光学分析法-2

1、第二章 双波长分光光度法与导数光谱法单波长分光光度法物质对紫外-可见辐射有选择的吸收分光光度法单波长双光束分光光度计原理双光束分光光度计把来自单色器的单色光,通过旋转镜和反光镜转变为分时空交替照射到参比光路和样品光路的两光束,然后这两光束又分时交替地照射到同一检测器上.原理把 来自光源的光束经单色器色散后,分离出所需要的单色光(),经反射镜(M1)分解为两束强度相同的光束(I0),分别通过样品池(S)和参比池(R) 后成为IS 和IR,这两束光在平面反射镜M3和M4的作用下,重新汇合为同一方向后投射到光电倍增管上.单波长双光束分光光度计原理示意图单波长分光光度法定量分析的理论基础n参比光路:A

2、R=log(I0/IR)=abc0n样品光路：As=log(I0/IS)=abcsn输出信号为：A=AS-AR=log(IR/IS)=abc 式中： b-吸收池长度（cm）na-吸收系数，与波长有关nC0-参比液中试剂空白Cs-试样溶液中含待测物浓度传统的单波长分光光度法的局限性1.多组分的测定(光谱相互重叠,相互干扰)2.复杂样品(参比难寻)3.测定混合样品中低含量的组分单波长分光光度法双波长分光光度法双波长分光光度法的工作原理原理:从光源发射出来的光束,分别经过两个可调节的单色器,得到两束不同波长的单色光,利用斩光器,使两束光分别交替地照射到同一个吸收池上,然后光电倍增管交替地接收到通过样

3、品池的信号,再经过电子线路装置转换为它们的吸光度差A.A1=-log =a1bc+As在2处有关系式：A2=-log =a2bc+As上式中a1 ，a2为待测物在1和2的吸收系数，As,As为光散射或背景吸收.-log(I2/I1)= A2 -A1=A=( a2 -a1)bc+(As1-As)设开始时使交替照射的两道单色光1(为参比波长)和2(测量波长)的强度都为I0,那么在1处有关系式：I1I0I2I0如果选择合适的波长使AsA s，通过吸收池的两道光束的光信号差：-log = A2 -A1=AI2I1A=( a2 -a1)bc双波长测定方法-（1）等吸收点法n等吸收点:指在某一波长上的吸光

4、度不随浓度的变化而发生改变.n如果吸光物质在不同浓度的吸收曲线有若干个等吸收点,可以选择其中一个等吸收点处的波长作为参比波长（1），与吸收物质的吸收峰波长（2 ）组合。n左图是用羧基偶氮胂测定镝时，由吸收曲线确定合适的波长对（ 1 =590nm,2 =660nm)n吸收线1-5分别含镝1，2，3，4，5 g.（2）无等吸收点n被测物质没有明显等吸收n点，可在吸收曲线另找一n合适参比波长1，这样测n得的A值可以扣除背景吸n收。以配合物最大吸收峰为测量波长(2),试剂最大吸收峰作参比波长(1),这样测得的吸光度是试剂吸收的减少和配合物吸收增大的总和.（3）双峰双波长法双组分的测定-（1）等吸收法n

5、对于双组分体系中某一组分的测定,实质上在测定任一组分时,要选择两个合适的波长,使另一组分在这两个波长处具有相等的吸光度,以达到消除干扰的效果.对于含有吸收光谱相互重叠的A,B组分来说,选择波长必须考虑两个条件:.B组分在两个波长处的具有相同的吸光度,即AB=0.尽可能使被测组分A在这两个波长处的吸光度差值足够大.右图为在偶氮胂存在下测定偶氮胂(x为偶氮胂,y为偶氮胂) 以偶氮胂的最大吸收波长为测量波长(2), 在这一波长位置作一垂直线交X轴,此直线与偶氮胂的吸收曲线交于某一点P,从P点作一条平行于X轴的直线,与偶氮胂的吸收曲线相交于Q点,选择Q的波长为参比波长参比波长(1).波长组合初选-作图

6、法扫描法-将一波长固定,另一波长通过波长扫描获得.扫描法是以不同浓度的溶液扫描,进一步验证组分浓度改变时是否可能由聚合,缔合等作用而引起对吸光度差值(A)的影响.下图是以苯酚-三氯苯酚体系扫描法选定波长示意图,选定苯酚的吸收波长270 nm作为测定波长2, 然后固定苯酚浓度,改变三氯苯酚浓度进行波长扫描,获得一系列吸收曲线,得到另外两个等吸收点286nm和325nm,可作为参比波长1扫描法扫描法测定波长,2固定在270nm, 1通过扫描法确定.1-4吸收曲线对应的三氯苯酚浓度:10,20,30,40g/mL,R为基线.227011扫描法固定初选的测量波长(2)不变,A 2Ai= A 2i -

7、A 1i(参比波长在初选波长1附近以小于1.0nm 间隔变化)配制不同浓度的干扰组分参比波长暂定在初选波长(1), A 1Ax= 0 (2, 1x)(2, 1x,y,z)波长组合精选法(2, 1a)（2）系数倍率法在共存组分没有吸收峰，这样等吸收法就无法采用。原理：由两道单色光（ 1和2）分时地通过吸收池后到达光电倍增管。这两个信号经对数转换器转换成吸光度，并分别用函数发生器加以不同程度的放大，在差分放大器得到差示信号S. S=K2A2 K1A1A2 和A1是 混合物在2和1处吸光度K2，K1分别在2和1的放大系数。A1=a 1+b1，A2=a 2+b2a 1 和a 2表示x组分在1和2上的吸

8、收,b 1 和b2表示y组分1和2上的吸收,S=K2A2 K1A1 = K2（ a2 +b2）K1 （ a1 +b1） = (K2a2 K1 a1) +(K2b2- K1 b1)K2b2- K1 b1=0S =K2a2 K1 a1S=(K2a2 K1 a1)bca2 , a1为对应的摩尔吸光系数系数倍率法的仪器装置示意图光源差分放大器函数发生器对数转换器单色器斩光器吸收池光电倍增管前级放大器脉冲信号A1=A x1+Ay1 +Az1A2=Ax2+Ay2 +Az2Y,Z交于1 ,2处,三组分测定三组分混合物中测定X组分A = KA2 - A1 = K(A x2+Ay2 +Az2) - (Ax1+A

9、y1 +Az1) = (KAx2 - Ax1)+(KAy2 -Ay1)+(KAz2 - Az1)KAy2 -Ay1=0, KAz2 - Az1=0A= KAx2 - Ax1三组分测定双波长法的应用-（1）混浊背景的双波长法溶液中固体微粒,如环境水样中的混浊物,生物试剂中的细胞色素,线粒体等混浊背景混浊溶液因其固体颗粒大小和不同光谱区所产生的光散射强度不同.特别在紫外区,光散射强度随波长向紫外区移动而增强.参比难寻双波长法测定特点无双波长分光光度计单波长分光光度计选择测量波长(2)和参比波长(1)A=A2-A1准确度较低,手续烦琐测定愈疮木酚-4-磺酸钾时,可选择1 -2波长组合,此时另一组分在

10、这两个波长的吸光度差为0.(1为愈疮木酚-4-磺酸钾; 2为愈疮木酚-5-磺酸钾)（2）.混合组分测定-(测定感冒剂中愈疮木酚磺酸钾的两种异构体)1单组分的双峰双波长测定应用试剂最大吸收峰为参比波长(1),配合物最大吸收为测量波长(2)定义 对于背景深的溶液,单波长法测量方式是以固定试剂量作参比的,在一系列浓度中,随着浓度的增加则消耗显色剂的量也增加,然而在整个系列中都扣除固定的显色剂的量必然使分析校正曲线斜率下降.不仅消除显色剂深背景的影响,而且在不同程度上提高方法的灵敏度原因.在双峰双波长位置有最大吸光度差值 公式nA= A2 (-A1)= A2 +A1优点提高灵敏度原因:.双波长法可以提

11、高分析校准曲线斜率以二甲苯胺蓝测定镁为例,.1线和3线斜率相同,仅参比溶液不同,当1线减去固定试剂空白的吸光度值得3线.2线是以相应过剩显色剂作参比测定结果,既1线减4可得2线.2线与3线相比,2线的斜率大大高于3线.1-Mg-R(水参比),2-Mg-R(相应过剩R作参比),3-Mg-R(固定R作参比),4-R(水参比)nA= a (-b)= a +b灵敏度提高倍数= a +ba双波长分光光度计的基本结构（1）.仅使用一个吸收池。（2）.可用于混浊样品，复杂样品中特定组分的测定。（3）.信号差，不受光源电压和外部电源变化的影响。（4）.可以追踪化学反应。双波长分光光度法的特点于存在背景吸收曲线

12、上取R,M 和P三点作一直线以待测物的吸收波长（2）,另找 1 和3为校正波长，则分析物的准确吸光度为：式中，m为2 和3的差值；n为1 和2的差值； 1 ， 2 和 3 分别为待测物在三个波长处的摩尔吸光系数；C为待测物浓度，b 吸收池厚度。三波长分光光度法的基本原理三波长法中三个波长的选择等吸收点法和计算法等吸收点法如果在干扰组分的吸收光谱上能找到三个等吸收点,而且在此三波长处测得的待测组分A值较大.如选择的三个波长相应于干扰物吸收曲线上三点处于一条直线上,则测得干扰物的A为0.当干扰组分的吸收曲线为一直线(如浑浊产生的干扰, 右图),则在任选的三个波长处测定,测得的A与干扰物浓度无关.测

13、得的A只与待测组分的浓度有关.干扰物为一吸收曲线(如右图),在曲线上找到处在一条直线上的三点,在此三点相应的波长处测定.干扰物在此三波长处的A为0,导数分光光度分析浑浊样品测定信号被强吸收信号所淹没的弱吸收 1955年Giese等提出改进分光光度计的信号处理系统,为处理分辨波长相近的谱线,将透光强度对波长进行一次微分,可以得到不同高度,半宽度和间距不同的导数光谱图.导数分光光度法的基本原理I0,I分别为入射光强度和透射光强度,为摩尔吸光系数,b为吸收池厚度,C为待测组分浓度.一次微分从上式可知,I和是波长的函数,I的一阶导数值与浓度呈线性关系,灵敏度(一阶导数值的大小)决定于摩尔吸光系数对波长

14、的变化率 最大时,灵敏度最大.结论二次微分当 时,I的二阶导数值与浓度呈线性关系结论三次微分当 时, I的二阶导数值与浓度呈线性关系结论四次微分当 时, I的四阶导数值与浓度呈线性关系结论具有导数光谱测量装置的分光光度计,一般将信号作对数转换,用吸光度进行微分处理,即 A的n阶导数值始终与待测组分的浓度成正比,且在n阶导数值最大时,灵敏度最大.一阶导数曲线的零点对应于吸收曲线的吸收峰一阶导数曲线的零点对应于吸收曲线的吸收峰一阶导数曲线和吸收曲线的比较dA/d=(dA/dt)/(d/dt)获得导数光谱的方法-（1）.电子微分这种模拟微分电路的特点： (1) .在微分过程申，在实现信号微分的同时也

15、实现信号的放大，从而显著地提高了测量灵敏度，灵敏度提高2-3个数量级。 (2).微分电路的放大与输入信号的频率有关，通过选择不同的放大倍数，可提高分析选择性，消除低频背景干扰。 (3).导数值与待测组分浓度成线性关系，可用于定量分析 (4).将n个模拟微分电路串联起来，就能得到n阶导数光谱,将一般自动记录式分光光度计的主机、记录仪及模拟微分电路加以组合，容易实现高阶微分，装置比较简单“便宜。根据导数的定义,在实际工作中,不可能接近于0,而是一个有限的正整数,因此,在计算机中导数的测量转化为离散的差分形式:2）.数值微分法为调制频率.t为时间1处用泰勒级数展开得到强度分布,如果对含有t, 2t,

16、3t的成份进行检波，即可获得一阶，二阶，三阶 导数信号。(3).波长调制法根据需要, 预先使两个单色器的波长差= 2- 1,固定在足够小(只有1-2nm),可视为A/=dA/d,若在扫描时保持为常数c,即dA/d=A/c.因此,即可沿吸收曲线连续记录恒定波长间隔所产生的吸光度差来获得导数曲线.（4）.双波长扫描法400450500/nmAmax0左图给出了吸收光谱和相应的一至四阶导数光谱，这些导数光谱具有以下特征： (1).零阶曲线的极大处，相应于奇阶导数(n=1，3，5)曲线零点;零阶曲线的拐点处，相应于奇阶导数曲线的极大或极小，这有助于精确确定吸收峰的位置和肩的存在。 吸收光谱与导数光谱的

17、峰和谷的关系（a.吸收光谱，b-e.一至四阶导数光谱）零阶曲线极大处零阶曲线拐点01234 (2).偶阶导数(n=2,4 )曲线的形状与零阶曲线较为相似，零阶曲线的极大处相应于偶阶导数曲线的极大或极小，零阶曲线的拐点相应于偶阶导数曲线通过零点。 零阶曲线极大处零阶曲线拐点01234 (3).谱带的极值数随导数阶数的增加而增加，一个吸收带经过n次求导后,产生 的极值(包括极大和极小)数为n十 1个。 (4).在导数曲线中,随着求导阶次的增加,谱带变锐,带宽变窄,二阶导数曲线的半宽度仅为零阶曲线半宽度的1/3,四阶导数曲线仅为零阶曲线半宽度的1/5。04321极值数515234峰数1234（1）.

18、切线法 对相邻两峰 (谷)作切线，测量两峰闸的谷(峰)至切线间的距离(图中的b 线). 此法适合于有线性背景的情况，只要基线平直，不论其是否倾斜，都能得到正确的结果。导数光谱的测量(2)峰-峰法 通过测量相邻峰谷间的距离（正峰和负峰之和）来进行定量分析 (图 中的a或 c线)，这是最常用的方法，灵敏度高。(3)峰-零法 在基线平坦时，测量峰至基线间的距离，如图中的d线此法灵敏度较低，但选择性较好,测量精度较高。.零点法(或基线相交法) 一个高斯型谱带经n次求导后,得到n个零点,如果干扰组分的导数曲线和基线相交处的波长恰好等于或接近于待测组分的导数曲线的极值波长,就可测量此波长处待测组分的导数值来进行定量分析.面积法 根据一阶导数曲线的面积正比于待测组分的浓度以进行定量分析. 导数光谱对微弱信号有放大作用，两个频率不同的峰形的光谱经求导后，高频的弱吸收峰被放大，而低频的强吸收峰反而降低。 对高斯形谱带，经过n次求导后，其振幅An反比于原谱带半峰宽 的n次方:当等高不等宽的两谱带重叠时，经过n 次求导后，窄带X比宽带Y的导数光谱放大：导数分光光度法的特点（1）.对弱信号的放大作用假如相互重叠的两个组分(