及DNA日常保养中的损伤修复就有日常保养中的损伤修复就有着特别重要的意义。着特别重要的意义。 DNA的修复的修复(DNA Repair)大肠杆菌中大肠杆菌中DNADNA的修复系统的修复系统DNADNA修复系统修复系统功功 能能错配修复错配修复(mismatch r

38、epair)修复错配修复错配切除修复切除修复( (碱基、核苷酸切除修复碱基、核苷酸切除修复) )（Base-excision repair）(nucleotide-excision repair)切除突变的碱基和核苷酸片段切除突变的碱基和核苷酸片段重组修复重组修复(recombinant repair) 复制后的修复，重新启动停滞的复制后的修复，重新启动停滞的复制叉复制叉DNADNA直接修复直接修复(direct repair)修复嘧啶二体或甲基化修复嘧啶二体或甲基化DNADNASOSSOS系统系统(细胞细胞DNA受到损伤或复制系统受到损伤或复制系统受到抑制时，细胞为求生存而受到抑制时，细胞为

39、求生存而产生的一种应急措施产生的一种应急措施)诱导诱导DNA损伤修复、诱变效应、损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等释放噬菌体等，导致变异，导致变异DNA的转座的转座(DNA Transposition) DNA的的转座转座，或称，或称移位移位(transposition)，是由可移位因子是由可移位因子（transposable element）介导的介导的遗传物质重排遗传物质重排现象。现象。A transposon (transposable element) is a DNA sequence able to insert itself

40、(or a copy of itself) at a new location in the genome, without having any sequence relationship with the target locus.转座子的发现转座子的发现 1951年，通过对玉米籽粒色斑不稳定遗传现象，年，通过对玉米籽粒色斑不稳定遗传现象，B.McClintock(美美)首次提出转座子的概念。首次提出转座子的概念。Ds-Ac系统系统(Dissociation-Activation System )： 抑制因子（抑制因子（inhibitor, I)，后改称为解离因子，后改称为解离因子 (di

41、ssociator, Ds)。 激活因子激活因子(activator, Ac), 能够控制能够控制Ds因子。因子。转座子的分类和结构特征转座子的分类和结构特征转座子（转座子（transposon，Tn）是存在于染色体是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。上可自主复制和位移的基本单位。包括以下三类：包括以下三类：1.插入序列（插入序列（insertional sequence，IS）2. 复合式转座子（复合式转座子（composite transposon）3. TnA家族家族插入序列（插入序列（insertional sequence, IS） 1. 最简单的转座子最简单的转座子,

42、不含有任何宿主基因。不含有任何宿主基因。 2. 是很小的是很小的DNA片段片段(约约1kb)，末端具有倒末端具有倒 置重复序列。置重复序列。 3. 转座时常复制宿主靶位点转座时常复制宿主靶位点415bp的的DNA形成正向重复区。形成正向重复区。 4. 大部分大部分IS序列只有一个开放读码框。序列只有一个开放读码框。 5. 是细菌染色体或质粒是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。的正常组成部分。1.是一类带有某些抗药性基因是一类带有某些抗药性基因(或其他宿主基因或其他宿主基因)的转座子的转座子复合式转座子（复合式转座子（composite transposon）2. 两翼往往是两个相同或高度同

43、源的两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。序列。3. IS序列就不能再单独移动，只能作为复合体移动。序列就不能再单独移动，只能作为复合体移动。1.1.没有没有IS序列的、体积庞大序列的、体积庞大( (5 000bp以上以上) )的转座子。的转座子。TnA家族家族2. 常带有常带有3个基因，一个编码个基因，一个编码-内酰胺酶内酰胺酶(AmpR)，另两另两个则是转座作用所必须的。个则是转座作用所必须的。3. 所有所有TnA类转座子两翼都带有类转座子两翼都带有38bp的倒置重复序列。的倒置重复序列。转座作用的机制转座作用的机制转座发生时，受体分子中有一段很短转座发生时，受体分子中有一段很短的（的（

44、312bp）、）、被称为被称为靶序列靶序列的的DNA会会被复制被复制，使插入的转座子位于两个重，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。复的靶序列之间。1. 复制性转座复制性转座2. 非复制性转座非复制性转座 复制性转座复制性转座(Replicative Transposition)A.整个转座子被复制，所移动的仅仅是原转座子的拷贝。整个转座子被复制，所移动的仅仅是原转座子的拷贝。B.转座酶转座酶(transposase)和解离酶和解离酶(resolvase)分别作用于原分别作用于原始及复制转座子。始及复制转座子。C. TnA类主要是这种形式类主要是这种形式A.原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位非复制性转座非复制性转座(Nonreplicative Transposition)B. IS序列、序列、Mu及及Tn5等都以这种方式进行转座等都以这种方式进行转座转座作用的遗传