产纤维素酶菌种的筛选与优化

1、产纤维素酶菌种的筛选与优化目记录实验 1 分离和初筛实验2 复筛和保存实验3 酶活测定和继代保存实验实验4 紫外诱变育种实验5 产纤维素酶菌株产酶条件优化实验6 产酶条件优化结果实验 1 了解产纤维素酶微生物分离的基本原理； 2.掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法2，实验原理自然界中有大量的纤维素物质，同时也有许多能分解纤维素物质的生物，从细菌、放线菌、真菌到一些食草昆虫和动物。这些生物和绿色植物一起构成了世界的碳循环。 在发酵堆肥中， 有大量耐高温纤维素分解菌，但大多数是混合分解菌。菌株需要1。内切葡萄糖甘酶（endo-1,4-&d-葡聚糖酶，简称EC 331.4,EBG）,也称为 Cx 酶

2、， CMC酶，例如这种酶作用于纤维素分子内的非晶区，随机识别并水解川, 4-糖昔键，截短长链纤维素分子，并产生大量末端不还原的纤 维素小分子。2.胞外-1, 4-&D-葡聚糖酶（酶代码321.91）,也称为C1 酶、微晶纤维素酶和纤维二糖水解酶（CBH）,它从纤维素长链的非还原端水解&1, 4-糖苷键，一次切割纤维二糖分子；3 &葡萄糖甘酶（-葡萄糖甘酶，EC3221,缩写为BG）,也称为纤 维二糖酶，可水解纤维二糖酶糖和短链纤维低聚糖生成葡萄糖，并快速水解纤维二糖和纤维三糖。 随着葡萄糖聚合酶的增加和水解率的降低， 这种酶的特异性相对较差。只有三种酶协同作用，才能很好地分解纤维素。就单个菌落

3、而言，木霉、曲霉和青霉等霉菌具有较高的总体酶活和较大的产量， 因此用于畜牧业和饲料工业的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。在本实验中，以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基。 只有能将纤维素水解成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长。从筛选培养基中分离产生纤维素酶的微生物。使用羧甲基纤维素钠 （CMC-Na） 作为唯一碳源， 并使用 CMC-Na 通 过微生物分解来分离能够产生纤维素酶的菌株。刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色络合物。3，实验仪器和试剂1 。土壤样本取自学校入口处5-20 厘米深的小树林。2。仪器试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、电子秤、量

4、筒、培养皿、酒精灯、移液管、接种环、高压灭菌锅等。 ；3.培养基(1)筛选培养基(500 毫升 )羧甲基纤维素钠 10克， (NH4)2SO4 1.4克， 硫酸镁 0.3克 KH2PO42g克，硫酸镒1.6毫克，硫酸亚铁5毫克硫酸锌2.5毫克，氯化钻2.0毫克琼脂 20克 PH7.0 (2)保存培养基(500毫升 )竣甲基纤维素钠15克，硫酸镁0.5克，K2HPO4 1.5g克，酵母粉10克氯化钠 5 克，蛋白胨15 克，琼脂 20 克土壤样本是从学校入口处 5-20 厘米深的小树林中采集的。2.实验设备的消毒:平板和吸管的包扎和消毒；3 。无菌水的制备:在 250 毫升锥形瓶中测量99 毫升

5、自来水，加入适量玻璃珠，用棉塞塞住，用牛皮纸包好，并在121?在c条件下灭菌20分钟备用将9毫升自来水倒入试管，用试管塞住，用牛皮纸包好，放在 121？在 c条件下灭菌 20 分钟备用4 。筛选介质和倒置板的制备:根据筛选介质的配方，准确称取每种物质，溶于 1000 毫升蒸馏水中，调节酸碱度至pH7.0在121? c .高温灭菌20min,在无菌环境下取出旧倒置板备用5.保存介质的制备和倾斜:根据筛选介质的配方准确称量所有物质，将其溶于 1000 毫升蒸馏水中，调节酸碱度至pH7.0 分装试管放在121？ c .高温灭菌 20min，取出摆动斜面备用 6.土壤样品预处理和梯度稀释(1)样品细菌

6、悬液的制备首先取1g 样品，加入 99 毫升含玻璃珠的无菌水中，摇匀几分钟形成悬液(2)梯度稀释:在无菌条件下，将1 毫升无菌移液管放入装有9 毫升无菌水的试管中。10 -3、 10-4、 10-5和 10-6的梯度依次稀释，备用7 。倒置平板涂布是通过将三种浓度分别为10-4、 10-5 和 10-6 的细菌悬浮液接种到倾倒的平板中来进行的。均匀分布。培养、观察并记录实验 2 产纤维素酶菌株筛选及保藏1，实验目的1 。掌握平板连接斜面的操作；2.掌握筛选原则和选择方法2，实验原理刚果红可与纤维素结合，纤维素酶可水解纤维素，使刚果红可与纤维素结合，在产纤维素菌株周围形成透明圈，从而选择目标菌落

7、。微生物的繁殖具有易变异的特点。同时，微生物的生长通常不能与生长所需的营养、 水分、 氧气和环境温度分开。 在营养缺乏、 干燥、空气隔绝、 低温等条件下， 微生物的代谢可保持在最不活跃或相对静止的状态，以利于微生物特性的保存。利用微生物的纯培养来确定分离得到的最佳产酶微生物，并进行保存和进一步研究。 通过酶活测定确定初步筛选菌株的产酶性能； 通过培养条件的控制，菌种休眠实现保存。3，实验仪器和试剂1 。从实验室品系借来的品系；2。仪器试管、烧杯、电磁炉、电子秤、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、旋转振荡器等。 ；3。培养基摇瓶培养基竣甲基纤维素钠 Na10g, (NH4)2SO44.0g,

8、硫酸镁 0.5g, K2HPO41.5g,牛肉膏2g,蛋白月东4g(对1L自然恒定的酸碱度)4，实验步骤1。在产植酸酶黑曲霉分离平板上，选择透明圈明显、透明圈直径与菌落直径之比大的单个菌落，分离效果最好，并进行标记。2。左手拿着盘子，右手拿着接种环。首先烧灼金属环并消毒，然后在空白培养基上冷却接种环，挑选菌落，并在火焰旁等待片刻。3。左手放下盘子，拿起倾斜的培养基用右手小指和靠近火焰的手掌边缘拉出棉条并夹住， 迅速将接种环伸入空白斜面， 轻轻划开斜面培养基， 将菌体连接到其上划线时， 从斜面的底部到顶部画一条直线。4.燃烧试管口，将棉塞塞在火焰旁边，接种后，接种环上剩余的细菌只有在燃烧和消毒后

9、才能放下。5.培养:在 28-30的恒温箱中倒置，培养 3-7 天观察结果实验三酶活测定和继代保存1 ，实验目的1 。了解纤维素酶总酶活测定的原理；2.掌握纤维素酶活性检测方法；3.学习亚文化保存的操作方法2。实验原理纤维素酶能在适当条件下分解纤维素， 生成葡萄糖等还原糖， 与 3，5-二硝基水杨酸显色剂反应生成橙黄色络合物终止反应法是在恒温反应体系中以一定的时间间隔取出一定体积的反应溶液， 立即用强酸或强碱或十二烷基硫酸钠停止反应并加热， 然后用化学法、 放射化学法或酶偶联法分析产物的形成或底物的消耗。 这是最经典的酶活性测定方法。几乎所有的酶都可以根据这一原理设计特定的测定方法。在本实验中

10、，用强碱终止分解反应，用分光光度法测定吸光度。根据相应的标准曲线， 反应溶液中产生的葡萄糖量可以通过比色法计算，然后可以计算酶的活性。o酶活的定义：在37C PH5.5水浴60分钟的条件下，每分钟释放1毫摩尔的单糖为酶活单位3，实验仪器和试剂1 。选择菌株2 。仪器 : 试管、烧杯、电磁炉、电子秤、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、旋转摇床、分光光度计、恒温水箱、滤纸等。 ；3。试剂 :柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸缓冲液、葡萄糖、脱氧核糖核酸等。4。实验步骤将筛选出的菌株接种到摇瓶中，在37、 200 转/分的条件下培养3天，制成种子液，接种量为 1 毫升，接种到第二个摇瓶培养基中，在7、200 转/分的条件下培养纤维素酶粗酶液的制备方法 :取 3 ml 培养液， 8000 r/min ，离心 10分钟，上清液即为粗酶液取1 毫升粗酶液，加入稀释10 倍的原酶液9LPH5.0柠檬酸缓冲液。1.纤维素酶的测定还原糖的测定是 DNS 试剂法。在540纳米处有一个大的紫外光吸收峰。在一定范围内，还原糖含量与反应溶液颜色