同核核磁试验方法

1、第六章同核核磁实验方法通常所谓同核核磁谱指的是1H同核谱,由于一般有机物富含氢,而 1H的天然丰度达99.98%,而且1H的旋磁比最大,因而核磁信号最强.其他核的核磁信号的检测相对来讲都 比拟困难,尤其是蛋白质中有意义的如13C, 15N的天然丰度分别只有1.11%和0.36%,相对1H的检测灵敏度只有 0.0159和0.00104,因此要检测蛋白质中的 13C及15N 一定要有同位素 标记才行,而且还需长时间累加.一般同核谱可研究的蛋白质分子量的上限在1万左右,当然还要求蛋白质在溶液中有足够的溶解度,化学位移的分布比拟分散.蛋白质中质子的化学位移根本上是random coil的化学位移加上不

2、同构象的影响.如折叠多的蛋白质同螺旋多的蛋白质相比,化学位移更为分散,谱峰也更容易解析；同种氨基酸残基多的蛋白质,即使分子量较小,由于化学 位移可能会比拟密集,谱峰解析可能比稍大一些的蛋白质还要困难.已经发表的脉冲序列有上百,但通常可以看作常规实验的为数不多.6.1 一维氢谱在记录二维谱或三维谱等之前均需要记录一维氢谱,通常蛋白质溶于水或适当的缓冲液,加5-10%的D2O作为锁场介质.一维氢谱可用于检查样品是否有足够浓度,通常 16- 32次采样要能得到足够信噪比的谱图,甲基由于快速旋转呈现窄峰,而酰胺质子由于化学 交换及14N的标量弛豫呈现宽峰；一维氢谱还可用于检查样品的共振峰宽是否合理,蛋

3、白质在高浓度下容易聚集从而增宽谱 线,严重时甚至1H谱上看不到明显的峰,样品在这种条件下显然无法进行核磁研究；一维 氢谱还可用于判别样品的化学位移分布情况,可判别样品是否变性,同时也对研究工作的 难度提供一些预测.864201H(ppm)上图显示ubiquitin 一种蛋白质,76个残基的一维谱：a水溶液中,b箭头所指甲基区 的放大,c 8M尿素溶液中,显示变性谱.蛋白质的一维氢谱一般不应该有非常尖的峰,假设出现这种峰,往往是残留的小分子杂 质,当然蛋白质的末端及 loop区由于分子运动较快也会出现一些较尖的峰.当样品条件不佳时,一维谱以及假设干信号强的二维谱可用来探索适合的样品条件.6.2

4、COSY型实验6.2.1 COSYA COSYcorrelated spectroscopy,是人们创造的第一种二维谱,同时也是研究蛋白质的最有 用的二维谱之一.二个有J偶合的核在COSY上可产生一个交叉峰,由于蛋白质包括多数其他有机物中有 J偶合意味着这两个核最多通过3个共价键连接,所以 COSY谱对于分子结构的拓扑连接可提供非常有价值的信息.12左图是COSY的脉冲序列,只由 2个90度 脉冲组成,两脉冲之间是演化期,理想脉冲本身不产生其他杂信号,故不需相循环抑制：因此根本的相循环为：1 =X； 2=X； ref=X实际上由于演化期的弛豫以及第一个90度脉冲的不准确会产生轴峰,需要用2步循

5、环抑制：第一个脉冲及接收机相位同时反转 通常还加上CYCLOPS循环以抑制硬件不平衡产生的其他杂信号 这样形成8步循环：1= 0 2 1 3 2 0 3 12= 0 0 1 1 2 2 3 3ref= 0 2 1 3 2 0 3 1二维谱有幅度谱和相敏谱之分,由于相敏谱的分辨率高,通常要尽量用相敏谱.B以下是可以在 Bruker核磁谱仪上用于记录蛋白质COSY谱的脉冲程序,脉冲序列在Bruker谱仪上称作微程序： ;cosyprst.WJH#include <Avance.incl>p2=p1*2d0= in0/2-p1*4/3.14159 d11=30md12=20ud13=3u

6、l3=(td1/2)1 ze2 d113 d114 d12 pl9:f1 d1 cw:f1 d13 do:f1 d12 pl1:f1p1 ph1 d0p1 ph2go=2 ph31d11 wr #0 if #0 ip1 zd lo to 3 times 2d11 id0lo to 4 times l3 exitph1= 0 2 2 0 1 3 3 1 ph2= 0 0 2 2 1 1 3 3ph31=0 2 2 0 1 3 3 1C脉冲序列分析a二自旋体系 考虑相循环的第一步l(/ltil izl iyl 1 y cos( iti ) 11 x sin( iti )cos( iti )(Iiy

7、 cos( Ji2ti ) 2Iixl2zSin( Ji2ti)sin( iti )(lixcos( Ji2ti) 211yl2zSin( J偌G )11 y cos( i ti )cos( Ji2ti )2lixl2zcos( iti)sin( Ji2ti ) l1xsin( iti )cos( J12t )211yl2zSin( iti )sin( J偌ti )(2)xliz cos( iti )cos( J12tI )2lixl2y cos( iti )sin( Ji2ti)l ix sin( iti )cos( J12t )2lizl2y sin( iti )sin( J12ti )第

8、一项为纵向磁化,第二项为多量子项,均不能被观测到；第三项仍然是第一核的横向磁化,在检测期的频率同演化期类似,均是第一核的,对 应于对角峰；第四项是第二核的反向磁化,在检测期的频率为第二核的化学位移,与演化期不同, 对应于交叉峰,这是二维谱最有意义的峰.进一步将后两项的系数分解：1sin( iti )cos( J12t) -sin(i.,sin( iti )sin( Ji2ti) -cos(itiitiJ12t)sin( itiJi2ti ) cos( itiJi2ti )Ji2ti )可见,对角峰在 Fi维位于而交叉峰在Fi维也位于 正弦调制,另一个为余弦调制, 者不能同时调相成吸收型信号.1

9、 ,同相裂分成两个成分,距离 2 Ji2；i,但反相裂分成两个成分,距离也是2对角峰信号与交叉峰信号在相位上相差Ji2o由于一个信号为 90度,故在Fi维两再看F2维,对角峰为同向磁化l仅,在检测期呈现同相裂分,距离交叉峰在F2维为反向磁化2l1zl2y ,在检测期呈现反相裂分,距离也是2 Ji2；2 Ji2o由于个信号在x方向,另一个在y方向,两者在相位上也相差 90度,故在F2维两者也不能同时 调相成吸收型信号.COSY的交叉峰为反相峰,这一点非常重要,决定了 COSY型实验采样及处理时需要注意的问题.而交叉峰与对角峰在相位相差 影响.90度,对于谱图在对角线附近的质量有重要的b多自旋体系

10、 考虑li和l2间的交叉峰,类似的计算可得其系数为： Ksin( iti )sin( Ji2ti) cos( Jikti ) k 3其中的余弦项说明在 Fi维第一核相对除第二核(称为主动偶合)外的其他核(称为被动偶合)呈现同相裂分；同样在F2维由于交叉峰的密度算符为第二核相对第一核的反相磁化,其中没有出现被动偶合核的算符,即相对于被动偶合核为同相磁化,因此也呈现同相 裂分.pascal三角形描述；反相峰用反pascal三角形描述.当其中一个核为甲基时,由于磁全同的缘故,出现多重裂分：同相峰可用Fi维的数据点数也越大,而实验时间与Pascal triangle antiphase Pascal

11、triangle11J L3 d12110-11| 33111-1 -1|D 实验方案同其他二维谱相同处如确定谱宽,照射频率,测定90度脉宽,选择循环延迟时间等反相谱的特殊处1由于两维的交叉峰均是反相峰,因此两维都要有足够的分辨率,否那么正负两局部的信号 产生局部重叠,而使信号减弱；2交叉峰的观测信号包含 sin( J12t1 )sin( Ji2t2), 由于同核偶合常数不大,通常几Hz至十几Hz,因.1 一 1此t1及t2的最大值要到达 至,这样才能4J12 2J12获得足够强度的信号,这相当于62-125ms (假定4Hz的偶合常数).对于 t2一般不成问题,但 t1那么不然： 由于t1的

12、增量由谱宽确定,t1的最大值越大意味着 Fi维点数成正比.对一般蛋白质而言,通常置照射频率在水峰处,谱宽大致10ppm,接近5000Hz ,因此t1的增量为0.2ms,假设F1维点数取512, t1的最大值可达50ms左右；假设Fi维点数取1024, t1的最大值可达100ms左右.因此一般 Fi维点数取512至1024.左图显示不同Fi维点数的QCHAPTER 6 EipfrimfwtLh NMR Method 效果：a t1max=69ms,NS=16;b t1max=34.5ms,NS=32;以18.084 8.03.1 3.0F2 tppm)An/Gi fr峰班c t1max=17.2

13、ms,NS=64E数据处理通常交叉峰总是调相成吸收线型,此 时对角峰呈色散线型.由于色散峰的 长拖尾对靠近对角线的交叉峰产生干 扰,所以必须加适当的窗函数,通常 以不带相移或略有相移的正弦函数或 正弦平方函数.左图显示不同相移的正弦窗函数作用 于Fi维的效果：a 30 度；b 20 度；c 10 度；d 5 度F应用在高场区由于化学位移的简并, 谱峰的重叠,对角峰的干扰,通常不 容易由COSY识别整个自旋系统,在 蛋白质COSY特别有用处是用于检查 所谓的指纹区特别是酰胺质子与质子的交叉峰.在这个区域,脯氨酸由 于没有氨基没有交叉峰；甘氨酸有两 个 质子故有两个交叉峰 除非两者的 化学位移相同

14、；N端残基上的NH由 于与水交换快也没有交叉峰.除特殊情况外,对于不大的蛋白质,所有的峰都应该能找到.CHAPTEH h'NNMA MtncoosFhjUW Ilk ihc 皿 llit OiSV /现ruw加方唾邛rml仃5小24,蛋白质COSY上的几个主要区域唱瓦M TFL LAleucine,isoleucine,valine 侧链交叉峰alanine,threonine 甲基区T9 T55T7 门 T22n 口跑SH6ESV5口时其G J偶合常数的测量在没有被动偶合时,COSY的精细结构可以用于测定 J偶合常数,但直接由谱峰的裂分 得到的值有较大的误差.11日飕6J0 ossc

15、r汨依3 Ummami»" plasc "即,"dmbl" jig1副 pu,t pUTiiwP 四篇 4d t-iTi(iwn a' lifKY.nJl kI 届 Jjjfealijj n Imts、e $胆旧刷 w : 4,阂axRih qU adid cid 生胤策IUZ. All nirvCK 01四式 wll llw *line "划上版t 1帕浊 1 ofinjly显示表观裂分与线宽的关系7.97.8797.8Fa (ppm)H COSY的变型1 COSY- 第二个90度脉冲用小于90度的脉冲代替,其结果是：对角峰

16、被减弱多核体系中被动偶合产生的某些交叉峰被减弱,导致精细结构的变化,起到简化图谱 的作用2 COSY-Type likPLRiMtMs上图比拟 COSY-35 同普通COSY的图 谱,GLY 的 1HN-1H 交叉峰结构发生变 化,因而有利于 J 偶合常数的测定2 pre-TOCSYCOSY 预饱和同时抑制接近水峰的 H信号,因而从 H到其他质子特别是 NH的交叉峰 减弱甚至消失,而NH到H的交叉峰往往淹没在水峰产生的 ti噪声中.在pre-TOCSY COSY 中,在COSY序列前插入一个短时间的 TOCSY混合脉冲,使其他质子的信号先传递给 H,这样可局部恢复 H到其他质子的信号.3 .2

17、.2 Relayed COSY(R-COSY)A所谓接力谱,COSY的一种扩展,在 COSY的二个脉冲后加一个延迟,使反向磁化进 步传递给第三个核,最后一个 90度脉冲完成第二核至第三核的相干传递,这样观测的第一核同第三核的交叉峰,虽然两者可能并没有 旋同属一个自旋系统.ref1 Pl2 P24 P 4° ,即J偶合.显然,接力谱中的交叉峰说明两个自左图为R-COSY的脉冲序列,根本相循环为8步：1= 0 2 0 2 0 2 0 22= 0 0 0 0 2 2 2 23= 0 0 0 0 0 0 0 04= 0 0 2 2 0 0 2 2ref= 0 2 0 2 0 2 0 2整个循

18、环由二步1,二步2,二步4组成,而ref= 1,选择条件变成2 P24 P4 0,由于三者均是完整的二步循环,因此得选择的相干传递1 Pl 1途径为：P1= 1； P2=0, 2; P4=°, 2需要时可加上 CYCLOPS扩展成32步循环B脉冲序列分析考虑三核体系,1, 2核间以及2, 3核间有J偶合,而1, 3核间无J偶合.同样只考 虑第一步相循环.经过前二个脉冲作用,第一核产生的信号如COSY中所计算,在回波序列的作用下：22I1x sin(也)cos( J12L ) 2I1zl2ySin(缶)sin( J12L ) xlxcos( J12 ) 211yl2zSin( J12 )sln(小)cos( J5)2lzl2ycos( J23 ) 4I1zl2xl3zsin( J23 )sin(冷)sin(1/1 )cos( J12 )12xcos( J23 ) 212yl3zsin( J23 )sin(小)sin( J12L )sin( J12 )最后一个90度脉冲产生：lxcos( J12 ) 2l1zl2ysin( J12 )sin(也)cos( J12G )2l1yl2zcos( J23 ) 4l1yl2xl3y sin( J23 )sin(也)sin( J12G )cos( J12 )12xcos( J23 ) 2l2