化学生物学导论-第三章核酸4-5节ppt课件

1、Nucleic Acid王骊丽王骊丽u DNA碱基顺序的测定碱基顺序的测定u RNA碱基顺序的测定碱基顺序的测定第四节第四节 核酸碱基序列顺序分析核酸碱基序列顺序分析(Sequence analysis of nucleic acids)DNA 碱基顺序测定的根本步骤碱基顺序测定的根本步骤uDNA 片断的制备片断的制备uDNA碱基顺序测定碱基顺序测定DNA 片断的制备片断的制备由于由于DNA的分子量很大，需求先将的分子量很大，需求先将DNA分子切割分子切割或可以用于测定的小片段，共包括部分：或可以用于测定的小片段，共包括部分： DNA分子酶解：将相对分子量质量大的片断用分子酶解：将相对分子量质

2、量大的片断用限制性内切酶技术完成，使切割成可以用于测定的限制性内切酶技术完成，使切割成可以用于测定的小片段小片段300-500bp)； PCR技术扩增技术扩增DNA片段：片段：DNA片段数量少的情片段数量少的情况下，以获取一定数量用于序列测定。况下，以获取一定数量用于序列测定。前往 杂交测序法杂交测序法 质谱法质谱法 单分子测序法单分子测序法 原子探针显微镜测序法原子探针显微镜测序法DNA 芯片法芯片法 化学降解法化学降解法 (Maxam-Gillbert法法,1977)双脱氧链终止法双脱氧链终止法 (sanger法法,1977)新技术方法新技术方法核酸序列分析核酸序列分析Nucleic Ac

3、id Sequence Analysis经典方法经典方法一、以化学裂解反响为根底一、以化学裂解反响为根底化学降解法化学降解法根本原理：基于有机化学方法，选择性地切断根本原理：基于有机化学方法，选择性地切断核苷酸核苷酸A、G、C或或T所构成的磷酸二酯键，得所构成的磷酸二酯键，得到不同链长的到不同链长的DNA小片段；将这些片段经电泳分别；小片段；将这些片段经电泳分别；分析前，用同位素标志分析前，用同位素标志DNA的的5末端，经放射自显末端，经放射自显影即可在影即可在X胶片上读出胶片上读出DNA链的序列。链的序列。主要两个步骤：碱基选择性水解；对水解产物主要两个步骤：碱基选择性水解；对水解产物DNA

4、小片段进展电泳分析和碱基顺序的推断。小片段进展电泳分析和碱基顺序的推断。 硫酸二甲酯硫酸二甲酯DMS ：使：使DNA分子中嘌呤碱基选择性水解，分子中嘌呤碱基选择性水解，分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：N3-甲基腺嘌呤核苷甲基腺嘌呤核苷和和N7-甲基鸟嘌呤核苷；甲基鸟嘌呤核苷； 肼：使肼：使DNA分子中嘧啶碱选择性水解，胸腺嘧啶分子中嘧啶碱选择性水解，胸腺嘧啶T和胞和胞嘧啶嘧啶C的嘧啶环断裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存的嘧啶环断裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存在下水解，核糖腙在下水解，核糖腙3 -位的磷酸酯键那么被水解断裂；但高位的磷酸酯键那么被水解断裂；但

5、高盐条件下，只盐条件下，只C断裂，而不与断裂，而不与T反响。反响。 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。特异性碱基化学切割反响特异性碱基化学切割反响(1) G反响：反响：DMS使使G在中性和高温条件下零落。在中性和高温条件下零落。 G+A反响：酸性条件如甲酸可使反响：酸性条件如甲酸可使A和和G嘌嘌呤环上的呤环上的N原子质子化，利用哌啶使原子质子化，利用哌啶使A、G零落。零落。 T

6、+C反响：肼低盐反响：肼低盐 C反响：肼高盐反响：肼高盐 测定测定DNA长度长度250bp。特异性碱基化学切割反响特异性碱基化学切割反响(2)化学裂解法测定化学裂解法测定DNA的核苷酸序列的核苷酸序列前往二、以运用二、以运用DNA聚合酶为根底聚合酶为根底-DNA链末端终止法链末端终止法 根本原理：以根本原理：以DNA的酶促合成为根底，以被的酶促合成为根底，以被测测DNA单链为模板，经过特殊设计的单链为模板，经过特殊设计的“末端终止末端终止技术合成出一系列相差一个核苷酸长度的互补技术合成出一系列相差一个核苷酸长度的互补链，然后利用凝胶电泳分别这些不同长度的链，然后利用凝胶电泳分别这些不同长度的D

7、NA小片段，以此推测确定待测小片段，以此推测确定待测DNA链的碱基链的碱基顺序。顺序。 主要步骤包括：末端终止法合成不同长度主要步骤包括：末端终止法合成不同长度DNA小片段；小片段；DNA小片段电泳图谱解析。小片段电泳图谱解析。1977年年sanger发明末端终止法发明末端终止法“加减法加减法Sanger双脱氧终止法双脱氧终止法DNA酶法测序酶法测序DNA自动测序仪自动测序仪Sanger法开展过程法开展过程1、“加减法测定加减法测定DNA序列的原理序列的原理 以待定片断的单链以待定片断的单链DNA为模板，首先加上一个为模板，首先加上一个适当的引物普通用限制性内切酶解片段，适当的引物普通用限制性

8、内切酶解片段，再参与再参与4种脱氧三磷酸种脱氧三磷酸dNTP)为底物，其中一为底物，其中一种用放射性同位素种用放射性同位素32P标志例如标志例如32PdATP) ,再再参与参与DNA聚合酶聚合酶IKlenow片断；片断； 从引物从引物3端合成出一条与模板互补的、具有放端合成出一条与模板互补的、具有放射性标志的射性标志的dDNA 链混合物，反响尽量不同步，链混合物，反响尽量不同步，使合成的产物中各种长度的片断都存在，然后使合成的产物中各种长度的片断都存在，然后经过琼脂糖柱纯化，除去反响混合物中多余的经过琼脂糖柱纯化，除去反响混合物中多余的4种种dNTP,将纯化后的混合物分成两份，分别进展将纯化后

9、的混合物分成两份，分别进展加减法反响系统。加减法反响系统。*少一个少一个OH脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸构造脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸构造2、双脱氧链终止法、双脱氧链终止法根本原理：根本原理： 直接引入双脱氧核苷三磷酸作为链终止剂；直接引入双脱氧核苷三磷酸作为链终止剂； 将待定将待定DNA片断分为片断分为4组，在反响体系中依然以组，在反响体系中依然以DNA单链单链为模板，需求引物为模板，需求引物 、 DNA聚合酶和聚合酶和4种种dNTP(其中一种用其中一种用32P/35S标志标志) 、一定比例不同种类的终止剂、一定比例不同种类的终止剂2，3-双脱氧三双脱氧三磷酸磷酸(ddNTP，特异性末端终止剂，特

10、异性末端终止剂) ； 在在DNA合成反响混合物的合成反响混合物的4种种dNTP参与少量的一种参与少量的一种ddNTP后，链的延伸将与偶而发生但却非常特异的链终止竞争，后，链的延伸将与偶而发生但却非常特异的链终止竞争，反响产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始反响产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的间隔。合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的间隔。分别得到分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段。结尾的片段。前往3、DNA酶法测序酶法测序 平行进展四组反响，每组反响均运用一样的模板，平行进展四组反响，每组反响均运用一样

11、的模板，一样一样 的引物以及四种脱氧核苷酸；的引物以及四种脱氧核苷酸；在四组反响中各参与适量的四种之一的双脱氧核在四组反响中各参与适量的四种之一的双脱氧核苷酸，苷酸， 使其随机地接入使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生链中，使链合成终止，产生相应的相应的 四组具有特定长度的、不同长短的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。链。 四组四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分别短分别 开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测被测 DNA的核苷酸序列的核苷酸序列,如以下图所示：如以下图所示： DNA酶

12、法测序酶法测序三、三、DNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标志是实现采用荧光替代放射性核素标志是实现DNA序列序列分析自动化的根底。用不同荧光分子标志四种双脱分析自动化的根底。用不同荧光分子标志四种双脱氧核苷酸，然后进展氧核苷酸，然后进展Sanger测序反响，反响产物经测序反响，反响产物经电泳平板电泳或毛细管电泳分别后，经过四种电泳平板电泳或毛细管电泳分别后，经过四种激光激发不同大小激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定此确定DNA碱基的陈列顺序。碱基的陈列顺序

13、。 第一步第一步 参与复制终止剂参与复制终止剂荧光检测探头荧光检测探头电泳，看谁电泳，看谁跑得快跑得快ddNTPs参与下的参与下的DNA复制复制 Sanger法测序产物的平均链长取决于法测序产物的平均链长取决于ddNTP：dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；的比例，比例高时，得到较短的产物；“标志终止法测序产物的平均长度可经过标志标志终止法测序产物的平均长度可经过标志反响中反响中dNTP浓度浓度(高浓度能得到长的产物高浓度能得到长的产物)或终止反或终止反响的响的ddNTP:dNTP来调整。来调整。第二步第二步 荧光检测荧光检测 DNA 带负电带负电 DNA在电泳胶中在电泳胶中的迁移率与其

14、片段的迁移率与其片段大小有关大小有关DNA自动测序结果自动测序结果RNA 碱基顺序测定方法碱基顺序测定方法 RNA 链碱基顺序的测定比较复杂；链碱基顺序的测定比较复杂； 逆转录法，以待测的逆转录法，以待测的RNA链为模板，在逆转录酶链为模板，在逆转录酶纯化下，合成纯化下，合成DNA(与与RNA互补的互补的DNA分子，常分子，常用用cDNA 表示表示)； 用化学降解法用化学降解法 或双脱氧链终止法测定或双脱氧链终止法测定DNA碱基顺碱基顺序，再得出序，再得出RNA的碱基顺序。的碱基顺序。运用一套知序列的寡核苷酸探针去寻觅靶运用一套知序列的寡核苷酸探针去寻觅靶DNA链上的链上的互补序列，靶互补序列

15、，靶DNA上的序列根据杂交情况来确定。上的序列根据杂交情况来确定。杂交测序一、化学正在向生命科学领域浸透。一、化学正在向生命科学领域浸透。 二、二、DNA DNA 测序的研讨任务测序的研讨任务, , 历经了数十年历经了数十年, , 成果辉成果辉煌煌, , 曾两次获得诺贝尔奖。而后基因组的研讨任务曾两次获得诺贝尔奖。而后基因组的研讨任务是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家更大的发明力！更大的发明力！分析化学的新开展分析化学的新开展正在开展的几种测序方法正在开展的几种测序方法 1毛细管电泳激光荧光法毛细管电泳激光荧光法2超薄层板电泳激光荧光法超薄层板

16、电泳激光荧光法3八聚体测序技术八聚体测序技术4转录测序转录测序5质谱法质谱法6原子探针显微镜原子探针显微镜7流动式单分子荧光检测法流动式单分子荧光检测法8芯片测序芯片测序 核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为资料，核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为资料，经水解，测定核苷酸组成及比例；经水解，测定核苷酸组成及比例； 先以外切酶确定先以外切酶确定5- 或或3-末端核苷酸，再以内切酶末端核苷酸，再以内切酶将核酸链分为假设干寡核苷酸段，分段测定核苷将核酸链分为假设干寡核苷酸段，分段测定核苷酸组成、比例和序列；酸组成、比例和序列； 最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个最后将核苷酸序列的各寡核

17、苷酸重叠，确定整个核酸分子的核苷酸序列。核酸分子的核苷酸序列。核酸碱基顺序测定核酸碱基顺序测定酶酶底物底物作用部位作用部位作用产物作用产物外切酶外切酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶 DNA， RNA5端，端，5 连接处连接处3 核苷酸核苷酸3 端，端，3 连接处连接处5 核苷酸核苷酸内切酶内切酶脱氧核糖脱氧核糖核酸酶核酸酶 IDNA3 连接处连接处3 -羟核苷酸为羟核苷酸为3 末端寡末端寡核苷酸及剩余部分核苷酸及剩余部分脱氧核糖脱氧核糖核酸酶核酸酶II5 连接处连接处3 -核苷酸为核苷酸为3 末端寡核末端寡核苷酸及剩余部分苷酸及剩余部分核糖核酸核糖核酸 酶酶T1RNA5 连接处碱基是连接处碱基是G3 -

18、鸟苷酸为鸟苷酸为3 末端寡核末端寡核苷酸及剩余部分苷酸及剩余部分核糖核酸核糖核酸 酶酶 I5 连接处碱基是连接处碱基是 Pyr3 -嘧啶类核苷酸为嘧啶类核苷酸为3 末末端寡核苷酸及剩余部分端寡核苷酸及剩余部分前往第五节第五节 核酸的催化性质核酸的催化性质The catalytic properties of The catalytic properties of nucleic acidsnucleic acids核酶核酶Ribozyme核酶的发现核酶的发现核酶的催化性质核酶的催化性质核酶的研讨中的两个问题核酶的研讨中的两个问题核酶的发现核酶的发现 Altman发现发现RNase-P的蛋白部分

19、不具催化功能，的蛋白部分不具催化功能，而而RNA部分在有足够浓度部分在有足够浓度Mg2+离子存在下，能起离子存在下，能起核酸水解酶的作用。核酸水解酶的作用。 Cech发现发现RNA原生动物四膜虫的原生动物四膜虫的Pre-rRNA是一种是一种具有自催化性能的核酶。具有自催化性能的核酶。 证明了核酸既是信息分子，又是功能分子证明了核酸既是信息分子，又是功能分子 核核 酶酶u 催化性催化性DNA (DNAzyme) 人工合成的寡聚脱氧人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。 u 催化性催化性RNA (ribozyme) u 序列特异性的核酸内切酶序列特异

20、性的核酸内切酶u 参与参与RNA转录后加工修饰转录后加工修饰u 作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解mRNA。 核酶的催化性质核酶的催化性质 RNA作用于作用于RNA 核酸酶催化的反响主要包括核酸酶催化的反响主要包括:水解反响水解反响(RNA限限制性内切酶活性制性内切酶活性)，衔接反响，衔接反响(聚合酶活性聚合酶活性)和转和转核苷酰反响等。核苷酰反响等。 最近核酸酶的其他作用底物也已被发现，如多最近核酸酶的其他作用底物也已被发现，如多糖、糖、DNA以及氨基酸酯等。以及氨基酸酯等。核酶的催化过程图核酶的催化过程图转酯作用转酯作用核酸酶是指一切可以水解核酸的酶核酸酶是指

21、一切可以水解核酸的酶根据底物不同分类根据底物不同分类DNA酶酶(deoxyribonuclease, DNase) RNA酶酶 (ribonuclease, RNase) 根据切割部位不同分类根据切割部位不同分类核酸内切酶：核酸内切酶： 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 非特异性核酸内切酶非特异性核酸内切酶核酸外切酶：核酸外切酶：5 3 或或3 5 核酸外切酶。核酸外切酶。u参与参与DNA的合成与修复及的合成与修复及RNA合成后的剪合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程接等重要基因复制和基因表达过程 u担任去除多余的、构造和功能异常的核酸，担任去除多余的、构造和功能异常的核酸，同时也可以去除侵入细胞的外源性核酸同时也可以去除侵入细胞的外源性核酸 u在消化液中降解食物中的核酸以利吸收在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 u体外重组体外重组DNA技术中的重要工具酶技术中的重要工具酶 生物体内的核酸酶担任催化细胞内外核酸的降解生物体内的核酸酶担任催化细胞内外核酸的降解 核酸酶的功能核酸酶的功能 The crystal structure of the L1 ligase ribozyme. (Credit: M. Robertson and W. Scott (Science, March 16, 2