基因工程思考题答案

1、基因工程思考答案 一、填空题1 . 702 . 1分子水平上的操作；2细胞水平上的表达3 .克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择4 .限制性酶切图谱5 .属名的第一个字母；种名的前两个字母；株名6 . 1减少酶量；2缩短反响时间；3增大反响体积7 . EcoK; EcoRl8 . GGCC;异源同工酶同裂酶9 .枯草杆菌蛋白酶；15'-3'合成酶的活性；23'-5'外切核酸酶10 .碱性磷酸酶；5'端的磷酸基团11 . Ca2+13. DNA聚合酶I : 5' 3'外切核酸酶；5' 3'合成酶14. S1核酸酶切割；DN

2、A聚合酶补平15. 核酸水解酶H; RNA16. 质粒DNA ;病毒DNA ;质粒和病毒DNA杂合体17. 复制区：含有复制起点；选择标记：主要是抗性基因；克隆位点： 便于外源DNA的插入18. 质粒消除或治愈19. pMBl; pSCl01; pSF2124R质粒20. 1000kb; 300kb21. 严紧22. pBR322 和 M13; pMBl ;转座子23. 它在细菌中能够大量繁殖,这样有利于外源 DNA的扩增；对某些噬菌体 如 噬菌的遗传结构和功能研究得比拟清楚, 其大肠杆菌宿主系统的遗传也研 究得比拟详尽24. 没有适宜的限制性内切核酸酶识别位点；选择标记25. 质粒；噬菌体；

3、4526. 1分子量大,2酶的多切点,3无选择标记27. 复制区；IG区28. 75% 105%29. 螯合Mg 2+离子,抑制核酸酶的活性30. 中和DNA分子的负电荷,增加 DNA分子间的凝聚力31. 1合成探针；2合成cDNA; 3用于PCR反响；4进行序列分析32. T一载体33. 第二链合成时形成的发夹环34. 乙醇使DNA分子脱水35. 1保持正确的可读框2能够使其转录的启动子3具有译的起始和终止 信号36. 接受外源DNA的生理状态37. 1黏性末端连接；2平末端连接；3同聚物接尾连接；4接头连接法38. 基因组DNA克隆； 基因组DNA文库39. cDNA克隆；cDNA文库40

4、. 聚合酶链式反响PCR41. 0 C; 42 C42. 1遗传学方法；2物理筛选法；3核酸杂交法；4表达产物分析法43. .插入外源片段的种类较多,大小又极为相似的重组体的筛选44. 基因组 DNA ; cDNA45. Klenow酶填补的方法；T4DNA聚合酶46. 1用M13噬菌体载体合成单链 DNA探针；2从mRNA反转录合成单链 cDNA探针；3用不对称PCR合成单链DNA探针47. 外源基因是否进行了转录48. 两种不同的细胞群体能够表达不同的基因,即在一个群体中能够表达一些基因,而在另一个细胞群体中不能表达这些基因49. Northern 迹50. Southern 迹51. 5

5、' 3'合成酶；3' 5'外切核酸酶52. 1克隆的是完整的基因；2使用的是表达载体；3不含内含子53. (1)印迹的对象不同：Northern是RNA , Southern是DNA ; (2)电泳条件不同, 前者是变性条件,后者是非变性条件54. (1)抗体能够被吸附到固体支持物上；(2)同一个抗原可以同几种抗体结合；抗体能够被标记二、选择题(单项选择或多项选择)I .c；2. c； 3. b; 4. b 5.b,C,d,e；6.c；7.b; 8.d;9. d;10. B;II . a；12. a；13. d;14.b 15.d;16.c；17. a, b;

6、18. a；19.c；20. d;21.c； 22.C; 23.b;24. C;25.d; 26.a, C, d; 27. b;28.c；29. b; 30.a；31 .c；32. a,c,d©33.a, b,c；34. b;35.c；36.c；37. d;38. b;39.c； 40.a； 41 . c；42. a, b,c；43.b;44. b; 45. d;46.a；47. a；48. c； 49. c； 50.b;51. c；52.c；53. b; 54. a,c,d;55.a；56. b; 57.a,b;58.c；59. a； 60.d;61 . b;62.c；三、简做题1

7、 . 答：Sanger DNA测序法是建立在两个根本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由 5'端向3'端聚合(DNA聚合酶参与了细 菌修复DNA合成过程)；(2)可延伸的引物必须能提供游离的3'羟基末端,双脱氧核甘酸由于缺少游离的3'羟基末端,因此会终止聚合反响的进行.如果分别用 4种双脱氧核甘酸终止反 应,那么会获得4组长度不同的DNA片段.通过比拟所有DNA片段的长度可以 得知核甘酸的序列.2 .答：盐离子浓度不对,温度不对,甘油浓度过高.3 .答：回文序列是：5'-CATATG-3,4 .答：GATATC; AAATTT ,由于它们是

8、回文序列.5 .答：注意星活性,先低盐,后高盐；先低温酶,后高温酶；并且可以直接在换酶 前将第一种酶失活,再加第二种酶,否那么,易产生星活性.或使用通用缓冲液.6 .答：由于反转录酶缺少在E. coli DNA聚合酶中起校正作用的3'-5'外切核酸酶活 性,所以聚合反响往往会出错,在高浓度的 dNTP和Mg2+下,每500个碱 基中可能有一个错配.7 .答：所谓测序酶即是修饰了的T7 DNA聚合酶,是采用缺失的方法,从外切核酸 酶结构域中除去28个氨基酸,这样使T7 DNA聚合酶完全失去了 3'-5'的外 切核酸酶活性,只有5'-3'聚合酶的活性

9、,而且聚合水平提升了 39倍, 测序时常用此酶.8 . 答：S1核酸酶作图是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法.9 .答：YAC带有天然染色体所有的功能元件,包括一个着丝粒,一个 DNA复制起 点,两个端粒.YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA,这是质粒和黏粒办 不到的.大片段的插入更有可能包含完整的基因,在染色体步移中每次允许 更大的步移距离,同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目.10 .答：1独立复制；2有选择标记；3有独特的酶切位点；4能转化但不扩散.11 .答：含有细菌质粒和克隆的真核生物 DNA片段的杂种质粒,有两个复制起点和 既能在细菌又能在真核细胞中进行选择

10、的选择标记,所以,很容易从一宿主 转到另一个宿主往返穿梭.12 .答：1削减分子量除去非必需区和整合区；2削减酶切位点；3添加选择标记；4引入终止突变13 .答：1DNA半保存复制的原理,在体外进行 DNA的变性、复性和引物延伸.(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶 DNA序列.14 .答：基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子.15 .答：化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段,然后与待克 隆片段两端连接起来,如果用 EcoRI切割这种连接片段,就会产生 EcoRI的 单链末端.这种片段就可以插入到任何 EcoRI的限制性内切酶位点中.16 .答：(1)CO

11、S位点可以自身环化；(2)可以利用COS位点包装 噬菌体颗粒；(3)可以感染寄主细胞；(4)利用质粒复制子复制,不整合、不裂解.17 .答：(1)着丝粒；(2)端粒；(3)ARS序列.18 .答：(1)含有来自其他生物DNA的酵母人工染色体,叫YAC;(2)主要特性是可以克隆较大的外源片段.19 .答：PCR用双引物,体内复制用单引物.20 .答：应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌.21 .答：为了扩增突变体的thyA基因,先设计一对引物,其中一个引物的序列与thyA 基因的5'端相同,另一个引物同该基因的 3'端互补.在引物的5'端加上合 适II类限制性内切核

12、酸酶的识别序列,以便于后来的克隆.将染色体DNA同引物混合后,进行PCR扩增.然后进行琼脂糖凝胶电泳,纯化扩增片段, 可以直接测序或克隆到适宜的载体再测序.22 .答：如果你的杂交探针是双链的,可能由于在加人杂交混合物之前忘记将探针变 性而得到空白的放射自显影结果.23 .答：(1)DNaseI 造成切口;2DNA聚合酶III的5' 3'外切核酸酶进行切割；3DNA聚合酶田的5' 3'合成酶进行修补；4在修补过程中,随着切口nick的移动,将放射性的底物掺人到双链 DNA中.24 .答：原因是：Hindm的切点在A基因内.25 .答：Western印迹是将蛋白质

13、经电泳别离后从凝胶中转移到固相支持物上,然后用 特异性的抗体进行检测.它与Southern的不同在于探针的性质不同,在Western 印迹中使用的探针是抗体蛋白质.26 .答：基因型是lac-.原因是在该密码子中插入了两个碱基,造成了移码突变,所 以Lac的基因是缺陷的.27 .答：这是由于细菌没有内含子剪接系统,并且不能识别真核生物的启动子之故.四、问做题：1 . 答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原那么,即属名 +种名十株名的各一个首字母, 再加上序号.根本原那么：3-4个字母组成,方式是：属名+种名+株名+序号；首字母：取属名的第一个字母,且斜体大写；第二字母：取种名的第一个字母,斜体

14、小写；第三字母：1取种名的第二个字母,斜体小写；2假设种名有词头,且已命名 过限制酶,那么取词头后的第一字母代替.第四字母：假设有株名,株名那么作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体.顺序号：假设在同一菌株中别离了几种限制酶,那么按先后顺序冠以I、H、田、等,用正体.2 .n类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性,但是这种特异性受特定条 件的限制,即在一定环境条件下表现出来的特异性.条件的改变,限制酶的特异性就会松动,识别的序列和切割都有一些改变,改变后的活性通常称第二活性, 而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示,因此第二活性又称为星活性.概括起来,诱

15、发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5%, v/v); (2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U/ugDNA); (3)低离子强度 (<25 mmol/L); (4)高pH(8. 0以上)；(5)含有有机溶剂,如 DMSO ,乙醇等； (6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+, Cu2+, C02+, Zn2+等).3 .答：影响DNA连接酶催化连接反响的因素有很多,但温度对连接反响的影响较 大.黏性末端链通常以12.C 15° C最好,这种温度有利于末端退火和 连接酶的活性稳定.温度高了难以进行末端退火,低于上述温度会降低连接 酶的活性.平末端连

16、接以室温为宜,由于平末端连接不存在DNA的退火问题,但是温度高于30C,连接酶特别不够稳定.平末端连接时连接酶的浓 度要比黏性末端连接时高10-100倍.DNA中有残存的tRNA不会抑制DNA 连接酶的活性,但是,如果 NaCl的浓度高于150mmol/L,那么对连接反响 有强的抑制作用.另外反响体系中有NH4+离子的存在,对E. coli DNA连接酶具有激活作用. E. coli DNA连接酶需要NAD+作辅助因子,而T4 DNA连接酶需要ATP.4 .答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解 DNA聚合酶I,得到两 个片段,其中大片段的分子量为75kDa,它具有5&

17、#39;-3'聚合酶和3'-5'外切核酸 酶的活性,小片段具有5'-3'外切核酸酶活性.由于大片段失去了 DNA聚合 酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性,所以在基因工程中更有用.Klenow酶主要有以下用途：(1)修复反响,制备平末端可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端,制备平末端,这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组.如在反响系统中参加放射性同位素标记的脱氧核甘酸,用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针.用Klenow酶修复

18、5'突出末端的反响主要是利用了 Klenow酶的DNA聚合酶 活性,是填补反响；而修复3'突出末端那么是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶 的活性,是切割反响.用 Klenow酶的切割反响来修复3'突出末端是不理想 的,改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择.(2)标记 DNA3'突出末端(protruding end)该反响分两步进行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端,产生3'隐 含末端,然后在高浓度的标记底物(-32p-dNTP)存在下,使降解(3'-5')作用与 聚合(5

19、'-3')作用到达平衡.这种反响也叫交换或取代反响(exchange/ replacement reaction).不过这一反响用 T4DNA聚合酶的效果更好,因它的 3'-5'外切核酸酶活性较强.(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)®备单链DNA探针等.5 .答：主要差异是：CIP68° C时失活,而BAP68° C稳定,且耐酚抽提.应用： (1)dsDNA的5'端脱磷酸,预防DNA的自身连接.

20、但是用 CIP处理后,最好 将CIP除去后,再进行连接反响.(2)DNA和RNA脱磷酸,然后用于多核甘酸激酶进行末端标记.6 .答：外切核酸酶是从 噬菌体感染的E. coli中别离纯化的,能够从双链 DNA上 依次切下5'单核甘酸,作用底物是双链 DNA的5'磷酸末端,不能切割羟基 化5'端.该酶虽然能切割单链 DNA,但效率较低(下降200倍).不能切割带 切口或缺口的dsDNAo该酶作用时是行进性的,一步一步进行的.在基因 工程中主要用于除去双链 DNA突出的5'末端,以便让末端转移酶加尾.7 .答：DNase I是一种内切核酸酶,在Mg2+存在下,DNas

21、e I随机切割DNA两条链 中的任意一条链；当 Mn2+代替Mg2+时,DNase I几乎是在双链DNA两条 链相对的位置上翻开缺口,使双链 DNA断裂,产生的末端几乎是平末端或 只突出12个核甘酸的DNA片段.DNase I有许多用途：(1)在切口移位标记中,制造切口； (2)在足迹法中保护DNA; (3)除去RNA制备物中的DNA ; (4)体外转录中除去DNA模板；(5)检测 染色体中的转录活性区；(6)产生可在噬菌体M13载体上进行测序的随机克隆.8 .答：质粒通过以下几种机制维持在细胞中的稳定：(1)多聚体质粒的分解如果质粒在复制时形成多聚体的话,在细胞分裂过程中质粒丧失的可能性就

22、会增加.一个多聚体是由多个单体相互连接而成的.多聚体的形成可能是由 于在复制终止时发生错误或者是由于单体间重组的结果.由于多聚体在细胞 分裂时将作为一个质粒进入一个子细胞,这样,多聚体的形成就大大降低了 质粒的有效拷贝数,因此,多聚体也就大大增加了细胞分裂时质粒丧失的机 会.为了预防这种情况的发生,很多质粒都具有位点专一性重组的系统,可 以破坏多聚体.(2)别离(partitioning)质粒通过一种别离系统来预防在细胞分裂过程中质粒的丧失,这种机制保证在细胞分裂过程中每个子细胞至少可得到一个质粒拷贝,这是由称为 par功 能(Par functions)完成的. 所谓par功能是指某些质粒,

23、包括F、R1等质 粒上具有的一些短的区域,这些区域能够增强质粒拷贝的适宜分配.如果从质粒中将这种区域拿掉,质粒丧失的频率就会相当高.已经深入研究过P1质粒的别离系统,发现P1质粒的别离系统由一个顺式激活 par序列和两个蛋 白ParA和,ParB的基因构成,其中一个蛋白同 par位点结合.关于par位点是怎样增强质粒适当别离的机制有两种模型, 根据这两种模型, 细菌的膜具有真核生物有丝分裂纺锤体的功能,在细胞分裂之前将质粒分开.par位点是质粒同质膜结合的区域,在细胞分裂时,由于膜的生长,质粒的两 个拷贝就被拉到两个子细胞中.这两个模型对于细胞分裂时,质粒同质膜的 结合是怎样保证每个细胞至少得

24、到一个质粒的解释是不同的.模型.A： par位点同细菌质膜的一个假定位点结合.在这个模型中,每一种 质粒都有它自己独特的同质膜结合的位点.当细胞生长时,位点也加倍,每 一个质粒拷贝结合一个位点.由于这些位点随着细胞分裂而分开,每一个质 粒拷贝将分配到一个子细胞.这就保证了质粒不会丧失.该模型要解决的问 题是质膜上必须有许多独特的位点以供不同的质粒拷贝结合,这似乎不太可 将模型A稍微改动一下,就可以满足质粒别离所需的位点.如果我们假定质 粒结合的位点不在质膜而是在细菌的染色体上就可以了.染色体上有很多的 位点,并且随着DNA的复制而加倍,这些位点可供质粒结合.剩下的唯一 问题就是在质膜上有同染色

25、体结合的独特位点,这样,质粒将随着染色体的 别离而别离.模型B同模型A根本类似,在这个模型中,质粒的两个拷贝在同质膜结合之 前必须通过它们的par位点相互配对.然后这两个质粒在细胞分裂过程中随 着质膜位点的别离而别离.高拷贝数的质粒常常具有增加质粒适当别离的位 点,但是这些区域并没有相同的结构,并不以相同的机制起作用.例如,质 粒pSCl01的par区可以增加质粒的超螺旋,至于超螺旋的增加如何帮助质粒 的适当别离是不清楚的.可能是增强了质粒别离后的迅速复制,预防了下次 分裂时的丧失.(3)质粒溺爱(plasmid addiction)即使质粒具有别离功能,质粒也会从增殖的细胞中丧失.在一类复仇

26、的细胞 中,质粒能够编码一些杀死丧失了质粒的细胞.像 F质粒、R1质粒、以及 P1噬菌体都有这种功能.这些质粒编码一些毒性蛋白质,这些蛋白质一旦表 达就会杀死细胞.根据质粒的来源不同,毒性蛋白质可通过各种方式杀死细 胞.例如,质粒的毒性蛋白Ccd,通过改变DNA螺旋酶来杀死细胞,由于螺旋酶 的改编,引起了双螺旋DNA的断裂.质粒R1的杀手蛋白Hok,破坏细菌细胞 质膜的功能,引起细胞活力的丧失.为什么毒性蛋白仅仅是在细胞丧失了质 粒之后立即杀死细胞当细胞含有这种质粒时,沉溺系统的蛋白质或 RNA可 作为一种解毒药,既能阻止毒蛋白的合成,又能同毒蛋白结合并阻止毒蛋白 起作用.然而,这些其他基因的

27、产物要比毒性蛋白不稳定得多,所以它们会很快失活.如果一个细胞丧失了质粒,既没有毒性蛋白也没有解毒剂的合成.但是,由 于解毒剂更不稳定,当解毒剂失活后,毒性蛋白就可以起杀伤作用.这些系 统使细胞对质粒产生溺爱,并预防细胞丧失质粒.9 .答:(1)非传递性和不被带动转移.对于多数基因克隆操作来说,都不希望载体能 够进行自主传递,也不希望被带动转移.(2)具有条件致死突变,如温度敏感质粒 pJC307(ColEl的衍生质粒)在哺乳动 物正常体温下就丧失复制水平,可预防克隆基因扩散,只存在于限定的宿主 细胞中.(3)一般情况下不希望与宿主染色体发生重组,由于重组后有可能给宿主带来 突变.(4)有较小的

28、宿主范围.10 .答：(1)菌体DNA没有容载水平,由于噬菌体的头部对DNA包装的量是有限制的, 不能大于基因组的105%,所以要将噬菌体改造成载体,必须削减分子量.(2)野生型的 DNA对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点,不便于克 隆.(3)没有可供选择的标记.(4)野生型的 噬菌体具有感染性,因此不够平安.11 .答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体.主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌一半乳糖甘酶的基因片段,携带有lac基因片段的载体转入lac的宿主菌后,在含有5一澳4一氯一3一引口朵一 一D 一半乳糖甘 (X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑.外源基因插人lac(或l

29、ac基因局部被取代)后,重组的噬菌体将丧失分解 X-gal的水平,转入lac-宿主菌后,在含有5 澳4一氯一3一引口朵一 一D 一半乳糖甘(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑,非 重组的噬菌体那么为蓝色噬菌斑.12 .答：一半乳糖甘酶的N末端是非必需的,可以进行修饰,并不影响酶的活性或 肽的互 补性.如果插入的外源 DNA引起 肽的可读框的改变,或者插 入片段在正确的可读框中含有终止密码的话,就会形成白色噬菌斑.如果插入DNA的碱基数正好是3的倍数,或者插入的DNA中不含有终止密码的话,仍 然会形成蓝色噬菌斑.这种插入物的长度可达几百个碱基对.M13载体的这种性质可以用来检测和选择产生新的终止

30、密码或改变可读框,即移码突变.13 .答M13克隆系统具有很多优点：(1)克隆的片段大：M13噬菌体的DNA在包装时不受体积的限制,所以容载水平大,有报道,有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体DNA长6一7倍的DNA(插人片段可达40kb)o(2)可直接产生单链DNA ,这对于DNA测序、DNA诱变、制备特异的单链 DNA探针都是十分有用的.(3)单链DNA和双链DNA都可以转染宿主,并可根据人工加上的选择标记进 行筛选.M13克隆系列的缺乏：(1)较大的外源片段插入后,在扩增过程中往往不够稳定,一般说,克隆的片 段越大,发生丧失的机率越大.(2)单链载体分子感染的细胞中,往往是单链和双链

31、混杂,别离双链比拟麻烦.14 .答：主要特点有：(1)具有质粒复制子,进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制,并且能够被 氯霉素扩增.(2)具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记.(3)具有噬菌体的包装和转导特性.(4)容载水平大.克隆的最大片段在 45kb,最小片段为19kb.(5)简化了筛选.如果载体的分子量在 5kb的话,得到的转导子几乎排除由载 体自连的可能性,由于要被成功包装,至少要7个分子的载体自连,尽管如 止匕,也是不能被包装的,由于 COS位点太多了.黏粒载体也有如下缺乏：(1)如果两个黏粒之间有同源序列,可能会发生重组, 结果会使被克隆的片段重排或丧失.(2)含不同重组DNA片

32、段的菌落生长速度不同,会造成同一个子板上菌落大 小不一.另外由于不同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同,会造成文库扩增量的比例失调.(3)包装过程复杂,包装效率不稳定,代价高.15 .答:虽然噬菌粒载体携带有 M13的IG区,能够合成单链DNA,但是它没有M13 的功能基因,没有M13基因2的产物存在,所以不能合成单链 DNA.而辅助 噬菌体具有M13的所有功能基因,但是IG区是缺陷的,辅助噬菌体本身的 DNA不能进行单链复制,于是就可以为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白.辅助噬菌体必需具备如下条件：1助噬菌体的DNA IG区必需失去功能,其本身的 DNA不会被包装到成熟 的噬菌体颗粒中；2由于

33、辅助噬菌体的IG区失活,其本身的基因不能表达,要使辅助噬菌体 的所有功能基因都能进行表达,必须在辅助噬菌体的基因组中导人新的复制 起点；3辅助噬菌体的基因组中具有选择标记,便于识别和收集一定数量的辅助噬 菌体.16 .答：可以通过合成核甘酸探针或设计简并 PCR引物从cDNA文库或基因组文库中 筛选.或者利用相应的抗体从 cDNA表达文库中筛选相应的克隆.17 .答：基因文库,或克隆文库,是一群细菌克隆,每个克隆含有一个带有某一供体生物不同DNA片段的质粒或噬菌体载体；这群克隆有 95%-99%的可能性使 基因组DNA的每一片段至少存在于一个克隆中.一个基因文库一旦建立,任 一特定的克隆都可被

34、回收用于研究其所携带的基因,因而在需要克隆某一特定基因时就预防了逐个巡查克隆的耗时过程. 为减少所要收集的克隆的数目,最 普遍采用的载体是噬菌体的一种衍生载体,它可容纳 1220kb的供体DNA片段,这点与pBR322不同,它可插入的外源DNA最大约为5kb.18 .答：基因组文库是用基因工程的方法,人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群.一般以改造的噬菌体 DNA或黏粒作为载体,包括下列过程：1高分子量染色体 DNA的制备；2体外重组连接；3包装蛋白的 制备；4重组体的体外包装；5将重组DNA导人寄主细胞；6筛选.基因 组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念.基因库gen

35、e pool是指在进行有性生殖的某一群体中,能进行生殖的个体所含总的遗传信息.在基因组文库的构建中,由于使用的载体不同,分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因 组文库、YAC文库、BAC文库等.19 .答：同mRNA互补的DNA称为cDNA.cDNA文库是以某一生物的总 mRNA为 模板,在无细胞系统中,在反转录酶的作用下,首先合成一互补的DNA,即第一链,破坏RNA模板后,再以第一链为模板合成第二链,得到的双链DNA 称为cDNA.选用适合的载体,将合成的cDNA重组导人寄主细胞,经筛选得 到韵cDNA克隆群称为cDNA文库.由于cDNA技术合成的是不含内含子的 功能基因,因此是克隆真核生物基因

36、的一种通用方法.由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的,具有发育的阶段性和时间 性.有些那么需要特殊的环境条件.所以,cDNA文库是不可能构建得十分全, 也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因.cDNA文库与基因组文库的主要差异是：(1)基因组文库克隆的是任何基因,包括未知功能的DNA序列,cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因,包括调节基因；(2)基因组文库克隆的是全部遗传信息,不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列,因它受发育和调控因子的影响；(3)基因组文库中的编码基因是真实基因,含有内含子和外显子；而 eDNA克 隆的是不含内含子的基因

37、.20 .答：黏性末端连接法缺乏之处有：(1)载体易自身环化；(2)假设是用同一种限制性内 切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；(3)难插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重组率较低,即使用碱性磷酸酶处理了载体,预防了载 体的自身环化,载体也有成环的倾向；(5)用这种方法产生的重组体往往含有 不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体,增加筛选工作的困难.21 .答：所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链 DNA的3'端各加 上一段寡聚核甘酸,制成人工黏性末端,外源 DNA和载体DNA分子要分别 加上不同的寡聚核甘酸,如dA(dG)和dT(dC),然后

38、在DNA连接酶的作用下涟接成为重组的DNAo这种方法的核心是利用末端转移酶的功能,将核甘酸转 移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'-OH上.以Mg2+作为辅助因子,该酶可 以在突出的3'-OH端逐个添加单核甘酸,如果用Co2+作辅助因子那么可在隐蔽的 或平末端的3'-OH端逐个添加单个核甘酸.同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法,具有很多优点：.1首先不 易自身环化,这是由于同一种 DNA的两端的尾巴是相同的,所以不存在自身 环化.2由于载体和外源片段的末端是互补的黏性末端,所以连接效率较高.3用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接.同聚物加尾法也 有

39、一些不便之处：1方法繁琐；2外源片段难以回收.由于添加了许多同聚 物的尾巴,可能会影响外源基因的表达.另外要注意的是,同聚物加尾法同平 末端连接法一样,重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点.22 .答：将人工合成的或来源于现有质粒的一小段 DNA分子在这一小段DNA分子 上有某种限制性内切核酸酶的识别序列,加到载体或外源DNA的分子上,这 样便在载体DNA和外源DNA上制造出新的酶切点.把这一小段含有酶切点 的DNA分子称为连接器分子,这种方法称为接头连接法.23 .答：同裂酶是一类识别序列不完全相同,但是产生的黏性末端至少有四个碱基相 同的限制性内切核酸酶.用这些限制性内切核酸酶处

40、理载体和外源DNA得到的末端可以通过黏性末端连接法连接.同裂酶产生的黏性末端虽然可以像完全亲和的黏性末端那样进行连接,但是 它与完全亲和的黏性末端连接不同的是,连接后的产物往往失去原有的限制性 内切核酸酶的切点,但是能够被另外一种同裂酶识别. 这样用同裂酶进行体外 重组时,在限制性内切核酸酶切割反响之后不必将原有的内切酶失活,就可直接进行重组连接.由于连接体系中有原有的限制性内切核酸酶的存在,就不会发生载体自连,从而保证了载体同外源 DNA的连接.所以在这种连接反响中 不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷反响而得到最高的连接效率.反响中通常要涉及三种不同的限制性内切核酸酶,其中两种是识别六碱基的 酶

41、,另一种是识别四碱基的酶.24 .答：由于基因已被测序并进行了分析,因此前体mRNA结构是的.这对了解 蛋白质的功能区是十分重要的,可以预防有关多肽译后加工的一些问题. 对 于间断基因,cDNA可以用外显子DNA探针通过体外杂交得以鉴定.将拟南 芥的基因组DNA或cDNA分别克隆到酵母人工染色体(YAC)上作为定位或筛 选的融合标签,基因可以在酵母中作为细胞质蛋白质或分泌蛋白质进行表达.25 .答：(1)加四环素；(2)Tetr Kans和Tef Kanr; (3)重新点种在含Tet、Kan和只力口 Tet 的平板上,选择只在Tet平板上生长的菌落,即为所需的重组体.26 .答：原理：由于四环

42、素的作用只是抑制细菌蛋白质的合成,而不是杀死细菌；而氨基酸 类似物环丝氨酸如果掺人蛋白质,那么是致命的.因此在有四环素的条件下, 环丝氨酸能够杀死tetr而不杀死tets的细菌.经过环丝氨酸处理后,存活的细 胞中tets型得到很大富集,而经过假设干次连续处理,即能获得在tetr基因内含有插人物的质粒的细胞.根本操作：(1)转化后有三种表型的细菌,其中只有一种是重组体：AprTCs;(2)用重组DNA转化受体菌后,将受体菌培养在加有四环素和环丝氨酸的培 养液中培养；此时只有非重组的双抗性菌可以生长,其他都被抑制；(3)由于有环丝氨酸的存在,Ap rTcs表型的菌生长到一定程度就会死亡；(4)由于

43、四环素只有抑菌而无杀菌作用,此时假设解除四环素(离心洗涤),参加氨基苇青霉素继续培养,那么可使重组体大量生长.27 .答：这一方法的根本原理是根据抗体、抗原分子的三个根本特性而设计的一种筛选鉴定重组体的方法.这三个根本特性是：(1)抗体分子可以牢固地吸附在固体基质(如聚乙烯塑料)上而不被洗脱掉；(2)一个抗原可以同几种不同的抗体结合；(3)抗体分子可以通过碘化作用被125I标记.28 .答：随机引物是人工合成的长度为 6个核甘酸的寡聚核甘酸片段群体,含有各种可能的排列顺序(46=4096);或是用DNA酶处理小牛胸腺DNA后获得的6 12个碱基的片段.将待标记的 DNA片段同随机引物一起进行杂

44、交,并以杂 交体上的寡聚核甘酸为引物,在 Klenow酶的作用下合成互补DNA链,当反 应底物中有放射性的dNTP时,新合成的DNA就带上了标记.29 .答：通过一定的物理学方法将 DNA或RNA从凝胶上转移到固体支持物,然后同 液体中的探针进行杂交.DNA或RNA从凝胶向滤膜转移的过程称为印迹, 故此将这种杂交称为印迹杂交.30 .答：根据微孔滤膜杂交和原位杂交的原理而改进的一种筛选重组体的一种核酸杂交方法.它是将生长在或影印在微孔滤膜上的菌落(或噬菌斑)原位溶菌,原位进行DNA变性并原位固定在滤膜上,然后用放射性标记的探针同固定了 的DNA进行杂交经放射自显影后,确定哪一个菌落含有重组的D

45、NA分子,再从参比平板上选取重组体.31 .答：1975年Southern建立起来的一种杂交方法,属固相一液相杂交.该法的主要 特点是利用毛细现象将 DNA转移到固体支持物上,称为 Southern转移或 SouthernE迹(Southern blotting).它首先用适宜的限制性内切核酸酶将 DNA 切割,进行电泳别离后,利用枯燥的吸水纸产生毛细作用, 使液体经过凝胶, 从而使DNA片段由液流携带从凝胶转移并结合在固体支持物外表.32 .答：Northern印迹的原理同Southern印迹相比有两点不同：(1)转移的对象不同,Northern印迹是将RNA变性及电泳别离后,将其转移 到固

46、相支持物上的过程.(2)虽然RNA电泳前不需像DNA那样进行酶切,但也需要变性.不过变性方 法是不同的,它不能用碱变性,由于碱变性会导致RNA的降解.33 .答：带有某一细菌基因的克隆通常可以直接看出来,由于基因表达引起了宿主细胞表型的可见变化.然而,真核生物的基因不都表达,那么需用相应的方 法来找出带有所需基因特定克隆.一个常用方法是杂交(图A21. 1):(1)从不同的克隆提取 DNA,固定于硝酸纤维素滤膜上,然后用 NaOH使之变性(图A21 . 1.1).(2)探针必须能与所需的基因互补且被 32P标记.探针可以是来自另一不同生 物体的相关的基因,或是依据与基因特异相关蛋白质的氨基酸序

47、列设计并 经化学合成的一小段DNA分子(图A21 . 1. 2).(3)探针只会与特定基因进行碱基配对(杂交),冲洗滤膜后,未结合上的标记 探针会被除去(图A21. 1.3).(4)烘干滤膜后进行放射自显影后,所需的克隆就以一个黑点在胶片上显示出 来,这就是菌落或原位杂交分析.五、综合题1.答：要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达,通常遇到的问题有：(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子.(2)大多数真核基因有内含子,这些内含子在转录后从前体 mRNA中被切除而 形成成熟mRNA.细菌细胞没有这样的机制来去除内含子.(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分于加工而来的,例如胰岛素就

48、是通过加工去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来,剩下的两段肽链分别形成胰岛素的、链.(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解.针对上述可能出现的问题,建议在克隆的过程中采取以下举措：应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子的附近(含有这种序列的载体称表达载体).可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因.这种 DNA不含 内含子可插入到载体中进行克隆.止匕外,如果蛋白质序列短那么可通过化学合 成得到该基因.合成的基因应含起始密码ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列,以及 1 2个终止密码：ATG编码序列TGA TAG现在,这个合成基因可被插入载体中.有时加工过程可以在离体条件下进行. 如果加工