渗透压冲击法提取大肠杆菌周质蛋白

1、渗透压冲击法提取大肠杆菌周质蛋白许多生物产物特别是蛋白质、基因重组产品、胞内产品如：青霉素酰化酶，碱性磷酸 崎等胞内防，干扰素、胰岛素、生长激素等基因工程产物以及部分植物细胞产物等都是胞 内物质，这类生物产物需要分离纯化的第一步是收集细胞及细胞破碎，使目标产物释放出 来，然后进行分离纯化。破碎细胞主要采用的方法有机械法和非机械法两大类。机械破碎 处理量大，破碎速度较快，时间短，效率较高，是工业规模细胞破碎的重要手段，细胞受 到挤压，剪切和撞击作用，易被破碎在许多情况下，细胞内含物全部释放出来，由于机械 搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施，机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击 破碎法和超声

2、波等方法。其中，超声波法是一种很强烈的破碎方法，细胞破碎是利用声频 高于1520KHZ的超声波在高强度声能输入下进行的，普遍认为其破碎机理是与空化现象 引起的冲击波和剪切力有关，即空穴作用产生的空穴泡由于乂受到超声波的冲击而闭合， 从而产生一个极为强烈的冲击力压力，由此而引起悬浮细胞上产生了剪切应使细胞内液体 产生流动而使细胞破碎。机械破碎虽已广泛应用于工业大规模生产，但它仍有许多不足之 处，如大量细胞碎片的产生，胞内所有可溶性杂质蛋白的释放，发酵液粘度增加等。这给 后处理工艺带来了很大难度，而非机械破碎方法，其条件比较温和，有利于存在细胞膜附 近目标产物的高活力释放回收，适用于所有微生物细胞

3、的破碎，包括物理法、化学法和能 溶法。细胞物理破碎方法比如渗透压冲击法(Osmotic Shock) o渗透压冲击法是各种细 胞破碎方法中最为温和的一种。将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖 溶液)，达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入缓冲液中，由于渗透压的突然变 化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞，引起细胞壁和膜膨张破裂，从而使细胞通透性 增大。大肠杆菌是大多科学研究及应用中实现蛋白表达的首选宿主。周质空间是由大肠杆菌 内膜和外膜组成的双层膜结构，能提供一个适合外源蛋白正确折叠的环境。在大肠杆菌周 质空间表达的重组蛋白有众多优点，由于周质空间的蛋白含量低，蛋白酶活性要比

4、胞质中 低，所表达的目的蛋白能避免胞内降解而稳定的存在，有利于目的蛋白的浓缩。但是周质 蛋白提取需要定向释放技术，该技术的关键在于只破坏大肠杆菌的外膜而不损害内膜，否则大肠杆菌胞内蛋白的和核酸的释放将给目的蛋白的纯化带来 困难。利用渗透压冲击法，研究者们已经成功地从大肠杆菌中分离纯化出许多具有重要价值 的目标蛋白，比如血管内皮生长因子受体-2。血管内皮生长因子受体-2具有重要的治疗意 义。Wanlu Cao等采用并优化了渗透压冲击法有效的提取和浓缩这种受体1 。文中，通过 5000g离心30min收集发酵罐中的菌体，去上清，重悬菌体，并混匀，加入等量的渗透压 冲击缓冲液(36%蔗糖,20nlM

5、磷酸缓冲液,pH7： 2. 5Mm EDTA),在20c下充分混匀10分 钟，迅速加入5倍体积得得预冷蒸饰水，引发渗透压冲击，经过20分钟的平衡时间，悬 浮液在4下离心(7500g, 20min),收集上清即为大肠杆菌周质破碎上清，用于进一步 纯化。渗透压冲击法分离蛋白的优化方法曾经被多次仔细的研究过，比如在Rathore AS 等的大肠杆菌表达蛋白分离的渗透压冲击法的优化一文中，平衡时间，渗透缓冲液的 浓度和类型，pH值对于该法具有关键作用。研究表明在渗透冲击之间增加平衡时间和渗透 缓冲液中的Tris-HCl的浓度，初始细胞在渗透缓冲液中的扩散能够提高提取的效果2 0在利用大肠杆菌制备C-藻

6、青蛋白时，Ramos, Amparo等改进了一种大规模纯化该蛋白 的方法，藻青蛋白的提取通过渗透压冲击法并通过层析法分离离心后的上清液。在提取的 过程中，溶剂中添加了 0.0遍的叠氮化钠，2g菌体与40ml的缓冲液混匀，并利用磁力搅 拌器将液体和细菌充分混匀，时间大约30min。结束后，将液体转移到离心管中，在 12000rpm下离心15min,收集上清3 .渗透压冲击法还被用于分离大肠杆菌合成的人抗体片段。在该研究中，作者利用自我 切割亲和标签技术来对几种目标蛋白进行分离，其中两种蛋白含有二硫键。这些蛋白首先 通过基因工程的方法与自我切割儿丁质结合结构域(内含肽标签)，并通过几丁质琼脂糖 树

7、脂进行纯化。通过将目的基因与内含肽的片段融合后，表达的蛋白能够被大肠杆菌分泌 到周质空间，通过渗透压冲击法能够被释放出来4 .应用渗透压冲击法裂解细菌时，所表达的蛋白不能够形成包涵体，应该在目标蛋白上 连接一段信号肽，使表达的蛋白能够分泌到周质空间，否则时间效果将不如其他裂菌方法 比如超声波法。蔡媛媛等在构建肿瘤坏死因子相关凋亡配体胞外功能区的原核表达质粒，优化诱导蛋白表达的相关条件，检测切胶纯化所得蛋白的抗原结合活性, 以及亲和层析纯化蛋白的促凋亡功能的研究中同时比较超声、渗透冲击和IP裂解三种破 碎细菌方法，在A600值、IPTG以及诱导时间都相同的情况下，37C出现包涵体表达，裂 解细菌

8、方法的比较中，渗透冲击法以及IP裂解法的实际效率不及超声法，实验者可根据 实验目的来选择最适合的方法，需注意的是，若要提取上清里的可溶性蛋白，超声时菌液 一定要冰浴以防蛋白高温变性5 .参考文献：1.Cao, W. , et al. , Periplasmic expression optimization of VEGFR2 D3 adopting responsesurface methodology： Antiangiogenic activity study. Protein Expression and Purification, 2021. 90(2): p. 5566.Ratho

9、re, A.S. , R.E. Bilbrey, and D.E. Steinmeyer, Optimization of an osmotic shock procedure for isolation of a protein product expressed in E. coli. Biotechnol Prog, 2021. 19(5) : p. 1541 -6.Zhang, C. , et al., Changed loading conditions and lysate composition improve the purity of tagged recombinant p

10、roteins with tacn-based IMAC adsorbents. Biotechnol J, 2021. 10(3): p. 480-9.Ramos, A. , et al., Development of a process for large-scale purification of C-phycocyanin from Synechocystis aquatilis using expanded bed adsorption chromatography. Journal of Chromatography B, 2021. 879(7.C8): p. 511-519.Wu, W一丫, et al., Intein-mediated one