中药专业微生物学实验指导-常海林

1、微生物学实验一 细菌的形态观察【实验目的】1.掌握生物显微镜油镜的使用方法和保护方法。2.掌握典型细菌的形态和特殊结构。【实验原理】在一般微生物学实验中最常使用的是普通光学显微镜的油镜。油镜镜头透镜很小，进入镜筒的光线很少，使用时为了增加亮度，必须在标本玻片与镜头之间滴加香柏油，因为香柏油的折光率与载玻片相似，这样就可使通过集光器进入载玻片的光线不会因折射而流失，使视野明亮，物像清楚。【实验器材】1.显微镜、擦镜纸、香柏油、二甲苯。2.球菌（葡萄球菌、链球菌等）、杆菌（枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌、结核分支杆菌等）、弧菌（霍乱弧菌等）标本片。3.肺炎链球菌荚膜染色片、变形杆菌鞭毛染色片、破伤风

2、梭菌芽胞染色片。【方法与步骤】1.坐姿：使用显微镜油镜时，必须端坐。镜体保持垂直位，不要使载物台倾斜，以免镜油流失影响观察。2.识别油镜头：油镜头上一般刻有“×100”、“×90”、“Oil”等标记。3.对光：用低倍境对光。检查染色标本时光线易强，要抬高集光器，放大光圈，取得最大亮度4.滴加香柏油：将标本放在载物台上固定好，滴加香柏油1滴，换油镜检查。5.调焦距：将油镜移至中央对准标本，从侧面注视镜头，并缓慢向下转动粗螺旋，使镜筒下降，直至镜头浸于香柏油中并几乎接触到标本为止。然后将视线移至目镜，一面观察一面向上慢慢转动粗螺旋，待看到模糊物像时，改用细螺旋，直至看清物像。6

3、.清洁保养：镜检完毕，将镜筒升起，取出标本片，用擦镜纸将镜头上的油擦干净。若油已干，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去油迹，再用擦镜纸揩去二甲苯。然后，将集光器降下，各物镜呈“八”字形，放入镜箱内。【实验结果】绘图：油镜下观察到的荚膜、白喉杆菌、结核杆菌，并注明名称、放大倍数。【注意事项】1.注意观察细菌的形态、大小、排列和染色；观察细菌特殊结构（荚膜、鞭毛、芽胞）。2.注意不要打碎标本片。【思考题】1.举例说明细菌的基本形态有哪些？2.细菌有哪些特殊结构？它们的存在有何意义？实验二 细菌的革兰染色法【实验目的】1.掌握革兰染色的方法。2.掌握细菌的基本形态和结构。3.了解革兰染色的原理。【实验原理】

4、1.G+ 菌细胞壁结构致密(肽聚糖层厚)，且脂质含量少，乙醇不易渗入脱色。G-菌细胞壁结构致密(肽聚糖层薄)，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。2.G+ 菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色。G-菌菌体核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。3.G+ 菌等电点比G- 菌低，在同一pH值条件下阳性菌比阴性菌所带负电荷要多，带正电荷的碱性染料(结晶紫)结合牢固，不易被乙醇脱色。【实验器材】1.显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、吸水纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯、生理盐水、蒸馏水。2.草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏（Lugol）碘液、95%乙醇、复红染液。

5、3.金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌(培养1824小时后待用)。【方法与步骤】1.标本片制备（1）取载玻片1块，用记号笔划分为2个区域，并分别做好标记。（2）两区各加1滴生理盐水。接种环按无菌操作法自两个斜面菌种管挑取少许菌液，分别于各区盐水中混匀涂成一薄层，接种环在火焰上灼烧灭菌。（3）在室温下自然干燥。（4）用片夹夹住玻片通过火焰3次固定标本，自然冷却。2.染色（1）初染：在固定好并已冷却的涂片标本上滴加结晶紫染液，要盖满涂膜。约1分钟后，用细水流从玻片的一端把游离的染液洗去。（2）媒染：滴加卢戈碘液数滴，作用1分钟后，轻轻水洗。（3）脱色：在玻片上加95%乙醇23滴，并轻轻转动玻片数秒钟，使玻

6、片倾斜让乙醇流去，如此重复数次，直至流下的乙醇几乎无色或稍成淡紫色，流水冲洗。（4）复染：滴加稀释复红染液数滴，作用1分钟后流水冲洗。3.结果判定（1）染色完毕，用吸水纸将标本片吸干，玻片上滴加香柏油，油镜观察。注意观察菌体的形态、大小、排列和染色。（2）金黄色葡萄球菌染成紫色为G+ 菌，大肠杆菌染成红色为G- 菌。【实验结果】绘图：油镜下观察到的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的形态，结构。表2.1 革兰染色结果记录菌名菌体颜色菌体形态G+ 或G-         【注意事项】1.决定革兰染色成败的关键是脱色程度。若脱

7、色过度，即使是G+ 菌，其蓝紫色也会被脱去而染上红色，被误认为是G- 菌（假阴性）。若脱色不足，即使G- 菌也因蓝紫色被保留而染不上红色，被误认为G+ 菌(假阳性)。脱色程度又受脱色时间、涂片之厚薄、脱色时载玻片摇晃的快慢及酒精用量多少等因素的影响，无法严格规定。一般可用已知G+ 菌和G- 菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰反应时，应同时另作一张已知G+ 菌和G- 菌的混合涂片，以资对照。2.涂片以薄而匀为佳，切不可浓厚。过于密集的菌体，因脱色不均匀常呈假阳(阴)性。镜检时，要以分散开的细菌着色为准。3.做革兰染色的菌种，以培养1824h为宜。一般情况下G- 菌的染色反应较稳定

8、，不易受菌龄的影响；而G+ 菌,有的在幼龄时呈阳性，培养24和48h以上，由于细胞老化或死亡也可变为阴性反应。4.不宜使用放置过久的碘液，以免影响固定结晶紫的作用【思考题】1.试比较革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁结构的特征？2.革兰染色有什么实际意义？3.当你对一株未知菌进行革兰染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？实验三 牛肉膏蛋白胨培养基的制备【实验目的】1.掌握配制培养基的一般方法和步骤。2.理解培养基的配制原则。3.了解配制培养基所用器皿的准备。【实验原理】培养基是用人工方法制备而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养制品。培养基按其物理性状可分为固体培养基、半固体培养基和液

9、体培养基三种。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，又称为普通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中，牛肉膏为微生物提供碳源和能源，蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作为凝固剂，琼脂的用量一般为1.52.0%。由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于微生物的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方：牛肉膏 3.0g蛋白胨10gNaCl5.0g琼脂1520g水1000mLpH7.07.2如果不加琼脂，则为液体培养基；加琼脂量为0.30.5%，则为半固体培养基。【实验器材】1.高压蒸汽灭菌

10、锅，电炉，石棉网，电子天平，牛角匙，搪瓷缸，称量纸，pH试纸，棉塞，牛皮纸，线绳，记号笔。2.小烧杯，量筒，玻璃棒，培养基分装装置，试管，三角瓶，滴管。3.牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1 N NaOH, 1 N HCl。【方法与步骤】1.配制培养基所用器皿的准备（实验指导老师演示）（1）玻璃器皿的包装与灭菌试管和三角瓶；培养皿；移液管。（2）棉塞的制作2.牛肉膏蛋白胨培养基的制备（1）称量在搪瓷缸中先加入少于所需要的水量，再按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入搪瓷缸中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小烧杯中称量，用热水溶化后倒入搪瓷缸。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中

11、，稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。（2）溶化将上述搪瓷缸放在电炉上加热，并不断搅拌，使药品完全溶解。待水煮沸后，将称好的琼脂放入，继续加热，用玻璃棒不断搅拌，以免糊底。在加热过程中注意控制火势，防止培养基溢出。最后补足水分到需要的总体积。同时制作液体培养基和半固体培养基。（3）调pH先用pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1 N 的NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测量其pH值，直至pH达7.2。反之，则用1 N 的HCl进行调节。注意pH不要调过了头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

12、（4）分装将配制好的培养基分装入15×150mm的试管中，每管约5mL,共装20管。余下的分装入300mL的三角瓶中，每瓶约150ML。（5）加棉塞与包扎培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞。试管每10支一捆，再在棉塞外包一层牛皮纸，然后用线绳扎好，使用时容易解开。最后，在牛皮纸上用记号笔注明培养基名称、组别、日期。（6）灭菌将上述培养基以0.100MPa压力，灭菌2030分钟。（7）摆斜面和倒平板将灭过菌的培养基冷至50左右，将试管棉塞端搁在玻璃棒上，使斜面长度不超过试管总长的1/2为宜。【实验结果】将灭菌冷却后的培养基放入37温箱中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。

13、【注意事项】1.称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净擦干，再称取另一种药品。药品瓶盖也不要盖错。2.分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免玷污棉塞而引起污染。【思考题】1.培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？3.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？实验四 高压蒸汽灭菌【实验目的】1.掌握高压蒸汽灭菌的操作方法。2.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；【实验原理】高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待

14、水蒸汽急剧的将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能逸出，而增加了灭菌锅内的压力，提高水蒸汽的温度，从而导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三个：（1）在湿热条件下，菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，实验结果表明，蛋白质的含水量与其凝固温度成反比，即含水量越高，凝固温度越低。（2）湿热的穿透力比干热大。（3）湿热的蒸汽有潜热存在，当被灭菌物品的温度比蒸汽温度低时，蒸汽在物品表面上凝结为水，同时放出潜热，这种潜热能迅速提高灭菌物品的温度，直至与蒸汽的温度相等，达到平衡为止。高压蒸汽灭菌的关键是彻底排净冷空气。因为空气是

15、热的不良导体，如不把空气排净，当灭菌锅内的压力升高后，它们便聚集滞留在灭菌锅的中下部，围绕在被灭菌物品的周围，使饱和蒸汽难与灭菌物品接触。此刻，虽然灭菌锅的压力表读数符合灭菌要求，但实际上被灭菌物品的温度却达不到预期的要求，因而难以灭菌彻底（见表4.1）。表4.1 空气排出的程度与温度的关系压力数（MPa）不同量空气排出时灭菌锅内温度（）完全排出排出2/3排出1/2排出1/3完全不排除0.035108.81009490720.070115.2109105100900.105121.31151121091000.140126.21211181151090.175130.0126124121115

16、0.210134.6130128126121排出灭菌锅内空气的方法有两种：第一种：加热开始，关闭排气阀，当压力上升到0.0200.030MPa时，打开排气阀，使锅内的空气和水蒸气一同排出，直至压力表的压力恢复到零。然后再关闭排气阀，这样重复23次即可排净锅内的空气。第二种：打开排气阀，开始加热，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待排气阀有大量蒸汽冒出时，再继续排气10分钟，这是锅内冷空气已完全排尽，再关闭排气阀。 一般培养基在0.100MPa（约相当于1.05kg/cm2或15磅/英寸2）压力下处理，1530分钟可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。

17、例如含糖培养基用0.056MPa（0.56kg/cm2或8磅/英寸2），112.6灭菌15分钟，但为了保证灭菌效果，可将其它成分先行0.100MPa，20分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以0.100MPa灭菌20分钟即可，而盛于大容器内的培养基应灭菌30分钟。蒸汽压力所用单位为MPa（兆帕），它与kg/cm2（千克/厘米2）、1b/in(磅/英寸2)和温度的换算关系见表4.2。表4.2 蒸汽压力与蒸汽温度换算关系大气压蒸汽压力蒸汽温度Kg/cm2MPa1b/in21.000.000.000.00100.01.250.250.0253.75107.01.500

18、.500.0507.50112.01.750.750.07511.25112.02.001.000.10015.00121.02.501.500.15022.50128.03.002.000.20030.00134.5注：1大气压=101325Pa； 1kg/cm2=98066.5Pa； 1b/in2=6894.76Pa实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种，其构造如图5.2。本实验介绍手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。 【实验器材】手提式高压蒸汽菌锅，待灭菌的培养基或玻璃器皿。【方法与步骤】1. 加水先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。 2.

19、装料放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 3.加盖密封将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 4.排气升压接通电源进行加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后（约10分钟），关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制电源，维持压力至所需时间。5. 降压达到规定的灭菌时间后，切断电源，让其自然降压冷却。6. 取料待压力完全降至“0”时，打开排气阀，

20、旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品。如果压力未降到“0”时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶口或试管口，造成棉塞沾污培养基而易发生污染。7. 倒水灭菌锅用过之后，将锅内剩余的水倒掉，以免日久腐蚀。【实验结果】将灭菌冷却后的培养基放入37温箱中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。【注意事项】在压力上升之前，必须将锅内的冷空气完全排除，否则，虽然压力表已指示0.100MPa，但锅内的温度却只有100，往往会造成灭菌不彻底。【思考题】1.高压蒸汽灭菌前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？2.培养微生

21、物的培养基应具备哪些条件？为什么？3.高压蒸汽灭菌和干热灭菌的温度要求为什么不一致？实验五 细菌的人工培养【实验目的】1.掌握细菌的常用接种方法。2.理解细菌在不同培养上的生长现象。【实验原理】细菌的接种方式因各种培养基的不同而异。【实验器材】1.肉汤培养基（1）成分：新鲜绞碎牛肉50g，（或牛肉膏0.5g），蛋白胨1g，氯化钠0.5g，蒸馏水100mL。（2）方法：取新鲜牛肉50g去脂肪、筋膜，绞碎。加水100mL，搅匀，置冰箱过夜，次日取出，煮沸半小时，用脱脂棉和脱脂纱布过滤，并补足水分至原来的量，即为牛肉浸液。再加入蛋白胨、氯化钠，加热使之完全溶解，调整PH值至7.67.8，煮沸10分钟

22、，过滤，分装，高压灭菌后备用。2.琼脂培养基（1）固体培养基：在肉汤培养基中加入2%3%琼脂，融化后调整PH值至7.67.8，分装，高压灭菌，在室温下凝固即为固体培养基，有平板、斜面和琼脂高层等数种。（2）半固体培养基：如果在肉汤培养基中加入的琼脂量为0.3%0.5%，如上炮制，灭菌后取出直立冷却，即为半固体培养基。（3）血液琼脂培养基：有些细菌营养要求比较高，在普通的琼脂培养基上不能很好生长，需用血液琼脂培养基进行培养。将预先制备好的普通固体培养基100mL加热融化，待冷却到50左右时，用无菌操作法加入810mL的脱纤维兔血和羊血，混匀后倒入无菌平皿或试管中，冷却后即为血平皿或血琼脂斜面培养

23、基。【方法与步骤】1.琼脂斜面的接种方法（1）用灭菌接种环取少量细菌培养物。（2）左手握斜面培养管下端，斜面向上。（3）右手小指拔出斜面培养管的硅胶塞，管口经火焰灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下而上在琼脂上蜿蜒划线。注意不要划破培养基。（4）接种后管口在火焰上灭菌，塞好硅胶塞，接种环灭菌。（5）将斜面37培养24小时后观察细菌在斜面上的生长情况2.液体培养基接种法（1）用灭菌接种环取菌（链球菌，大肠埃菌，枯草杆菌等）培养少许。（2）按无菌操作法将沾有细菌的接种环按图23-2在倾斜的接近液面的管壁上轻轻涂抹研匀，试管直立使沾附在管壁上的细菌混入液体即可。（3）接种完毕将试管置37培养24小

24、时，观察上述细菌在液体培养基中的生长状况。3.平板划线接种法：本法要求通过划线将混杂的细菌在平板上分散开来，并在平板上长成菌落，以达到分离培养获得纯培养物的目的。具体的方法有两种；（1）平行划线法；左手斜持平板底，右手持接种环。接种环在火焰上灭菌，冷却后，沾取一接种环菌液，先在平板的一端涂开，然后由此向下平行密集划线，约占平板的一半。将平板转180°角，从平板的另一端开始平行密集划线，直至划满平板的剩余部分。置37温箱培养。（2）分区划线法：右手将接种环按无菌操作法沾少许培养物（金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌），左手拿平板略打开，将标本涂于平板的一侧边缘，应用腕力连续划线（要密但不要重叠，

25、不要划破培养基），划线范围约占平板面积的4/1。重复上述操作，划完整个平板。将平板放在37的温箱内，1824小时后观察各区细菌生长情况，有无单个菌落，以及菌落的颜色，形态等。比较金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌，苦草杆菌的菌落特点。4.半固体接种法：左手持半固体培养管，右手持接种针，火焰灭菌冷却后，挑取细菌（大肠埃希菌，痢疾杆菌等），垂直刺入半固体培养基中心，至进管低处，然后循原路退出。塞上硅胶塞，接种针重新灭菌。接种完毕，于37培养1824小时，观察细菌生长情况。比较大肠埃希菌和痢疾杆菌（或葡萄球菌和变形杆菌）在半固体培养基的情况。【实验结果】如实观察并记录上面培养基上的生长现象和特点。【注意事项】

26、注意实验安全，勿让酒精灯灼伤皮肤。【思考题】1.何谓细菌的人工培养，根据培养基的性质和用途可将培养基分为几类？请各举一例。2.如何观察细菌在人工培养基上的生长现象？实验六 细菌生长曲线的鉴定【实验目的】1.掌握利用细菌悬液的混浊程度间接测定生长的方法。2.了解细菌生长曲线的基本特征；【实验原理】将一定数量的微生物，接种于合适的新鲜液体培养基中，在适宜的温度下培养，以菌数的对数作纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线叫生长曲线。一般可分为四个时期：即延迟期、对数期、稳定期、衰亡期。不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和

27、掌握微生物的生长规律是很有帮助的。测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数板法、平板菌落计数法、称重法、比浊法等。本实验采用比浊法测定，混浊的溶液能吸收光线，浑浊度越大，吸收光线越多，透过的光线越少，透过的光线通过光电池时，光能变成电能，产生电流，可由检流计读出。由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此可利用广电比色法测定菌液的光密度（OD值）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。现已有直接用试管就可以测定OD值的广电比色计，只要接种一只试管，定期用它测定，便可绘出该菌的生长曲线。此外也可采用具有侧壁试管的三角瓶进行。【实验器材】1.721型分光光度计，自控水浴振荡器或摇床

28、，1mL无菌移液管。2.盛有5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的大试管。3.培养18小时的大肠杆菌培养液。【方法与步骤】1.编号取11支盛有牛肉膏蛋白胨液体培养基的大试管，用记号笔标明时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20小时。2.接种用1支1mL无菌移液管，向上述各管准确加入0.2mL培养18小时的大肠杆菌培养液，轻轻振荡，使菌体分布均匀。3.培养将接种后的11支试管置于自控水浴振荡器或摇床上，37振荡培养。分别在0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20小时将编号为对应时间的试管取出，立即置冰箱中贮存，最后一起比浊测定光密度值。4.比浊测定以未接种的牛肉膏

29、蛋白胨液体培养基做空白对照，选用540560nm波长进行光电比浊测定，从最稀浓度开始依次进行测定，对浓度大的菌液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.10.65内，记录OD值时，注意乘稀释倍数。【实验结果】1.将测定的OD值填入表中 表6.1 不同培养时间的大肠杆菌菌液的光密度时间01.534681012141620OD值2.绘制大肠杆菌的生长曲线，标出曲线中曲线中四个时期的位置及名称。【注意事项】注意721型分光光度计的使用方法。【思考题】1.为什么说用比浊法测定细菌的生长曲线是表示相对生长状况？如欲测定微生物活菌数应采用何种方法？2.在生长曲线中为什么会出现稳定

30、期和衰亡期？细菌群体生长规律在生产实践中有什么指导意义？实验七 抗生素效价的生物测定【实验目的】1.掌握抗生素效价生物测定（管碟法）的基本原理和方法。【实验原理】抗生素的微生物测定方法有稀释法、比浊法和琼脂扩散法。本实验采用国际上最普遍应用的琼脂平板扩散法来测定青霉素效价。其原理是将规格一定的不锈钢小管（牛津杯）置于带菌琼脂平板上，管中加入抗生素检测液，在室温下扩散一定时间后放入温箱中培养。在菌体生长的同时，被测抗生素扩散到琼脂平板内，抑制或杀死周围菌体，从而产生不长菌的透明抑菌圈。在一定的范围内，抗菌物质的浓度（对数值）与抑菌圈直径呈直线关系。因此，根据抑菌圈直径的大小，可以求出相应的抗菌物

31、质的效价。【实验器材】1.离心机，光电比色计，水浴锅，不锈钢小管（牛津小杯，内径6+/-0.1mm，外径8+/-0.1mm，高10+/-0.1mm），培养皿（直径90mm，高20mm，要求大小一致，皿底平坦），移液管，滴管，试管等；2.细菌传代培养基，生物测定用培养基，1%pH6.0磷酸缓冲液，0.85%NaCl溶液，苄青霉素钠盐1667单位/mL。【方法与步骤】1.青霉素标准溶液的配制表7.1 绘制标准曲线用的不同浓度青霉素溶液配制试管号青霉素溶液浓度（u/mL)10u/mL青霉素标准液（mL）pH6磷酸缓冲液（mL）10.40.49.620.60.69.430.80.89.241.01.0

32、9.051.21.28.861.41.48.6准确称取苄青霉素钠盐1520mL，溶液在一定量的pH6磷酸缓冲液中，使成2000单位/mL的青霉素溶液。然后依次稀释，配成10单位/mL青霉素标准工作液。按表10.4吸取青霉素标准液和缓冲液，配制成不同浓度的青霉素溶液。2.金黄色葡萄球菌悬液的制备在传代琼脂培养基上连续培养34代（37，1618小时/代）的金黄色葡萄球菌，用0.85%生理盐水洗下，离心沉淀，倾去上层清液，菌体沉淀再用生理盐水洗12次，最后将菌液稀释成1821亿个细菌/mL。3.青霉素标准曲线的制备（1）取无菌培养皿15套，按无菌操作吸取20mL已熔化并冷却至50左右的生物测定用培养

33、基，加入各皿中，待冷却后，即为底层培养基。（2）将生物测定培养基熔化并冷却至50左右，每100mL培养基内加入50%葡萄糖液1mL和金黄色葡萄球菌悬液35mL，摇匀放置50水浴锅内10分钟后，取4mL分别加入已凝固的底层培养基平板上，往复倾斜培养皿使上层培养基分布均匀。（3）待培养基完全凝固后，在每一个平板上轻轻放置不锈钢小管4只，小管间的距离应相等。（4）用带有橡皮乳头的无菌滴灌将青霉素标准溶液加于小管内。换上陶质皿盖，置37恒温箱内培养1824小时。（5）培养后取出，移去小管，精确量取抑菌圈直径，并将数据填入表7.2中。（6）计算并绘制出标准曲线。方法是先计算各组抑菌圈平均值，进一步计算出

34、各组1单位/mL的抑菌圈平均值和15套皿中1单位/mL的抑菌圈总平均值，以总平均值校正各组平均值得各组校正值。在双周半对数纸上以青霉素浓度为纵坐标，抑菌圈直径校正值为横坐标绘制标准曲线。举例：假设30个1单位/mL青霉素溶液抑菌圈直径的总平均值为22.6mm，第一组内6个1单位/mL青霉素溶液的抑菌圈直径平均值22.4mm，则：第一组的校正数=22.622.4=+0.2（mm）如果第一组内0.4单位/mL青霉素溶液抑菌圈平均值为18.6mm，那么经上述校正数+0.2mm校正后：第一组中0.4单位/mL青霉素溶液的抑菌校正值=18.6+0.2=18.8（mm）4.未知样品的生物学测定（1）取未知

35、样品（如发酵液），用1%pH6磷酸缓冲液进行适当稀释。（2）每一被检样品用3套培养皿进行测定。将青霉素标准工作液（1单位/mL）与被检样品的稀释液间隔地加于小管内。（3）37培养1824小时后量取抑菌圈直径。（4）以3皿青霉素标准工作液（1单位/mL）的平均值与标准曲线总平均值进行校正，得校正数，以此校正数求得被检品抑菌圈直径校正值。（5）从标准曲线上查取被检品稀释液的青霉素效价，乘以稀释倍数即得被检品的效价。计算举例：未知样1：200稀释液抑菌圈的直径为20.6mm，同一组培养皿内青霉素标准工作液（1单位/mL）的抑菌圈为22.8mm，而标准曲线上1单位/mL青霉素溶液的抑菌圈直径为22.6

36、mm，因此：它的校正数=22.622.8=0.2（mm），由此算出未知样1：200稀释液抑菌圈的校正值：校正值=20.6+（0.2）=20.4（mm）以20.4mm查标准曲线，假定为0.75×200=150（单位/mL）【实验结果】将实验结果填入表7.2中表7.2 青霉素生物测定标准曲线记录 年 月 日皿号青霉素浓度抑菌圈直径（mm）平均值（mm）校正值（mm）1u/mL青霉素抑菌圈直径（mm）平均值（mm）校正值（mm）10.42340.65670.889101.21112131.414151u/mL青霉素抑菌圈总平均值= mm【注意事项】1. 使用的不锈钢小管规格应一致，内外壁光

37、洁，两端平齐光滑，壁厚薄均匀一致。培养皿应大小一致，皿底平整。2. 恰当地放置不锈钢小管，防止放置时重力不一致；加药液要与不锈钢小管高度齐平。3. 每皿培养基加入量应准确一致，底层及菌层要铺平，双碟、刻度移液管要防止污染和残留微量抗生素。【思考题】1.抗生素效价测定中，为什么常用管碟法？2.管碟法测定抗生素效价时需注意哪些问题？实验八 放线菌和真菌的形态观察【实验目的】1.掌握常见真菌和放线菌的形态特征。2.熟悉生物显微镜的使用方法。【实验原理】丝状真菌和放线菌在形态上有较多相似之处，故放在同一个实验中进行观察。【实验器材】生物显微镜、擦镜纸、标本片（青霉、曲霉、白色念珠菌、新型隐球菌、放线菌

38、）等。【方法与步骤】显微镜下观察：1.放线菌的染色玻片标本。2.典型真菌（白色念珠菌、新生隐球菌、青霉、曲霉）的染色玻片标本并比较二者的区别。【实验结果】绘出显微镜下所见的曲霉、青霉、白色念珠菌的形态结构图，并标明放大倍数。【注意事项】注意实验安全，谨防感染真菌性疾病。【思考题】1.临床上的真菌病有哪些？如何预防？2.比较放线菌和霉菌的区别。实验九 寄生虫的形态观察【实验目的】1.掌握常见医学寄生虫生活史各期的形态特征。2.熟悉生物显微镜的使用方法。【实验原理】寄生虫虫卵较小，肉眼不能直接观察，通过显微镜放大后观察其形态结构。【实验器材】1.生物显微镜、擦镜纸2.标本片（肝吸虫卵、姜片虫卵、肺

39、吸虫卵、血吸虫卵、绦虫卵、曼氏迭雷绦虫卵、蛔虫卵、受精蛔虫卵、未受精蛔虫卵、钩虫卵、蛲虫卵、鞭虫卵、蚝虫卵、库蚊雌、库蚊雄）等。【方法与步骤】1.典型寄生虫大体标本示教。2.典型寄生虫虫卵的镜检。【实验结果】按显微镜下所见之受精蛔虫卵和受精蛔虫卵绘图，并注明其形态结构名称和放大倍数。【注意事项】注意实验安全，谨防寄生虫感染。【思考题】1.为什么蛔虫病流行广泛？ 2.举例说明不同种类的吸虫导致的典型疾病。实验十 ELISA法测定乙肝【实验目的】了解ELISA的类型，双抗原夹心法的操作方法、结果观察及实际应用。【实验原理】酶联免疫吸附试验是一种用酶标化抗原或抗体，以提高抗原抗体反应的灵敏度的免疫学

40、检测方法。本技术具有敏感性高，特异性强，易观察结果，便于大规模检测的特点。ELISA的类型有间接法、双抗体夹心法、抗原竞争法等。双抗体夹心法是将抗原结合于已预先包被的已知抗体上，再以酶标抗体与抗原结合，通过观察酶对底物的催化反应所产和的颜色变化，来判断抗原的存在及含量。本实验采用双抗原夹心法原理定量检测人血清或血浆中的乙肝表面抗体(HBsAb)。【实验器材】1.乙肝表面抗体(HBsAb)酶标试剂盒，内含：已包被HBsAg微量反应板、阳性控制血清、阴性控制血清、酶标HBsAg、酶底物A、酶底物B、中止液、洗涤液。2.待检血清。3.微量加样器、吸头等。【方法与步骤】1.于已包被微量反应板试验孔中加

41、入待检血清50l，每份血清加二孔。每块板做阳性、阴性及空白对照各一孔。2.每孔中各加酶标HBsAg 50l（1滴）。3.置37温箱20分钟。4.甩干微孔中液体，每孔均加满洗涤液15秒后甩干，反复洗涤5次。5.每孔中各加显色剂A、B各50l，置37温箱避光15分钟。6.每孔各加中止液1滴。【实验结果】肉眼判断时，待检孔颜色与阴性对照孔颜色相同或更浅判为阴性；若待检孔颜色明显加深，判为阳性。写出你自己（或者邻近的同学）的检测结果及分析可能的原因。【注意事项】1.准确加样。2.每次涤液15秒后应甩干。3.严格掌握置37温箱的时间。【思考题】1.ELISA法有哪几种类型？其原理是什么？2.ELISA测定乙肝操作过程中应注意哪些事项