菌株分离鉴定、药敏实验及PCR扩增实验过程(共9页)

1、精选优质文档-倾情为你奉上目录 专心-专注-专业2.1菌株的分离纯化2.1.1菌株的分离2.1.1.1实验的准备1.分离管的准备：本实验需要100个50ml离心管（1）用过的离心管，将盖子拧开，加入清洁剂，沸水浴10min，毛刷清洁；（2）没入加入清洁剂的水中，灌满水，不要留有大气泡；（3）放入超声清洁机中超声清洁45min，25,100Hz；（4）倒出管中水，灌满去离子水，再超声20min，25，100 Hz；（5）倒出管中水，重复（4）一次；（6）倒出管中水，放入60烘箱中烘干；（7）待烘干后装入保鲜袋中，扎孔通气，再用报纸或牛皮纸包好，放入高压锅中高压灭菌，121，20min；（8）高压

2、后取出放入烘箱中，烘干后待用。2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所选试剂的规格进行配制，再送入高压锅中高压灭菌，高压后放入烘箱中烘干待用。注意瓶装液体高压前一定要盖子拧松。3.试管的准备：本实验需要100根试管（1）塞子拔出，与试管一起放入清洁剂水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清洁；（2）10个一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，报纸或牛皮纸包好，高压；（3）取出后烘干待用。4.LB肉汤培养液的准备：本实验需要100根LB管根据所选购商品说明配制，将配制好的LB培养液，分装到100根干净试管，每根3ml，包好后于121高压15min，烘干待用。5.麦康凯琼脂培养基的准备：按所选商品说明配制，121高

3、压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。2.1.1.2实验过程（1）每个分离管装入20mlBPW；（2）三点取样剪取100份待检肉样分装到100个分离管中，按肉样的标号在分离管上标号，放入37±1温箱摇床上培养6h，200r；（3）取分离管中的菌液50L加入LB管中，标号，37±1温箱摇床上培养10-12h，200r；（4）用接种环取一环菌液画到麦康凯琼脂培养基上，标号，37±1温箱过夜培养。2.1.2菌株的纯化2.1.2.1实验的准备1.伊红美兰（EMB）琼脂培养基的准备：按所选商品的规格配制，121高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待

4、吹干后收板待用。2. LB肉汤培养液的准备：同2.5.1.1.1中LB肉汤培养液的准备。2.1.2.2实验过程（1）接菌：用2.5L或10L移液枪的枪头挑取麦康凯琼脂培养基上的单菌落，将枪头打到LB管中，标号，37±1温箱摇床上培养10-12h，200r；（2）划板：用接种环取一环菌液画到麦康凯琼脂培养基上，标号，37±1温箱过夜培养；（3）用接种环挑取麦康凯琼脂培养基上的单菌落划到EMB板上，标号，37±1温箱培养18-20h；2.2菌株的鉴定 2.2.1革兰氏染色镜检在麦康凯琼脂上长出红色的菌落，在伊红美兰琼脂上长出黑色、带金属光泽的菌落。挑取典型菌接种于MH

5、肉汤培养基，37± 1 培养12-24 h，取出1接种环菌液进行固定、革兰氏染色和镜检，根据细菌形态和染色特点，将革兰氏染色为阴性、两端钝圆、无芽胞、中等大小的杆菌初步判定为大肠杆菌。2.2.2菌株的生化鉴定 1.实验准备 生理盐水、液体石蜡高压进行灭菌，待用。提前复活菌株，吸取30-50L甘油保存菌液于LB肉汤，摇床培养3-5h（时间因菌株活性不同做适当调整，此步主要是保证菌株全部复活）。纯化菌株：将LB肉汤复活的菌株接种到麦康凯板，37过夜培养，18-24h。要求所有受试菌株必须是单一的菌落形态而且有单个菌落存在。2.实验过程（1）接种前准备安瓿瓶：从包装盒中取出安瓿瓶，朝易折点

6、(瓶颈上蓝点)反方向用力折开安瓿瓶，或用砂轮划一圈安瓿瓶瓶颈处，然后用力掰开安瓿瓶，插入安瓿瓶架或双面板中。试管：从包装盒中取出试管，插入试管架中。注：如果染菌或变色，则不能使用，重新拿一支。折开安瓿瓶时最好包裹纱布，以免划伤手指。 （2）接种方法直接接种：用接种针从平板上挑取已纯化分离的菌落接种于需要试验的安瓿瓶（试管）中。 菌悬液法：取一内盛有2ml无菌水试管，用接种针从平板上挑取已纯化单个菌落至无菌水中仔细研磨制成0.5麦氏浊度的均一细菌悬液，滴入需要试验的试管（安瓿瓶）中，每管3滴。 注：如内容物为半固体或半固体生化管，采取直接穿刺接种。 （3）接种完后用封口膜封口放于37±

7、1培养箱中培养或根据检测标准中所规定的培养温度进行培养。注意，肠杆菌科葡萄糖鉴定管接菌后封口，倒放置进行培养；氨基酸类的要先用石蜡封口。(4) 读生化鉴定的结果，根据肠杆菌科细菌生化鉴定编码册查找到菌株的菌名以及阳性机率。生化反应判断标准见表1，其中蛋白胨水需加靛基质溶液，苯丙氨酸需加三氯化铁溶液，之后观察颜色变化。葡萄糖产酸为阳性变成黄色标记A，不产酸则为阴性颜色不变，产气则标记G，即产酸产气标记为AG，产酸不产气标记为A，产气不产酸标记为G。表1 肠杆菌科细菌生化反应判断标准结果葡萄糖赖氨酸鸟氨酸硫化氢蛋白胨水乳糖卫茅醇苯丙氨酸尿素枸橼酸盐阴性紫色黄色黄色无色无色紫色紫色无色黄色绿色阳性黄

8、色紫红紫红灰褐红色黄色黄色绿色环红色蓝色经生化反应鉴定为大肠杆菌者，用大接种环在接有分离纯化菌株的LB琼脂平板上轻轻刮取菌落，接到含1 mL 30%甘油肉汤的EP管中；放于-20 冰箱中保存，便于后续实验用。如要长久保存，可用磁珠式菌种保藏管于-80 冰箱中保存菌株。2.3药敏试验2.3.1药物的配制2.3.1.1实验准备1.储药管的准备：用50ml离心管做为储药管，其准备过程同2.5.1.1.1中分离管的准备。2.虑管的准备：虑管用保鲜膜包好后放于烧杯中，报纸或牛皮纸封口，于121高压20min，烘干待用。2.3.1.2实验过程本实验所用药品需要配制成浓度为5120g /mL，体积40 mL

9、。（1）称药：根据所购药品的包装上的浓度计算所要称量的药品量。如果包装上没有注明药品浓度可根据 瓶装药品按5120×40/90% = 0.2276 g 称取； 袋装药品按5120×40/95% = 0.2156 g 称取。（2）溶解药品：根据每种药品的溶解方法来溶解以及定容称量好的药品；如氨苄西林（AMP）用超纯水溶解即可，然后定容到40ml；氯霉素（CHL）用95%的乙醇溶解后，定容到40ml；环丙沙星（CIP）用10%的醋酸溶解后，定容到40ml。表2 抗菌药物的质控范围及稀释浓度梯度抗菌药物溶剂质控范围稀释浓度梯度氨苄西林AMP超纯水2-80.5-512头孢噻呋CTF

10、PBS+PBC0.25-10.125-512头孢噻肟CTX超纯水0.03-0.120.008-512头孢他啶CTZ超纯水0.06-0.50.03-512头孢曲松CTR超纯水0.03-0.120.008-512头孢西丁CXT超纯水2-80.25-512庆大霉素GEN超纯水0.25-10.25-512卡那霉素KAN超纯水1-40.5-512四环素TET超纯水0.5-20.25-512环丙沙星CIP10%醋酸+超纯水0.004-0.0150.004-512恩诺沙星ENR超纯水0.004-0.030.004-512萘啶酸NAL1mol NaOH +超纯水1-40.25-512链霉素STR超纯水2-80

11、.5-1024阿米卡星AMI二甲基甲酰胺（DMF）+PBS0.5-40.25-512氟苯尼考FLF95%乙醇0.03-0.120.5-512氯霉素CHL95%乙醇+超纯水2-160.125-512喹乙醇OQX超纯水0.25-512（3）滤药：在无菌的条件下进行，将高压过的离心管、滤管，注射器，平皿，标签纸，镊子等在无菌超净台中紫外照射15min； 将配好的药液倒入平皿中，注射器抽取，用镊子在火焰上灭菌后夹取滤管的粗管处，安装到注射器上； 注入到高压过的储药管中； 用镊子将滤管取下，再抽取药液重复，直至药液完全滤完；过滤另一种药液时，要将平皿、注射器、滤管全部换新，不可重复用； 贴标签：要注明药

12、品名称、浓度、配制时间；如 AMP 5120 g /mL 2013.4.2。放于20 冰箱中，可保存半年之久。2.3.2质控2.3.2.1实验准备MH肉汤培养液按其商品说明进行配制，配制好后于121高压20min，放于超净台中待用。大肠杆菌标准菌株ATCC25922, 购自中国兽医药品监察所。2.3.2.2实验过程（1）复活大肠杆菌标准菌（ATCC25922）：取大肠杆菌ATCC25922接入LB肉汤试管中37 ± 1 温箱摇床中培养3-4h；（2）计算初始浓度：根据药品的质控计算出第一孔所要稀释的浓度；（3）第一孔中加入180LMH肉汤，其余用排枪每孔加100LMH肉汤，；（4）药

13、液的稀释：用去离子水或MH肉汤稀释，初始浓度 = 512/（n + 2）以2L药液为初量进行稀释，n为稀释药液所加MH肉汤的量；n:2即为药品稀释的倍数。（5）加药液：取出稀释的药液20L加入第一孔；每种药物做两行，96孔板的最后一行不加药液也不加菌液，作为阴性对照。（6）倍比稀释：取第一孔100L液体移加到第二孔，从第二孔开始倍比稀释，最后一孔吸取100L弃去。（7）加菌液：用排枪除最后一排外每孔加100L菌液；（8）盖好96孔板，放于37±1温箱摇床中培养10-12h；（9）读取结果。2.3.3MIC（最小抑菌浓度）实验参照2012版CLSI(Clinical and Labor

14、atory Standards Institute，临床实验室标准研究所 ）指导原则和执行标准，用琼脂二倍稀释法，测定63株大肠杆菌对17种常用抗菌药物的敏感性。用二倍稀释法把各种药物稀释到所需的各个浓度梯度，分别定量加入高压灭菌过的MH 琼脂在平皿中轻轻摇晃使之混合均匀，冷却凝固，制成含所需药物浓度的琼脂平板。把稀释至含菌量约为1. 0 × 106 CFU/mL 的菌液用微量多点接种仪接种到MH 琼脂平板上，于37 培养箱中倒置培养16 18 h 后观察结果。以完全不见细菌生长的最低药物浓度为该药物对细菌的最小抑菌浓度( Minimal inhibitory concentrati

15、on，MIC) 。2.3.3.1实验的准备MH琼脂、MH肉汤培养液分别按其商品说明进行配制，121高压20min；20ml移液管两支包好于121高压20min,烘干后待用；去离子水装入瓶中于121高压20min，待用；章用牛皮纸或报纸包好后于121高压20min，烘干待用。2.3.3.2实验过程第一天1.复活菌株：吸取30-50L甘油保存菌液于到LB肉汤，摇床培养3-5h（时间因菌株活性不同做适当调整，此步主要是保证菌株全部复活）。复活的菌株包括47种受试离菌株和1株质控菌株。不同的菌种的质控菌株是不一样的，参照CLSI上选取合适的质控菌株。2.纯化菌株：将LB肉汤复活的菌株接种到麦康凯板，3

16、7过夜培养， 18-24h。（所有受试菌株必须是单一的菌落形态而且有单个菌落存在）3.准备无菌室中过夜紫外照的物品：（1）高压灭菌过的移液管（20或25ml，至少两支）；（2）过夜泡酸并清洗过的96孔板（至少两块），烘干后，过夜照；（3）稀释药用的去离子水（已高压），MH肉汤（已高压，稀释菌液用）；（4）1ml枪头，1ml枪，高压过的章（接种仪）；（5）酒精灯，酒精棉，口罩，实验服，记号笔，打火机，带有浓度稀释梯度的纸；（6）一次性平皿（药物及浓度均标记好）。4. 根据CLSI上每种药物的质控范围和耐药临界值来确定的药物的浓度梯度，大到应该设置到耐药临界值上的1-2个梯度，小到应该设置到包括质

17、控范围内的1-2个浓度或设置到质控范围的最小值下一个梯度，计算每种药物所需的一次性平皿个数，计算时要各加一个空白板。5.准备足量的的MH琼脂（20ml/平皿），压好后置于60烘箱。不要过早进行高压，要保证琼脂的新鲜度。第二天1.将无菌室调至抽湿模式至少30min，一人在超净台接菌，挑单个菌落至MH肉汤中，摇床培养3-5h；一人在无菌室写板，稀释药液。2.写板时，在平皿底部一端写出每种药的稀释度。若同时做两个组份时，则应用不同颜色标记区分开；板上必须写清药名、浓度梯度。3.除512、256外，余下的浓度中各加入1ml水；需注意链霉素（STR）中，除1024外均加入1ml水。此时，要检查有无漏写的

18、浓度；注意整个过程需在酒精灯附近操作。4.浓度编号为 512、256、128，均加1ml原药，从128开始倍比稀释，最后一板弃去1ml。注意，此处根据自己设定的浓度，应有所变化，一般是依照自己所要设定的板上浓度、原药浓度、最后加入琼脂的体积来计算；且整个过程需在酒精灯附近操作。5.加琼脂：512的药板加9ml，其余加19ml，边加边摇晃，药物均匀散在琼脂板中，自然吹干；链霉素（STR）中均加19ml琼脂。注意，琼脂应当是冷却到50-60即不烫手背时再加入，以免温度过高会破坏药物的活性；混匀时，动作要轻而快，要充分混合均匀，保证药物均匀分布到琼脂中。6.收板：待平皿盖上无水汽或有较少水汽时，从大

19、浓度到小浓度收板即收好后每种药物的小浓度板置于最上面，正放。7.稀释菌液：超净台中酒精灯附近进行操作（6行8排），菌液浓度为0.5麦氏比浊时，按1：100的比例将各菌液浓度稀释到1×106CFUmL-1 ；并记录96孔板上各菌株的顺序。注意，所用96孔板，必须是打开盖子过夜照过紫外或是新的已经灭过菌的；若菌液浓度不同，应当有所调整；吸取不同的菌液时，要换枪头。8.接种细菌（又称盖章）：酒精灯旁，把接种仪放入96孔板中，先上下抽取混匀后，由低浓度至高浓度开始盖，每次盖三块板，最高浓度后换下一种药物时，加盖空白板，从而缓冲前面药物的高浓度对下一个药物的低浓度的影响。9.盖好后，约半个小时

20、，等菌液全部吸收好后，将其倒置于37±1培养箱中培养16-18 h。10.处理实验用过的物品（煮章、煮菌液、移液管），洗净后，包好，高压，待下次用。第三天1.读板将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，空白对照板上菌株应该是生长良好且无污染时，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。以三个或三个以下小型单菌落或出现了云雾状的薄层菌落，为判断为抑制生长。如果出现有3个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。2.在Excel表中输入实验结果；煮板。注：1.进无菌室首先带上口罩，酒精棉擦手灭

21、菌。 2.尽量少说话，避免杂菌污染。 3.加琼脂时，要在酒精灯附近操作，注意看好移液管量程，以防加错。另外要防止加琼脂时瓶中琼脂温度过低，使得平板中琼脂有凝块而造成药液不能均匀分布。所以，有凝块的琼脂不要使用。 4.建议在做一批菌株时，先做一个平行，只要这个结果中的质控菌株对药物的敏感性在质控范围内，那么这次结果即有效，不用再做第二个平行；如不能满足上述条件，那么将不满足条件的药物再重新做。5.实验中所用的菌液必须是新鲜的，不能使用已经放置过很久的菌株。6.实验中，要时刻记住无菌操作，避免污染。2.3.3.3细菌药敏试验结果判定标准参照2010版CLSI(Clinical and Labora

22、tory Standards Institute，临床实验室标准研究所 ）指导原则和执行标准，用琼脂二倍稀释法，测定63株大肠埃希菌对18 种常用抗菌药物的敏感性。以敏感、中介、耐药3种形式对MIC大小作出解释, 判定标准如表3所示。表3 大肠杆菌耐药判定标准抗菌药物Antibacterial agentsMIC解释标准（g/mL）S（Susceptive）I（Intermediate）R（Drug resistant）氨苄西林AMP 81632头孢噻呋CTF*81632头孢噻肟CTX124头孢他啶CTZ4816头孢曲松CTR124头孢西丁CXT81632庆大霉素GEN4816卡那霉素KAN1

23、63264四环素TET4816环丙沙星CIP0.060.12-0.51恩诺沙星ENR*-2萘啶酸NAL16-32链霉素STR*-64阿米卡星AMI163264氟苯尼考FLF*-32氯霉素CHL81632喹乙醇OQX*-64注：根据文献报道，头孢噻呋(CTF)的耐药转折点为8 g/mL；氟苯尼考(FLF) 的耐药转折点32 g/mL ；恩诺沙星(ENR)的耐药转折点为2 g/mL；链霉素(STR)的耐药转折点为64 g/mL 10。喹乙醇(OQX) 的耐药转折点为64 g/mL 20。CLSI根据细菌学、药动学和临床资料设定并定期修订抗生素对不同细菌敏感折点，通过折点将细菌分为敏感（S）、中介（

24、I）、耐药（R）。敏感（S）指被测菌株能被使用推荐剂量在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制。中介（I）指抗菌药物最低抑菌浓度MIC接近血液和组织中通常科达到的浓度，疗效低于敏感菌。还表示药物在生理浓集的部位具有临床效力（如尿液中的喹诺酮类和-内酰胺类）。另外，中介还作为缓冲区，以防止微笑的技术因素失控导致较大的错误结果，特别是对那些药物毒性范围窄的药物。耐药（R）指被测菌株不能被常用剂量抗菌药物所抑制，和/或抑菌环直径落在某些特定的微生物耐药机制范围（如-内酰胺酶），临床疗效不可靠。2.4 CTX- M型基因的PCR扩增模板的提取（1）将LB管中的菌液倒入1.5mlEP管中，标号，离心，13000r，5min；（2）倒掉上清液，再将LB管剩余液体倒入