第三章固定化

1、Enzyme Engineering酶工程掌握固定化生物催化剂的概念以及吸附法、包埋法、共掌握固定化生物催化剂的概念以及吸附法、包埋法、共价结合法、无载体固定化酶的基本技术和原理。价结合法、无载体固定化酶的基本技术和原理。重点与难点重点与难点教学目的教学目的 1、固定化酶的NCF和CF的关系及其应用；2、高效、高效固定化酶的原则；3、为什么包埋法在实际工作中广泛应用？它如何与交、为什么包埋法在实际工作中广泛应用？它如何与交联法结合以改善缺点。联法结合以改善缺点。课堂教学设计课堂教学设计 讲授和自学相结合。自行比较总结各种固定化酶方讲授和自学相结合。自行比较总结各种固定化酶方法的优缺点。设计包埋

2、法或结合交联法固定细胞的试验法的优缺点。设计包埋法或结合交联法固定细胞的试验方案。方案。教学时数教学时数 5学时学时思考题思考题固定化酶属于修饰酶吗？固定化与酶的化学修饰在方法上有何异同？固定化酶活力、稳定性、专一性等特性发生了哪些改变？为什么？固定化酶的实际反应速率不同于固有速率？原因何在？针对目前的研究现状，你认为可以从哪些角度来深入固定化酶技术的研究？请说明其理由。试述固定化生物催化剂的应用。比较游离生物催化剂与固定化生物催化剂的应用。设计固定化系统时，如何从载体、酶、方法三方面考虑？除了固定细胞、酶，还可以固定其他吗？固定化酶活力的测定方法有哪些？简要叙述每种方法。 生物催化的类型与生

3、物催化的类型与 方式方式n1 类型：n 含酶整细胞：生长细胞、休止细胞、冻 干细胞、处理或修饰细胞。n分离纯化酶：细胞萃取液、纯酶制剂、处理或修饰酶、多酶系统。n2 方式：游离状态、固定化n3催化反应相:水溶液、含有机溶剂的水溶液、n水-有机溶剂的双相系统、有机溶液或水微溶有机溶液第三章第三章 固定化酶固定化酶n第一节第一节 概述概述n第二节第二节 固定化酶的性质及其影响因素固定化酶的性质及其影响因素n第三节第三节 固定化酶的制备固定化酶的制备n第四节第四节 固定化细胞固定化细胞n第五节第五节 固定化辅酶和原生质体固定化辅酶和原生质体n第六节第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）酶反应器和固定化酶

4、（细胞）的应用的应用什么是固定化酶？处于闭锁状态并能发挥催化作用的酶。水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术第一节第一节 概述概述二二 固定化酶的优缺点固定化酶的优缺点n 多次使用多次使用 n 可以装塔连续反应可以装塔连续反应n优点：优点： 纯化简单纯化简单n 提高产物质量提高产物质量n 应用范围广应用范围广n缺点：缺点： 首次投入成本高首次投入成本高n 大分子底物较困难大分子底物较困难第一节结束第一节结束n点击返回第二节第二节 固定化酶的性质及其影响因素固定化酶的性质及其影响因素n一一 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的

5、因素n二二 固定化后酶性质的变化固定化后酶性质的变化n三三 评价固定化酶的指标评价固定化酶的指标一一 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素1 酶本身的变化，主要是由于活性中酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。等发生了变化。一一 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素2 载体的影响载体的影响n（1） 分配效应分配效应n（2） 空间障碍效应空间障碍效应n（3） 扩散限制效应扩散限制效应3. 固定化方法的影响固定化方法的影响二二固定化后酶性质的变化固定化后酶性质的变化n1 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，固定

6、化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降反应速度下降二二 固定化酶的性质固定化酶的性质2 固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响n（1） 操作稳定性提高操作稳定性提高n（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。贮存稳定性比游离酶大多数提高。n (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。n (4 ) 对分解酶的稳定性提高。对分解酶的稳定性提高。n（5） 对变性剂的耐受力升高对变性剂的耐受力升高2 固定化后酶稳定性提高的原因：固定化后酶稳定性提高的原因：na. 固定化后酶分子与载体多点连接。固定化后酶分子与载体多点连接。nb. 酶活力的释放是缓慢的。

7、酶活力的释放是缓慢的。nc. 抑制自降解，提高了酶稳定性。抑制自降解，提高了酶稳定性。3 pH的变化的变化nPH对酶活性的影响：对酶活性的影响：n（1） 改变酶的空间构象改变酶的空间构象n（2）影响酶的催化基团的解离）影响酶的催化基团的解离n（3）影响酶的结合基团的解离）影响酶的结合基团的解离n（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。不能生成产物。固定化酶固定化酶pH的变化的变化n1） 载体带负电荷，载体带负电荷，pH向碱性方向移动向碱性方向移动。 n微环境微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶是指在固定化酶附近的局

8、部环境，而把主体溶液称为液称为宏观环境。宏观环境。3固定化酶固定化酶pH的变化的变化n载体带正电荷，载体带正电荷，pH向酸性方向移动。向酸性方向移动。n（2）产物性质对）产物性质对pH的影响的影响n催化反应的产物为酸性时，固定化酶的催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的值比游离酶的pH值高；反之则低值高；反之则低4 最适温度变化最适温度变化n一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。n5 底物特异性变化底物特异性变化n作用于低分子底物的酶作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化特异性没有明显变化n既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物

9、的酶既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。特异性往往会变化。6 米氏常数米氏常数Km的变化，的变化，Km值随载体性质变化值随载体性质变化由于分配效应：由于分配效应：=Si=Si微环境微环境/S/S宏观环境宏观环境 Km=Km/(Km=Km/(表观米氏常数表观米氏常数) )n（1 1） 载体与底物带相同电荷，载体与底物带相同电荷，SiS,KmSiS,Km固定化酶降低了酶的亲和力。固定化酶降低了酶的亲和力。n（2 2） 载体与底物电荷相反，静电作用，载体与底物电荷相反，静电作用，SiSSiS，则，则1,Km1,KmKm米氏方程推导米氏方程推导n对简单的固定化酶系统，其动力

10、学性质一般服从米对简单的固定化酶系统，其动力学性质一般服从米氏方程：氏方程： 三三 评价固定化酶的指标：评价固定化酶的指标：n1 酶活定义（酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。个酶活单位。n 计量单位计量单位n2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位所具有的酶活力单位 品质的体现品质的体现三三 评价固定化酶的指标：评价固定化酶的指标：n1. 固定化酶的比活：固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶每

11、（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。活力单位。n 或：单位面积（或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。（酶膜、酶管、酶板）。n2. 操作半衰期操作半衰期：衡量稳定性的指标。衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（要的时间（t1/2）三三 评价固定化酶的指标：评价固定化酶的指标：n3. n4. n或称偶联效率，活力保留百分数。或称偶联效率，活力保留百分数。n5.相对酶活力：相对酶活力：具有相同酶蛋白（或具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与）量的固定化酶活力与游离酶

12、活力的比值称为相对酶活力游离酶活力的比值称为相对酶活力n 四四 固定化酶的活力测定方法介绍固定化酶的活力测定方法介绍n1. 振荡测定法：称取一定量的固定化酶振荡测定法：称取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶加入一定量的底物溶液，液， 一边振荡或搅拌，一边进行催化反应一边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量的反取出一定量的反应液进行酶活力测定。应液进行酶活力测定。n2. 酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中 让底物溶液以一定的流速流过酶柱让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流出的反应液收集流出的反应液 测测定其中产

13、物的生成量或底物的消耗量定其中产物的生成量或底物的消耗量 四四 固定化酶的活力测定方法介绍固定化酶的活力测定方法介绍n3. 连续测定法连续测定法n利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。力。n 第二节第二节固定化酶的性质及其影响因素提要固定化酶的性质及其影响因素提要n影响固定化酶性质的因素n固定化酶的性质n评价固定化酶的指标 酶本身的变化载体的影响固定化对酶活性的影响固定化对酶稳定性的影响最适pH的变化最适温度变化底物特异性与游离酶不同米氏常数Km的变化评价指标活

14、力测定方法第二节结束第二节结束n点击返回第三节第三节 固定化酶的制备固定化酶的制备n一一 一般方法及特点一般方法及特点n二二 酶的固定化方法酶的固定化方法一一 一般方法及特点一般方法及特点关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。研究、改进。1 四大类方法：四大类方法：n吸附法（包括电吸附法）吸附法（包括电吸附法）n结合法（无机多孔材料）结合法（无机多孔材料）n交联法（双功能试剂）交联法（双功能试剂） n包埋法（微胶囊法）包埋法（微胶囊法） 各类固定化方法的特点比较各类固定化方法的特点比较: 比较项目比较项目吸附法吸附法结合

15、法结合法 交联法交联法包埋法包埋法物理吸附物理吸附.共价键结合共价键结合离子键结合离子键结合 制备难易制备难易易易难难易易 较难较难较难较难固定化程度固定化程度弱弱强强中等中等 强强强强活力回收率活力回收率较高较高低低高高 中等中等高高载体再生载体再生可能可能不可能不可能可能可能 不可能不可能不可能不可能费用费用低低高高低低 中等中等低低底物专一性底物专一性不变不变可变可变不变不变 可变可变不变不变适用性适用性酶源多酶源多较广较广广泛广泛 较广较广小分子底物、小分子底物、药用酶药用酶2 选择方法依据：选择方法依据： n（1） 酶的性质酶的性质n（2） 载体的性质载体的性质n（3） 制备方法的选

16、择制备方法的选择3 固定化后酶的考察项目：固定化后酶的考察项目：n（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化测定固定化酶的活力，以确定固定化过过n程的活力回收率。程的活力回收率。n（2） 考察固定化酶稳定性考察固定化酶稳定性n（ 2） 考察固定化酶最适反应条件考察固定化酶最适反应条件二二 酶的固定化方法酶的固定化方法n（一）（一） 吸附法吸附法n（二）结合法（二）结合法n（三）交联法（三）交联法n（四）（四） 包埋法（包埋法（entrapping method）酶和细胞固定化示意图酶和细胞固定化示意图（一）（一） 吸附法吸附法n1 物理吸附：物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体利用各种固体

17、吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。吸附在其表面上。n（一）（一） 吸附法吸附法n常用载体：常用载体：n无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量物、硅胶。一般吸附量120.3-615营养要求营养要求简单简单简单简单复杂复杂光照要求光照要求大多数要光照大多数要光照不要求不要求不要求不要求对剪切力对剪切力敏感敏感大多数不敏感大多数不敏感敏感敏感主要产物主要产物色素、药物、香色素、药物、香精、酶等精、酶等醇、有机酸、氨基醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核酸、抗生素、核苷酸、酶苷酸、酶疫苗、激素、疫苗、激素、抗体、酶抗体、酶固定化

18、细胞的特点固定化细胞的特点n类型：类型：n生理状态：生理状态：n形状：形状：n使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性，使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性， 只要载体不解体，不污染就可以长期使用。只要载体不解体，不污染就可以长期使用。概念：概念：n固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。细胞固定化方法细胞固定化方法n吸

19、附法n包埋法吸附法吸附法n它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。 影响吸附法的主要因素影响吸附法的主要因素 n（1）Z-电位：电位： Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大电位能近似地代表表面电荷密度的大小小n（2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质n（3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料包埋固定法包埋固定法 n包理

20、法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。那样进行产物的发酵生产。 包埋法分类包埋法分类n常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺胶、明胶、聚丙烯酰胺n常用凝胶包埋法常用凝胶包埋法通过改变载体溶液参数包埋细胞通过改变载体溶液参数包埋细胞

21、n改变载体溶液、操作温度、盐浓度、改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和值和溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，将细胞包埋其中。将细胞包埋其中。研究热点研究热点光交联树脂包埋法光交联树脂包埋法 n例：相对分子量为例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，的光交联聚氨酯预聚物等，加入加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射的薄层，用紫外照射3min，就可制得，就可制得第四节固定

22、化细胞提要第四节固定化细胞提要n特点n方法n目的第四节结束第四节结束n点击返回第五节第五节 固定化原生质体和辅酶固定化原生质体和辅酶n一一 原生质体固定化的方法原生质体固定化的方法n制备原生质体制备原生质体将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液包埋法固定化包埋法固定化原生质体。原生质体。n关键：原生质体如何制备？关键：原生质体如何制备？二二 原生质体的制备原生质体的制备n将对数生长期的细胞收集将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压稳定剂悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中的高渗缓冲液中去细胞壁去细胞壁分离

23、纯化分离纯化得到原得到原生质体生质体-活性鉴定活性鉴定三三 酶解注意要点酶解注意要点n1 酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。n采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分合成，可以使酶插入。合成，可以使酶插入。n一般加入：巯基乙醇，一般加入：巯基乙醇，Triton-100,甘氨酸、青霉素。甘氨酸、青霉素。三三 酶解注意要点酶解注意要点n2 酶系选择：酶系选择：n溶菌酶溶菌酶n蜗牛酶蜗牛酶n葡聚糖酶葡聚糖酶n纤维素、半纤维素、和果胶酶纤维素、半纤维素、和果胶酶n3 酶浓度选择（酶浓度

24、选择（0.5%-1%）三三 酶解注意要点酶解注意要点n4 酶解温度和酶解温度和pHn5 酶解终点确定酶解终点确定四四 稳定剂（高渗溶液）要求稳定剂（高渗溶液）要求n1 加入的化合物对细胞和原生质体无毒性加入的化合物对细胞和原生质体无毒性n2 不会影响水解酶的活性不会影响水解酶的活性n3 对代谢产物无不良影响对代谢产物无不良影响四四 稳定剂加入操作注意点稳定剂加入操作注意点n1一定一定pH （酶和菌体活性最高）（酶和菌体活性最高） n2一定的浓度（过高浓度原生质体易脱水皱缩）一定的浓度（过高浓度原生质体易脱水皱缩）n3种类：无机盐种类：无机盐-对细菌对细菌n 有机物糖和糖醇有机物糖和糖醇-酵母酵

25、母n4易于渗入质膜、易于被原生质体和菌体分解的物质易于渗入质膜、易于被原生质体和菌体分解的物质不宜作为稳定剂不宜作为稳定剂五五 原生质体细胞活性的检测原生质体细胞活性的检测n1 荧光素双醋酸盐（荧光素双醋酸盐（FDA) 染色法染色法n2 酚藏花红染色法酚藏花红染色法n3 伊文思兰染色法伊文思兰染色法四四 辅酶固定化辅酶固定化n1 原因原因n有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应(递氢、递氢、递电子或递某些化学基团的作用）递电子或递某些化学基团的作用）n有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生有机辅因子在使用过程中要流失，并

26、且不能自行再生n有机辅因子价格昂贵有机辅因子价格昂贵n工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生辅酶固定化的方法：辅酶固定化的方法：n2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。n3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。n策略：先在辅酶的一定部位进行修饰策略：先在辅酶的一定部位进行修饰-引入功能团和间隔臂

27、（形成辅引入功能团和间隔臂（形成辅酶衍生物）酶衍生物）- 再与水溶性高分子结合再与水溶性高分子结合辅酶的固定化辅酶的固定化辅酶的固定化辅酶的固定化辅酶再生的形式：辅酶再生的形式：n辅酶和酶共固定辅酶和酶共固定与酶分子偶联成辅酶与酶分子偶联成辅酶-酶复合物酶复合物第五节第五节 固定化原生质体和辅酶的固定化固定化原生质体和辅酶的固定化n原生质体n辅酶固定化 方法固定化要点原因方法形式第五节结束第五节结束n点击返回第六节第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用酶反应器和固定化酶（细胞）的应用 n 酶反应器介绍酶反应器介绍n 酶反应器的选择和应用酶反应器的选择和应用n 固定化酶和细胞的应用固定化酶和细

28、胞的应用生物催化反应器工程生物催化反应器工程n通过反应器型式、操作方式的改变能通过反应器型式、操作方式的改变能否使生物催化反应效率最大化否使生物催化反应效率最大化？n将反应与传质紧密相关将反应与传质紧密相关 一酶反应器。一酶反应器。n 分批搅拌反应器。分批搅拌反应器。n搅拌罐型搅拌罐型n 连续流搅拌桶反应器。连续流搅拌桶反应器。n固定床型固定床型 （填充床反应器）（填充床反应器）n流化床反应器流化床反应器n连续搅拌桶连续搅拌桶-超滤反应器超滤反应器n循环反应器循环反应器n膜式反应器膜式反应器n鼓泡塔型鼓泡塔型 分批搅拌反应器分批搅拌反应器n反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小反应器结构简单，

29、不需要特殊装置，适与小规模试验规模试验 连续流搅拌桶反应器连续流搅拌桶反应器n连续搅拌釜式反应器 填充床反应器填充床反应器n旋转填充床流化床反应器流化床反应器n与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器，的颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器，而是底物向上流过固定酶床，因此流速要而是底物向上流过固定酶床，因此流速要适当控制。适当控制。 循环反应器循环反应器n高效内循环生物反应器（HCR） 连续搅拌桶连续搅拌桶-超滤反应器超滤反应器膜式反应器膜式反应器n定义：由膜状或板状固定化酶或固定化微生物组装的反定义：由膜状或板状固定化酶或固定

30、化微生物组装的反应器均称为膜式反应器。应器均称为膜式反应器。n类型：直接接触式酶膜反应器、扩散型膜反应器和多相类型：直接接触式酶膜反应器、扩散型膜反应器和多相酶膜反应器。酶膜反应器。膜式反应器膜式反应器n采用聚砜中空纤维膜反应器固定淀粉酶可控制淀粉水解，采用聚砜中空纤维膜反应器固定淀粉酶可控制淀粉水解，制备糊精。制备糊精。鼓泡塔型反应器鼓泡塔型反应器n适用对象：反应中涉及气体的吸收或产生时适用。适用对象：反应中涉及气体的吸收或产生时适用。n气体进入方式：气体进入方式：n与底物一起从底部进入，经过气体分散板分散。与底物一起从底部进入，经过气体分散板分散。n和循环液从底部以切线方向进入。和循环液从

31、底部以切线方向进入。生物催化反应分离耦合反应器生物催化反应分离耦合反应器Diagram of the enzymatic synthesis of cefaclor with in situ product removal. (1) Complexation reactor, (2) enzymatic reaction reactor, (3) peristaltic pump, (4) sintered-glass (G2), (5) mechanical stirrer.0102030405060024681012Time (h)Concentration (mmoldm-3)7ACCA

32、 without ISPRcefaclor without ISPR7-ACCA with ISPRcefaclor with ISPR产物在线分离策略实现头孢克罗半连续制备产物在线分离策略实现头孢克罗半连续制备01020304050600102030405060Time (h)7-ACCA (mM)Journal of Molecular Catalysis, 17(2):81-87, 2003. Biotechnology Letters, 2003, 25 (14): 1195-1198. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic,2003,26 (1-2)

33、:99-104. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2004, 79:480-485. 减压式反应器用于生物催化反应中易挥发产物的在线去除Wei Dongzhi*, Yu ying, Biocatalysis and Biotransformation, 2003,21(3)135-139. 生物催化合成油酸乙基葡萄糖苷酯生物催化合成油酸乙基葡萄糖苷酯减压式反应器用减压式反应器用常规反应器用常规反应器用反应器选择反应器选择n酶的形式：酶的形式： 溶液酶溶液酶n 颗粒状或片状固定化酶颗粒状或片状固定化酶n 膜状和纤维状固定化酶膜状

34、和纤维状固定化酶n底物的物理性质：溶解性、颗粒物质和胶体物质底物的物理性质：溶解性、颗粒物质和胶体物质n反应操作要求反应操作要求n酶的稳定性酶的稳定性n应用和可塑性和成本应用和可塑性和成本酶反应器的应用酶反应器的应用n控制酶反应器液态流动方式控制酶反应器液态流动方式n反应器中流动方式的改变会使酶与底物的接触不良，造成反应器生反应器中流动方式的改变会使酶与底物的接触不良，造成反应器生产能力降低。产能力降低。n流动方式改变造成反混程度的变化，会发生程度不同的反应或副反流动方式改变造成反混程度的变化，会发生程度不同的反应或副反应。应。n物料粒子进入反应器后所经历的时间称为粒子的年龄。粒子离开反物料粒

35、子进入反应器后所经历的时间称为粒子的年龄。粒子离开反应器时的年龄称为停留时间。应器时的年龄称为停留时间。n反应器内不同年龄的粒子间的混合称为反混。反应器内不同年龄的粒子间的混合称为反混。酶反应器的应用酶反应器的应用n酶反应器对底物恒定转化酶反应器对底物恒定转化n目的：反应器能平稳的进行工作，有利于实现自控操作目的：反应器能平稳的进行工作，有利于实现自控操作n方法：控制底物流速方法：控制底物流速n国外热点：将固定化酶反应器串联或并联操作国外热点：将固定化酶反应器串联或并联操作。酶反应器的应用酶反应器的应用n保持酶反应器的稳定性：保持酶反应器的稳定性：n防止酶变性、中毒、自溶或载体磨损。防止酶变性

36、、中毒、自溶或载体磨损。n防止酶反应器中微生物污染防止酶反应器中微生物污染n向底物中加入杀菌、抑菌物质，或有机溶剂向底物中加入杀菌、抑菌物质，或有机溶剂n底物物料预先除菌底物物料预先除菌n在在45度以上环境中或酸、碱缓冲液中进行反应度以上环境中或酸、碱缓冲液中进行反应n酶反应器每次用后消毒酶反应器每次用后消毒二固定化酶（细胞）的应用二固定化酶（细胞）的应用n1 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用n2 固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在医药治疗上的应用n3 固定化酶在分析化学中应用固定化酶在分析化学中应用n4 固定化酶和亲和色谱固定化酶和亲和色谱n5 固定

37、化酶与环境保护固定化酶与环境保护n6 新能源开发中的应用新能源开发中的应用n7 固定化酶在基础理论研究中应用固定化酶在基础理论研究中应用1 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用n葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶。世界上生产规模最大的一种固定化酶。n用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。n n 葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶n葡萄糖葡萄糖 果糖果糖 果葡糖浆果葡糖浆固定化酶在工业生产中的应用固定化酶在工业生产中的应用n聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨

38、短杆菌菌体，制得固定化延胡索酸酶。工业化生产菌菌体，制得固定化延胡索酸酶。工业化生产L-苹果酸苹果酸n利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶n固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类固定化原生质体的应用固定化原生质体的应用n研究中：研究中：n固定后化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞中固定后化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞中的碱性磷酸酶，全部分泌到发酵液中，提高产率的碱性磷酸酶，全部分泌到发酵液中，提高产率36%，可连续使用，可连续使用37天。天。2 固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在医

39、药治疗上的应用n例例1n固定化青霉素酰化酶，只要改变固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就既可以值等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成催化青霉素或头孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸酸或氨基青霉烷酸酸或7-氨基头孢霉烷酸氨基头孢霉烷酸n也可以催化也可以催化6-APA或或7-ACA与其他的羧酸衍生物进行反与其他的羧酸衍生物进行反应应n合成新的具有不同恻链基团的青霉素或头孢霉素合成新的具有不同恻链基团的青霉素或头孢霉素青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素OH2NR2R1NH2NSOOOHNR1NH2NSOOO OHH1: D-(-)-PGA (R1 = H,

40、R2 = NH2)2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe)3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2)4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2 = OMeH2OPenicillin G acylase+Ampicillin (RI = H)Amoxicillin (R1 = OH) 7-ACA as nucleus青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素R2R1NH2NSNNSR3R1OOOOOOH2NNH2OHR3HOH+Penicillin G acylaseH2O7-ACCA (R3 = Cl)7-ADCA (

41、R3 = Me)Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl)Cephalexin (R1 = H, R3 = Me)Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)7-ACCA or 7-ADCA as nucleus酶促合成头孢类抗生素酶促合成头孢类抗生素n - Reversible reaction n - Hydrolysis of substrate or product by biocatalystn - Difficulty of separation of product from reactantsCHCOOCH3NH2CHCOOHNH2CHCONHNSOC

42、OOHCH3NH2H2NNSOCOOHCH3+H2NNSOCOOHCH3+Esterase HydrolaseSynthetase固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在医药治疗上的应用n例例2：制造人工肾：制造人工肾n利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。固定化脲酶由酶与离子交换树脂置，大大提高了疗效。固定化脲酶由酶与离子交换树脂一起制成微小胶囊尿酶可分解尿素为一起制成微小胶囊尿酶可分解尿素为NH3和和CO2，NH3被被树脂吸附，树脂吸附，CO2可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以外的代

43、谢废物。外的代谢废物。 3固定化酶在分析化学中应用固定化酶在分析化学中应用n酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。形成酶电极，进行某些物质的自动分析。酶电极酶电极221,5DODH O葡萄糖葡萄糖内酯酶电极酶电极n特点：快速、方便、灵敏、精确特点：快速、方便、灵敏、精确n范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等n要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。

44、要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。一概论生物传感器又称生物活性物质修饰的传感器。一般传感器可分为物理传感器和化学传感器。例如热敏电阻是最常用的物理传感器，而玻璃pH电极是最常用的化学传感器。 固定化青霉素酶层热敏电阻pH电极敏感部固定化青霉素酶层生物传感器的基本原理；易测量的物理,化学量生物活性物质不易测量的化 学 , 生 物量基础传感器测量信号 酶生物传感器微生物细胞生物传感器动物组织生物传感器植物组织生物传感器免疫生物传感器基因生物传感器其他杂合膜生物传感器电化学生物传感器（又称为生物电极）光学（纤维）生物传感器热敏生物传感器压电晶体生物传感器等等生物电极还可分为；基于O2检测的生物电极基于H2O2检测的生物电极基于NH3检测的生物电极基于CO2检测的生物电极基于pH检测的生物电极电子转移介体生物电极直接电位免疫生物电极酶标免疫电极等等生物传感器中涉及的生物反应主要有三类；1.酶反应（包括多酶反应）;Ckdtdv)1 (2.免疫反应;3.杂交(合)反应;杂交反应是指作为基因探针的单链寡核苷酸与目标核苷酸以碱基配