细菌感染性疾病的直接核酸诊断试验

1、细菌感染性疾病的直接核酸诊断试验Florence Paillard, PhD, and Craig S. Hill, PhD准确和快速的诊断是及时采取治疗措施和防止感染性疾病扩散的关键。理想的感染性疾病 的诊断试剂应该能够给临床医生提供快速、灵敏度高和特异性强的实验结果。检测试剂如果灵 敏度不高则可能导致疾病的漏检，使患者不能得到及时的治疗，还可造成疾病的扩散；同样，试 剂如果特异性较差则可能出现假阳性结果，假阳性的出现不仅会导致不必要的治疗，还可能给 人们带来心理上的阴影。不论对个人还是公共卫生部门，因检测方法的不可靠所导致的错误诊 断都有可能造成严重的后果。令人欣慰的是，近年来分子诊断技术

2、的发展已使得人们可以研制 出比传统方法更为灵敏、特异和快速的用于感染性疾病的诊断试剂。一、细菌感染性疾病诊断方法述评 数十年来，检测细菌的的标准方法是培养（液体和/或 固体培养基）和染色，如用于结核分枝杆菌的抗酸染色和淋病奈瑟菌的革兰染色。其它一些方法还包括采用抗体技术检测细菌 抗原的酶免疫测定（EIA ）和直接荧光抗体技术（DFA ）等。采用分子生物学技术检测微生物核酸成分的核酸检测（NATs）技术的发展为临床诊断 方法带来了革命性的变化。目前用于微生物鉴定的NATs主要有两种类型：培养确认检测试剂 和直接检测试剂。培养确认的NATs试剂主要用来对培养基上生长的微生物进行确认；直接 NATs

3、试剂可以直接检测标本中的微生物，无需培养。与培养确认探针试剂相比，由于直 接 NATs试剂完全不需要培养这一步骤，所以可以更快地给出检测结果；直接NATs试剂一般来说 其准确性也高于直接免疫检测方法。美国FDA批准的第一个非放射性直接NATs试剂是Gen- Probe PACE试剂，用来检测衣原体和淋球菌感染。对直接NATs试剂而言，一个至关重要的改进在于加入了目标扩增步骤，即探针检测前将 目标序列进行扩增。第一个用于沙眼衣原体检测的核酸扩增试剂（ NAA Ts）于1993年获 得了 FDA的批准。此后，随着核酸扩增技术的不断改进，出现了可以将样品成分的抑制作用降 为最小的第二代NAATs，它

4、的操作流程也得到了相应改进。本文将就已经商品化并得到FDA批准的用于检测五种细菌感染的直接NATs试剂进行述 评。这五种感染为：链球菌性咽炎、肺结核（TB ）、阴道炎、衣原体（CT）和淋球菌 （GC）感染。二、直接NAT方法学非扩增直接NATs （表1）：大多数商品化的直接NATs试剂都采用特异性针对出现在被 测生物体内的一段独有的核酸序列（目标序列）的核酸探针。这种探针通常采用荧光或化学 发光标记。所测样品需进行处理以使其能够释放出核酸。检测时，标记的DNA探针可以和靶序 列特异性结合，形成一个稳定的探针目标序列杂交体。该杂交体被从非杂交探针中分离或区别开后，标记物散发出信号。在直接检测临床

5、标本中的微生物时，NATs可以采用不同的方式来提高试剂的灵敏度。 Gen.Probe采用的一项专利技术是将rRNA作为检测目标，rRNA在大多数微生物体内是以数以 千计的拷贝量存在的。例如，沙眼衣原体中的rRNA可达2000拷贝，而DNA中有用的靶序列 在每个细菌体内的量仅有一个或数个拷贝。因此以rRNA为检测目标可以大大提高试剂的灵敏 度。除此之外，Gen-Probe由于在杂交检测中还采用了杂交保护检测（HPA）方法，使其试剂的灵敏度得以进一步提高。检测rRNA和HPA技术的结合使得第一个DNA探 针 检测试剂被临床实验室广泛用于培养的确定和直接检测。第二个用于提高DNA探针检测灵敏度的方法

6、是对信号分子进行放大，如杂交捕获试剂（Hybrid Capture assay ）。它采用针对RNA :DNA杂交体的抗体来检测杂交形成，每个抗体 都 带有酶标记物。每个酶分子都会产生多种着色分子用于与之结合的每个杂交分子。这种从一个杂交分子产生多重信号分子的方法称为“信号放大”方法。但与第三种改进试剂性能的 “目标扩增”方法相比，信号放大方法的灵敏度和特异性都要低的多。目标扩增直接核酸扩增检测（表1）:目标扩增是指通过在一个试管内产生数百万个目 标序列拷贝的方法来提高试剂的灵敏度，这种方法类似于通过培养使细菌体内产生更多的靶 DNA或RNA拷贝以提高检测的灵敏度。但靶扩增的过程要比培养快的多

7、，它可以用来检测实 验室里难以培养或不能培养的细菌。目标扩增所采用的复制序列（亦称amplicons ）为标记的 DNA探针。目前广泛采用的鉴定细菌的几种目标扩增方法分别为PCR、链替代扩增（SDA ）和转录介导扩增（TMA ）。1 - PCR ：指DNA目标序列受热变性，然后加入DNA聚合酶进行扩增的过程。可与目标 序列特异性结合的引物引导DNA聚合酶对该序列进行复制。DNA合成的每个过程均经历加热 变性一退火一延伸这样一个循环，每个循环后拷贝数可增加一倍。由于反应循环可进行一 定次数，所以短时间内即可扩增获得大量目标DNA。2 - SDA ：与PCR不同，SDA的扩增过程是在同一温度下进行

8、的。这种“恒温”方法 也 需使用引物来保证扩增的DNA序列的特异性。不同的是，它无需采用加热变性的方法来解链双 链DNA，而是采用限制性核酸内切酶对新合成的DNA引物进行切割。DNA聚合酶能识别切 割位点并可以在该点重新启动DNA合成，通过对DNA的复制以替代以前的DNA链。这一过 程可以使DNA的拷贝成倍增长，并循环进行。和PCR一样，SDA仅扩增DNA。如果扩增 对象是RNA，则需首先将其转录为DNA。均相检测采用出现在SDA反应中的称之为“分子 灯标”的一种特异性荧光探针，这种探针与扩增反应过程产生的复制序列（amplicon ）进行杂 交并改变其结构时会产生荧光信号。3 - TMA ：

9、 TM A是在恒温过程中特异性扩增RNA或DNA分子，反应过程需引物和两 种 酶：逆转录酶（RT）和RNA聚合酶。逆转录酶用来合成DNA，合成的DNA再被RNA聚合 酶用来复制更多的RNA，这一过程可以循环进行。采用自动化扩增仪，TMA可以在15到30 分钟内使目标序列扩增10。亿倍。检测采用HPA方法。HPA使用可以和复制序列进行特异性 杂交的口丫口定酯标记探针。扩增后，一种“选择试剂”可以破坏掉未杂交探针上的口丫口定酯，而 已经杂交的探针上的口丫口定酯不会受影响，这是因为杂交结构可以保护它。检测可采用发光仪。表1.用于细菌检测的商品化直接NATmNAT类型技术核酸标记生产商杂交保护（HPA

10、 ）rRNA化学发光Gen-Probe Inc非靶扩增固相捕获rRNA比色BD杂交捕获DNA化学发光Digene Corp.PCRDNA比色Roche靶扩增SDADNA荧光BDTMArRNA化学发光Gen-Probe Inc三、直接NATs与培养/免疫方法的比较（一）、与其它常用微生物检测方法相比，直接NATs的优势主要有：1 检测时间短（16小时）。虽然这一检测时间与EIA相似，但较之培养所需的24-72 小时甚至8周（如结核杆菌）而言，还是有很显著的改进。快速检测不仅可以使病人得 到及时治疗，在某些情况下，还能提高公共卫生的安全性（如避免疾病的扩散）。2-高通量检测。一些直接NATs可以在

11、同一个时间里进行几百个标本的检测，不仅省 时、也降低了成本。自动化的直接NATs也大大减轻了工作负担。4 高灵敏度NAATs。NAATs理论上可以从每份标本中检出一个生物体，而其它方法如EIA的最低检测水平为每份标本1000个以上的生物体。NAATs的临床灵敏度一般在 95%以上，与标准培养方法相等或更敏感，在某些标本中更是明显（如尿标本CT检 测）。5 因为无须要求被检测标本中的微生物一定是存活的，所以直接NATs对标本的要求 不高。与培养相比，直接NATs所用的标本可以放置更长时间。（二）、直接NATs的潜在局限性主要有：1 一些第一代NAATs在某种情况下会因为扩增抑制作用而导致试剂灵敏

12、度的降低（如 采用尿标本检测CT）。这种抑制作用通常是标本特异的，会引起假阴性结果。通 过内在监控或扩增控制等方法可以控制这种抑制作用，也可以采用目标捕获等技术处 理标本从而消除抑制作用。尽管有时会出现抑制作用，但大多数NAATs临床检测灵敏 度仍然高于非扩增的直接NATs或ElAo2 标本之间复制序列的残留物污染对NAA Ts可能是一个问题，但不影响非扩增直接 NATs。严格执行操作程序可以最大限度的减少残留物污染所带来的影响。3 目前FDA批准的NAATs不能用于检测耐药性。对于需要了解耐药情况的一些病例 如结核诊断，需同时进行NAAT和培养。NAATs可以快速检定结核杆菌，使患者得 到及

13、时治疗；而培养可以确定诊断及细菌耐药情况。4 - NAATs的成本通常高于传统微生物和EIA检测方法。一个例外是CT培养，它一般 很难进行，而且成本要高于NAA Ts。四、用于细菌感染性疾病的直接NATs （表2）表2. FDA批准的用于细菌感染性疾病的直接NATs病名病原体生产商/试剂检测技术所用标本（FDA认可）A群链球菌人群链球菌 性咽炎Gen-Probe/GASDirectHPA咽拭子标本肺结核结核杆菌Roche/AMPLICOR MTB PCRGen-Probe/AMPLIFIED ( MTD ) TMA呼吸道标本（涂片阳性）呼吸道标本（涂片阳性、阴性）衣原体感染沙眼衣原体Gen-P

14、robe, PACE 2 CT HPA宫颈内拭子标本 男性尿道拭子标本眼结膜拭子标本Digene,HybridCapture II CTHybridCapture宫颈内拭子标本宫颈内拭子标本Roche,AMPLICOR CT PCR男性尿道拭子标本男性和女性尿标本宫颈内拭子标本男性尿道拭子标本Gen-Probe, PACE 2 GC HPAGen-Probe,APTIMA Combo 2 TMADigene,HybridHybridCapture II GCCaptureRoche,AMPLICOR GCPCR淋球菌感染淋病奈瑟菌BDProbe Tec ET CT/GC SDA男厘微藕at加拭

15、子标本宫颈内拭子标本宫颈内拭子标本男性尿道拭子标本男性尿液宫颈内拭子标本男性尿道拭子标本男性和女性尿标本宫颈内拭子标本男性尿道拭子标本男性和女性尿标本阴道拭子Gen-Probe,APTIMA Combo 2 TMA 阴道加特纳菌、阴道炎阴道毛滴虫、 BD Affirm VPIII固相阴道拭子念珠菌属捕获A群链球菌性咽炎：检测咽炎病人A群链球菌（GAS ）的金标准是采用咽拭子标本进 行培养，但培养需要2448小时。目前所开发的快速抗原检测试剂（RADT ）虽然可以进行 快速检测，而且使用也较方便，但其灵敏度一般比培养低。许多专家建议当病人为儿童或青 少年、或医生在他的实际工作中不能确定所使用的R

16、ADT的灵敏度是否和培养相同时，则应当 采用咽拭子培养对所有RADT检测阴性的标本进行确定。GenProbe公司生产的GASDirect试齐“（表2）是目前唯一通过FDA认可的用于检测GAS 的直接NAT试剂。它采用HPA方法测定GAS的rRNA序列。GASDirect的灵敏度约 为 90%、特异性2 98%，优于RADT试剂，与培养的灵敏度相似。GASDirect的检测时间为60 分钟，每份标本的检测成本低于咽拭子培养，与RADT相同。因此，在GAS的检测方法中， GASDirect不失为一个有用的选择。肺结核（TB ）：目前美国胸科学会和CDC对TB的实验室检测要求是荧光抗酸染色 （AFB

17、涂片）和液体及固体培养基培养。涂片比较快捷但灵敏度较低；培养的灵敏度较高但需2 至8周。Gen-Probe公司生产的AMPLIFIED结核分枝杆菌检测试剂（MTD、第一个由FDA 批准的结核NAAT检测试剂）和Roche公司的AMPLICOR MTB试齐（表2）已被用于TB的 诊断。不过这两种试剂被限定只能用于呼吸道标本的检测。它们可以用做TB的初期诊断，但 不能用于监控治疗。与培养或最终确诊结果相比，上述方法的灵敏度和特异性与培养相似，但这些商品化的 NAAT试剂的检测时间只需一天，因此可以为医生提供快速诊断结果。FDA早期批准的NAAT 试剂仅用于AFB涂片阳性的病人，而后来批准的MTD试

18、剂可以用来对涂片阴性的可疑TB患 者进行检测。MTD这一用途使其能够对标本中结核杆菌数量很少而难以采用涂片检查的病人进 行快速检测。图1概述了 CDC推荐的采用MTD检测结核分枝杆菌的使用原则。图1.用于可疑TB患者的MTD检测使用原则第一份痰标本-> 培养-> 确定或否定TB诊断I I阳性阳性-MTB阳性涂片 NAAT阳性 阴性f检查有无抑制作用-> 无-> 检测其它标本-> 涂片（+） MTD （-） - NTM->有-> 采用MTD或其它NAAT检测其它标本阴性阳性检测其它标本-> MTD （ +）-* MTB 阳性阴性阴性一检测其它标本-

19、> 涂片（-）MTD （-）-> MTB阴性注：NTM：非结核分枝杆菌。阴道炎：与阴道炎有关的微生物包括阴道加特纳菌、阴道毛滴虫和念珠菌属。传统诊断 阴道炎的方法为阴道标本培养和玻片镜检。培养虽然灵敏，但耗时、耗力，且成本较高；玻片镜 检比较快捷，但对某些病原体的灵敏度较低（如检测念珠菌和滴虫的灵敏度055%），且检测结果的准确性常常依靠操作人员的经验。BD公司的Affirm VPIII检测试剂（表2）是一 种NAT试剂，采用两个探针：一个是捕获探针，一个为检测探针。靶序列首先与固定在一个珠 子上的捕获探针进行杂交，然后再与检测探针杂交。随后经洗涤去除未结合的标本和探针， 将检测探

20、针与检测酶结合。通过几次洗涤将多余的酶去除后再加入酶底物，结果呈蓝色，可通 过肉眼观察。Affirm VPIII能检测上述三种病原体，与培养相比，其灵敏度分别为：念珠菌 81%、加特纳菌89%、毛滴虫92%。衣原体（CT）和淋球菌（GC）感染：检测CT和GC的实验室方法目前主要包括革兰 染色、培养、目F扩增NATs、 NAATs 、EIA和DFA 。1 -非扩增NA Ts ： Gen-Probe公司生产的检测CT、GC或联检DNA探针试剂（PACE 2 CT、PACE 2 GC或PACE 2C ）已获得FDA的批准，可用来检测来自宫颈内、男性尿道和眼 结膜（仅供CT ）的标本。使用一份拭子标本

21、，PACE2就可以对CT和GC进行联检（PACE 2C）或检测其中的一种。目前在美国PACE2系列已成为临床实验室最为常用的检测CT和 GC的方法。PACE 2采用HPA方法测定rRNA，灵敏度和特异性与培养相似；PACE 2 GC的 灵敏度与NAATs相似，但PACE 2 CT的灵每攵度低于NAATs （表3）。表3 . 4种FDA批准的检测CT直接NATs对比试剂靶序列拭子标本的灵敏度尿标本的灵敏度Gen-Probe PACE 2 CTHPArRNA70%-90%不适用Roche AMPLICOR CTPCRDNA>90%80%-90%BD Probe Tec CT/GCSDADNA

22、>90%80%-90%Gen-Probe APTIMACombo 2 CT/GCTMArRNA>95%>90%2 - NAATs ： Roche公司的AMPLICOR试齐U是第一代基于PCR的NAAT ；而BD公司的 BDProbe Tec是第一代基于SDA的NAAT。这些试剂扩增的目标序列通常位于染色体DNA或 质粒中。BDProbe Tec目前有两种：一是检测CT的BDProbe Tec CT，另一种是可以在一份 标本中同时检测CT和GC的BDProbe Tec CT/GC。新近出现的CT/GCNAAT是Gen-Probe 公司的Comb。2试齐IJ，它是基于TMA的第二

23、代NAAT，通过在一份标本中同时扩增CT和GC的rRNA分子而对二者进行检测和确定。这种试剂采用一种独特的目标捕获方法对目标分子 进行纯化和浓缩以去除可能存在于标本内的抑制物。目标捕获方法采用特异性探针将目标 rRNA分子结合到磁微粒上，未结合的分子经洗涤除去。随后已经过纯化和浓缩后的目标分子 通过TMA进行扩增。3 检测CT和GC的直接NATs的灵敏度和特异性：检测CT的NAATs通常比非扩增的 NATs和CT培养的灵敏度高，而检测GC的NAATs的灵敏度与培养和非扩增的NATs相 似。采用拭子标本的所有检测CT的NAATs 一般都有较高的灵敏度（90%），其中Combo 2 试剂的灵敏度最

24、高（90%）。对于泌尿生殖道标本，PACE 2试剂盒被批准只可采用男性尿道和女性宫颈内拭子标本检 测CT和GC。而NAA Ts不仅可以采用拭子标本、也可使用尿液标本。由于尿的采集是非 侵 入性的，易于被病人接受，同时也减轻了工作负担。由于高水平抑制物质的存在，采用尿标本 的第一代NAATs的灵敏度比采用拭子标本低5-10%，这点在女性更为明显。采用PCR方法 （如AMPLICOR试剂）检测女性尿标本中GC的效果尚不清楚。SDA方法已获批准可以采用 男性和女性尿标本进行检测，但女性尿标本检测灵敏度比宫颈内拭子标本低大约10%。Combo 2靶捕获方法可以减少抑制，因此采用该试剂检测尿标本的灵敏度

25、高达91%-100%。CDC最近发表了 CT和GC检测指南（表4）。NAATs因其高灵敏度被推荐用于CT检 测，但也可采用探针检测和EIA方法。对于GC检测应首选拭子标本培养，因其具有很高的灵 敏度，并能进行药敏检测。NAATs和探针检测的灵敏度与GC培养相似，当因转送和储存条件 不佳难以进行培养时推荐采用NAATs和探针检测。不论CT还是GC感染，所有检测方法均 推荐采用男性尿道和女性宫颈内拭子标本。如果侵入性的拭子采集方法不被接受或不能采集， NAATs可采用尿标本。由于交叉污染或某些第一代NAATs可以和非淋病奈瑟菌发生非特异性反 应，CDC建议核查一些阳性结果以排除假阳性。在低流行人群中，对CT/GC NAAT结果阳性者 应进行附加NAAT检测以排除可能出现的假阳性结果，