DNA电泳常见问题分析

1、DNA电泳常见问题分析DNA电泳常见问题凝胶电泳操作考前须知1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂 质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有 选择地使用.2 、 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相 一致,溶化的凝胶应及时倒入板中,防止倒入前凝固结 块.倒入板中的凝胶应防止出现气泡,以免影响电泳结 果.3 、 电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和 pH,应 经常更新电泳缓冲液.4 、 样品参加量：一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5卜g的DNAS,加样量的多少依据加样孔的大小及 DNA 中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应 相应加大,否那么会造成条带

2、浅甚至识别不清；反之那么应适 当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从 而导致拖尾或弥散,对于较大的 DNAt匕现象更明显.5 、DNA羊品中盐浓度会影响DNA勺迁移率,平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响.6 、DNAf移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛 的DNA子,制备琼脂糖凝胶可根据 DNg子的范围来 决定凝胶的浓度.小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺 凝胶电泳,以提升分辨率.7 .选择的实验材料要新鲜,处理时间不易过长.8 .在参加细胞裂解缓冲液前,细胞必须均匀分散,以减 少DNAU块形成.9 .提取的DN环易溶解：

3、不纯,含杂质较多；加溶解液 太少使浓度过大.沉淀物太枯燥,也将使溶解变得很困 难.10 .电泳检测时DNA涂布状：操作不慎；污染核酸酶 等.11 .分光光度分析 DNA勺A280/A260小于1.8;不纯,含 有蛋白质等杂质.在这种情况下,应参加 SDS至终浓度 为0.5%,并重复步骤28.12 .酚/氯仿/异戊醇抽提后,其上清液太黏不易吸取：含 高浓度的DNA可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织 的量DNA电泳常见问题分析之一1请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时,促凝的是 TEMED还是过硫酸镂胶聚时间很长如何解决过硫酸镂提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需 的自由基,而TEMED通过催化过硫酸

4、镂形成自由基而 加速它俩的聚合.胶聚合时间长可能是TEMED失效了, 过硫酸镂固体时间过久也会失效的.一个让PAGE胶很快聚合的方法：不要先配AP 过硫酸镂溶液,由于 AP很容易变质. 在保证TEMED和AP质量的情况下,每次配胶时,直 接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中,这样 可以保证AP的催化水平,而且可以多加一点.配 25ml 的PAGE胶,加0.03克AP粉齐J,最后参加25U1TEMED , 20分钟左右就可以凝固当然这个时候拔梳子,会有少 量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰,使加的样品看 起来不太漂亮,但一般不影响跑胶效果和条带的形状和 位置.2 DNA电泳的MARKE

5、R 怎么是扭曲的1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制 的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面12mm即 可.2、电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压 3V/cm,等条带出孔后比拟漂亮了 .然后再调电压.3、上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压.3跑出的DNA带模糊1、DNA降解：防止核酸酶污染.2、电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液屡次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲水平减弱,从而影响电泳效果. 建议经常更换电泳缓冲液.3、所用电泳条件不适宜：电泳时电压不应超过20V/cm , 温度V30C；巨大DNA链电泳,温度应V 15 C；核查 所用电泳缓冲液是否有足够的缓

6、冲水平.4、DNA上样量过多：减少凝胶中 DNA上样量.5、DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的 盐.6、有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白.7、DNA变性：电泳前勿加热,用 20mM NaCl缓冲液 稀释DNA.4有不规那么DNA带迁移1、对于人/Hind III片段cos位点复性：电泳前于 65 C 加热DNA 5分钟,然后在冰上冷却5分钟.2、电泳条件不适宜：电泳电压不超过 20V/cm ;温度 <30C;经常更换电泳缓冲液.3、 DNA 变性：以 20mM NaCl Buffer 稀释 DNA ,电 泳前勿加热.5跑出的DNA条带带弱或无DNA带1、DNA的上样量不够：增

7、加 DNA的上样量；聚丙烯 酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高,上样量可适当 降低.2、DNA降解：防止DNA的核酸酶污染.3、 DNA走出凝胶：缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度.4、对于EB染色的DNA ,所用光源不适宜应用短波 长254nm 的紫外光源.6跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事1、如果是小DNA带走出凝胶,可以缩短电泳时间或降 低电压或增强凝胶浓度.2、分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间, 核准正确的凝胶浓度.3、DNA 变性：电泳前请勿高温加热 DNA链,以20mM NaCl Buffer 稀释 DNA.DNA链巨大,常规凝胶电泳不适宜在脉冲凝胶电 泳上分析.7做

8、PCR电泳后跑电泳,目的基因是 489BP的, 结果每次切胶回收后再跑电泳就变成 500多了,快到600 了为什么有时只靠电泳结果判断是不准确的,同样的片段每次跑的远近会有不同.有经验显示目的片段是 1300多, 结果就跑到1000的marker下面去了,后来证实片段没 有问题.也有做的一个片段也是这样,是490BP.理论上 两个条带一样,可是PCR结果显示就是大小不一致.然 后回收以后的检测结果又全部都一样了,后来又拿去做 了下一个测序,才知道根本没有问题.8:为什么marker条带非常模糊,无法区分具体条 带A:出现上述情况,可能有以下几个原因：1. marker条带出现了降解.请保证在使

9、用过程中避 免核酸酶污染；2.电泳缓冲液陈旧.电泳缓冲液屡次使 用后,离子浓度降低,pH值上升,缓冲水平减弱,从而 影响电泳效果,建议经常更换电泳缓冲液；3.电泳条件 不适宜.电泳时电压应不超过20V/cm,温度应低于30C; 4. marker上样量过多.请根据说明书选用适宜上样量； 5.凝胶质量不好.建议使用质量较好的琼脂糖；止匕外, 凝胶凝固不均匀也会导致条带模糊.9:为什么marker条带出现不规那么的条带如哑铃 状等A:出现上述情况,多与以下几个原因有关：1.电泳缓 冲液陈旧.老化的电泳缓冲液离子浓度降低,pH值上升, 缓冲水平减弱,从而影响电泳效果,建议经常更换电泳 缓冲液；2.电

10、泳条件不适宜.电泳时电压应不超过 20V/cm,电压太高可能也会导致marker条带出现不规那么 现象.止匕外,凝胶质量差以及凝胶冷却时凝固不均匀也 会导致该现象出现.10为什么marker条带非常弱或者根本没有条带A:出现上述情况可能是：1. marker上样量较低,可适 当增加上样量；2.凝胶质量较差或凝胶凝固不均匀也会 导致电泳条带弱或根本没有条带；3.电泳时间过长导致 marker条带跑出凝胶,可缩短电泳时间,降低电压,增 加凝胶浓度.11:为什么 marker缺带A:对于含有较小片段的 marker,如果出现缺带现象, 可能是由于：1.小条带跑出凝胶或分子量大小非常相近的条带 不易识

11、别所致,可适当缩短电泳时间,降低电压,同时 增加凝胶浓度；2.凝胶中EB含量过低,导致大片段结 合EB量太少或没有,在紫外光下亮度太低, 可适当增加 EB用量.原因解决方法DNA降防止核酸酶污染解电泳缓电泳缓冲液屡次使用后,离冲液陈旧子强度降低,pH值上升,4爰冲水平减弱,从而影响电泳效果O问DNA 带 模糊所用电 泳条件不合 适DNA上样量过多DNA样含盐过高有蛋白 污染DNA变性规DNA迁移入 /Hind 段cos复性于III片位点电泳条 件不适宜建议经常更换电泳缓冲液电泳时电压不应超过20V/cm,温度V 30 C；巨大 DNA 链电泳,温度应v 15 C；核查所用电 泳缓冲液是否有足够

12、的缓冲能 力减少凝胶中DNA上样量电泳前通过乙醇沉淀去除 过多的盐电泳前酚抽提去除蛋白电泳前勿加热,用20mMNaCl缓冲液稀释DNA电泳前于65 c力口热DNA 5 分钟,然后在冰上冷却5分钟电泳电压不超过20V/cm ; 温度V 30 C ;经常更换电泳缓冲 液DNA变性DNA的 上样量不够以 20mM NaCl Buffer 稀释DNA ,电泳前勿加热增加DNA的上样量；聚丙 烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高,上样量可适当 降低带 弱或无 DNA带DNA 带 缺失DNA降 解DNA走 出凝胶对于EB 染色的DNA , 所用光源不 适宜小DNA 带走出凝胶分子大 小相近的 DNA带不易

13、 分辨DNA变 性防止DNA的核酸酶污染缩短电泳时间,降低电压, 增强凝胶浓度应用短波长254nm 的紫 外光源缩短电泳时间,降低电压, 增强凝胶浓度增加电泳时间,核准正确的 凝胶浓度电泳前请勿高温加热 DNA链,以 20mM NaCl Buffer 稀释DNADNA链巨大常规凝胶电泳不适宜在脉冲凝胶电泳上分析题问可能原因解决方法DNA Marker 降解核酸酶污染每次吸取时更插 灭菌枪头,勿将电泳缓 冲液带入管中；用后密 闭4°C保存保存不当4 C 或-20 °C 伤存,防止屡次反复冻 融；不可加热DNA Marker 无法正 确别离琼脂糖质量 差使用质量可靠, 琼脂糖制

14、胶J电泳缓冲液 屡次使用后失效更换缓冲液条 带黯淡核酸浓度过 低增加上样量核酸降解使用不含核酸酶 的试剂和耗材制备样品DNA条带被 示踪染料掩盖提升上样量；防止 使用与目的片段迁移率相同的示踪染料条带模糊 或弥散电泳缓冲液 屡次使用后失效更换缓冲液核酸局部降 解使用不含核酸酶 的试剂和耗材制备样 品1核酸样品纯 度差,含有 DNA 结合蛋白或高浓 度的盐份酚/仿抽提或乙醇 沉淀去除蛋白、盐份等 杂质电压过低,电 泳时间过长根据凝胶大小和 电泳缓冲液类型,使用 适当的电压进行电泳染色时间过 长或拍照前放置 过久,DNA条带弥 散电泳结束后及M 观察、拍照I-条 带缺失DNA条带分子量过大使用脉冲

15、凝胶电 泳分子量接近 的DNA条带没有 分开电泳缓冲液 使用不当选择适当的凝胶 浓度进行电泳条 带大小 不正确电泳时间过 长或电压过高, DNA走出凝胶电极插反,DNA走出凝胶核酸降解或 形成聚合物入DNA酶切 Marker 的 cos 位 点复性相同分子量 的DNA片段由于 结构或序列的差SD和TBE缓冲液 适于分析较小分子量 的DNA片段,大片段 分子不能完全别离； TAE缓冲液不适于分 离很小的DNA片段缩短电泳时间,调 整电压正确连接电极方 向加热处理或重新 制备样品电泳前65 C加热 5分钟,冰上冷却5分 钟以后再上样判断DNA分子是 否有特殊结构,如缺 口、超螺旋、二聚体等；异而有不同的迁富含AT碱基的DNA移率迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢梳子变形,点 使用完好的梳子样孔不在同一水制胶平线上带 型异常不同样本的 上样条件不同上样量过大选用相同的上样 缓冲液,上样量尽