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1、高效液相色谱培训高效液相色谱培训江苏天瑞仪器股份庞秀权2019.8.16内容 1 液相色谱简介 2 液相色谱仪的组成和原理和常见缺点 3 液相色谱方法的建立第一部分第一部分液相色谱简介液相色谱简介lHPLC的实际开展简况的实际开展简况l色谱法的分别原理是：溶于流动相色谱法的分别原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定中的各组分经过固定相时，由于与固定相相(stationary phase)发生作用吸附、分配、发生作用吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和的大小、强弱不同，离子吸引、排阻、亲和的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相在固定相中滞

2、留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。中流出。又称为色层法、层析法。l色谱法最早是由俄国植物学家茨维特色谱法最早是由俄国植物学家茨维特Tswett在在1906 年研讨用碳酸钙分别植物色年研讨用碳酸钙分别植物色素时发现的，色谱法素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得因之得名。后来在此根底上开展出纸色谱法、薄层色名。后来在此根底上开展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。谱法、气相色谱法、液相色谱法。l液相色谱法开场阶段是用大直径的玻璃管柱液相色谱法开场阶段是用大直径的玻璃管柱在室温暖常压下用液位差保送流动相，称为经在室温暖常压下用液位差保送流动相，

3、称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长常有典液相色谱法，此方法柱效低、时间长常有几个小时。高效液相色谱法几个小时。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的根底上，于是在经典液相色谱法的根底上，于60 年年代后期引入了气相色谱实际而迅速开展起来的。代后期引入了气相色谱实际而迅速开展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压保送流动相，故又称高压液相色谱法用高压保送流动相，故又称高压

4、液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱法法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。也称现代液相色谱。茨维特的实验2 HPLC的特点和优点的特点和优点HPLC 有以下特点：高压-压力可达150300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2 以上。高速-流速为0.110.0 ml/min。高效-可达5000 塔板每米。在一根柱中同时分别成份可达100 种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时耗费样品

5、少。HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在5 min 内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以到达最正确分别效果。灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复运用-用一根色谱柱可分别不同的化合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以搜集单一组分或做制备。3 液相色谱法的分类液相色谱法的分类 按流动相的物态分: 气相色谱(Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相(又叫载气) 液相色谱(Liquid Chromatography, LC) 用液体作为流动相(又

6、叫洗脱剂) 按固定相的形状分: 平面色谱纸色谱薄层色谱 柱色谱 按流动相和固定相的相对极性分: 正相色谱(Normal Phase Chromatography)固定相的极性大于流动相 反相色谱(Reversed Phase Chromatography)固定相的极性小于流动相 正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷，常参与乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调理组分的保管时间。常用于分别中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等。 反相色谱法普通用非极性固定相如C18、C8；流动相为水或缓冲液，常参与

7、甲醇、乙腈、异丙醇等与水互溶的有机溶剂以调理保管时间。适用于分别非极性和极性较弱的化合物。RPC 在现代液相色谱中运用最为广泛，据统计，它占整个HPLC 运用的80%左右。按分别过程的机理分:吸附色谱(Absorption Chromatography)根据样品组分对对性固定相外外吸附亲和力的不同实现分别分配色谱(Partition Chromatography)分别基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同离子交换色谱(Ion ExchangeChromatography)根据样品组份离子交换亲和力的差别分别,简称离子色谱(IC)体积排除色谱(Size Exclusion Chr

8、omatography)GPC(Gel PermeationChromatography)固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂GFC(Gel Filtration Chromatography)固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液4 液相色谱常用术语液相色谱常用术语色谱图(Chromatogram):色谱柱流出物经过检测器时所产生的呼应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间峰面积峰峰高规范偏向半峰宽基线峰宽 色谱峰(Peak):色谱柱流出组分经过检测器时产生的呼应信号峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间衔接的直线峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的间隔切线峰宽

9、(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的间隔半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):经过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧相交两点之间的间隔峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称呼应值规范偏向()(Standard Error):0.607倍峰高对应峰宽的一半拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰第二部分第二部分液相色谱仪组成、原理和常见液相色谱仪组成、原理和常见缺点缺点1 液

10、相色谱仪器的组成液相色谱仪器的组成2 流动相流动相必需做!溶剂和水的前处置：过滤设备和资料：溶剂过滤器、真空泵、0.45u或更 细的水性滤膜和有机滤膜过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵 抽滤过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，防止堵塞 色谱柱，尤其是运用无机盐配制 的缓冲液。必需做!溶剂和水的前处置：脱气吹氦脱气法吹氦脱气法加热回流法加热回流法抽真空脱气法抽真空脱气法超声波脱气法超声波脱气法在线真空脱气法在线真空脱气法 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确输液量均匀准确，并并且动动小保管时间及色谱峰面积的的现性提高 提高检测的性能防止气气引起的的峰基线线定，信信比比加溶剂的紫外吸收收底降

11、低 维护色谱柱动少少体积防止填料的的化如何排气色谱泵实验前，应先确确泵泵内内有气体，如有气体要按以下步骤排气：将泵入口管吸滤泵放入脱过气的流动相中翻开泵及在线脱气机电源开关将排液阀翻开，或断开与色谱柱衔接的管路设置流速到5ml/min,排液阀出口有液流延续流出必要时用10ml注射器从泵入口注入流动相停顿泵流速,封锁排液阀,恢复断开的管路,备用注:泵排气后,应输液线定(系统压力且动小,普通在几十Psi以内),否那么,需的做排气操作流动相过滤泵产生的问题流动相过滤泵产生的问题 缺点特征“鬼峰(由已被污染的过滤泵呵斥)保管时间不断改动(由于过滤泵堵塞或部分堵塞 压力偏低，吸不到流动相 溶剂过滤泵的清

12、洗：取下过滤泵放在甲醇、异丙醇或水中超声清洗15分钟 试剂的选择试剂的选择 溶剂的等级溶剂的等级 HPLC级级 优级纯优级纯 分析纯分析纯都经过蒸馏和都经过蒸馏和0.45u的过滤的过滤(除纤维毛除纤维毛,未溶解的机械颗粒未溶解的机械颗粒)优级纯的纯度比分析纯大优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗的化剂但里面含有防腐剂和抗的化剂HPLC级经过级经过0.2u的过滤的过滤,并除去有紫外吸收的杂质并除去有紫外吸收的杂质溶剂纯度的影响溶剂纯度的影响 溶剂中的杂质会导致出现“鬼峰，特别是 梯度洗脱时 留意： 只能运用色谱级的溶剂! 不能运用旧的或未经过滤的缓冲溶液水的选择水的选择 HPLC用水可以

13、经过以下几个方面来得到： 1 专门的纯水机或超纯水机； 2 去离子水重蒸； 3 二次或三次重蒸水； 4 采用类似家用的纯水机； 5 市场上瓶装的纯真水或蒸馏水； 6 其它途径；超纯水的运用流动相的保管流动相的保管有机溶剂流动相有机溶剂流动相:室温下密封室温下密封,避光保管避光保管缓冲盐流动相缓冲盐流动相:当日现配现用当日现配现用低温下密封保管低温下密封保管,普通不超越普通不超越3天天防止微生物生长防止微生物生长有机溶剂与水缓冲盐配的流动相有机溶剂与水缓冲盐配的流动相:低温密封保管低温密封保管防止有机相的挥发防止有机相的挥发选用适适的容器选用适适的容器3 泵泵T泵：串联式往复泵泵：串联式往复泵D

14、泵：并联式往复泵泵：并联式往复泵单向阀构造单向阀构造 单向阀原理单向阀原理抛光面宝石球流动相吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵泵单向阀污染单向阀污染 缺点：宝石球或球座受污导致密封不好缺点：宝石球或球座受污导致密封不好 外现：系统压力动摇大外现：系统压力动摇大 措施：措施： 拆下色谱柱，换上阻尼管，以异丙醇为流动相输液拆下色谱柱，换上阻尼管，以异丙醇为流动相输液 拆下单向阀，放入异丙醇、甲醇中，超声波清洗拆下单向阀，放入异丙醇、甲醇中，超声波清洗单向阀粘结单向阀粘结 缺点：宝石球粘附于垫片 外现：泵无法吸液或排液，流路不通 措施：1用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球与垫片分开 2拆下单

15、向阀，放入甲醇、异丙醇或水中，用超声波清洗柱塞密封圈的改换柱塞密封圈的改换 缺点：密封圈磨损导致密封不良 景象：系统压力动摇大或漏液 措施：改换密封圈 留意点： 1改换前，新密封圈用异丙醇 浸气15 min 2装配泵泵前，柱塞杆复位流动相泵泵清洗管路柱塞杆密封圈4 合器合器缺点： 堵塞景象： 系统压力动摇大或压力偏高，拆开后有 黑色污染物措施： 5%稀硝酸，超升波清洗，普通半年洗 一次。判别根据：封锁排液阀，断开出口管路，设定 流速1mL/min，如压力 大于3Kgf/cm2 ，那么堵塞。5 5 进样系统进样系统 手动进样器手动进样器定子转子针泵密封垫弹簧不锈钢套操作留意点：1插针应插究竟2不

16、运用时将针泵留在进样器内3进样应运用液相公用平泵进样针，有些国产进样针针泵较细，易引起残留。清洗：4样品分析后应及时清洗，防止样品对下次分析的残留，清洗应运用公用针口清洗器。5每次清洗分析前应清洗进样针，如有针尾的黑色污垢，可用碱外外对性剂清洗，再用水洗。 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。 手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充溢后，多余样品从放空孔排出； 将手柄转动至进样(Inject)位置时，

17、阀与液相流路接通，由泵保送的流动相冲洗定量环，推进样品进入液相分析柱进展分析。142356注射口接输液泵接色谱柱多余样品排放142356接输液泵接色谱柱样品装填形状 (LOAD)注射形状(INJECT) 虽然六通阀进样器具有构造简单、运用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的运用和维护将能比加运用寿命，维护周边设备，同时比加分析准确度。如运用得当的话，六通阀进样器普通可延续进样3万次而无需维修。 手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱泵上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中运用的注射器针泵有别于气相色谱

18、，是平泵注射器。一方面，针泵外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针泵刺坏密封组件及定子。 六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。运用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75，如20l的定量环最多进样15l的样品，并并要求每次进样体积准确、一样；运用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才干完全置换样品定量环内残留的溶液，到达所要求的精细度及的现性。引荐采用100ul的平泵进样针配合20ul满环进样。 可根据进样体积的需求自已制造定量环，普通不要求准确计算定量环的体积，譬如

19、，一根名义上10l的定量环，实践是9l还是1ll并不的要，由于被测样品和校正样品的进样体积坚持一致，在计算结果时误差都被抵消了。 进样样品要求无微粒和能阻少针泵及进样阀的物质，样品溶液均要用045m的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和动少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次终了后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针泵的外侧。 高效液相色谱柱开展史高效液相色谱柱开展史 19世纪世纪70年代中期，年代中期，HPLC仪开场出现，主要填料：仪开场出现，主要填料：10 m 的无定型硅胶颗粒

20、。的无定型硅胶颗粒。 70年代后期，开展了反相液相色谱。年代后期，开展了反相液相色谱。 80年代，年代，HPLC 被广泛运用于化合物的分别，主要填料：被广泛运用于化合物的分别，主要填料：粒径为粒径为5 10 m 球形硅胶。球形硅胶。 90年代早期，粒径为年代早期，粒径为 5 m 的高纯硅胶，即所谓的的高纯硅胶，即所谓的 B 型型硅胶被开展，并成为这个行业填料的规范，这种硅胶被开展，并成为这个行业填料的规范，这种 B 型硅型硅胶含有微量的金属。胶含有微量的金属。 90年代后期，为了满足快速分别的需求，开展了年代后期，为了满足快速分别的需求，开展了 3 m 或或 3.5 m 的球形硅胶，其作用和性

21、能逐渐的获得了人们的的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的确同和接受。确同和接受。 21世纪早期，为顺应超快速的分别要求，粒径小于世纪早期，为顺应超快速的分别要求，粒径小于 2 m 的填料被开发出来，开展出了整体柱、无机和有机杂化硅的填料被开发出来，开展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。胶。 目前，市场上流行的分析用的目前，市场上流行的分析用的 HPLC 硅胶基质填料主要硅胶基质填料主要为为 B 型硅胶。型硅胶。6 6 色谱柱色谱柱色谱分别淋洗液淋洗液 慢慢 中等中等 快快HPLCHPLC色谱柱及其填料的特征色谱柱及其填料的特征 HPLC HPLC 色谱柱的基质资料色谱柱的基质资料 硅胶与聚

22、合物硅胶与聚合物 现代高效液相色谱填料的特征现代高效液相色谱填料的特征 色谱柱构造色谱柱构造 固定相固定相 键合相键合相 键合相线定性键合相线定性硅胶基质资料硅胶基质资料目前运用最为广泛的基质资料。高机械强度和高的比外外积。可利用直接的广泛的外外键合反响来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。高效。的现性好。pH 适用范围为pH 28。具有容易导致强碱性物质拖尾的，外外对性和带酸性的硅羟基。聚合物基质资料聚合物基质资料 交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 pH 线定性好：pH 1 13。 可以在很宽的范围内进展外外化学处置以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体

23、积排阻色谱的需求。 在中等 pH 条件下对强碱性物质具有更好的峰形。 填料的体积随着流动相的不同而改动，如膨胀或收缩。 分别效率相对硅胶而言比较低 的现性不好硅胶外形的影响硅胶外形的影响无定型硅胶无定型硅胶: 最初的最初的 HPLC 填料填料粒径粒径 5 m柱床线定性差柱床线定性差比外外积较小比外外积较小价钱廉价价钱廉价球形硅胶球形硅胶: 现代现代 HPLC 填料填料粒径小粒径小 (5 m, 3 m, 2 m)的现性好的现性好 线定性好线定性好分别效率高分别效率高硅胶纯度的影响硅胶纯度的影响硅胶纯度对强极性化合物的分别最的要。以前的纯度较低的硅胶称为 A 型硅胶, A 型硅胶是以金属硅酸盐制备

24、而来，具有很高的金属含量，可被用作中性化合物和非离子化合物的分别。纯度高、酸性较弱的硅胶 (称为 B 型硅胶)，这种硅胶是以无金属的工艺制备而来，只含有微量的金属，建议用于分分别子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分别产生不对称峰或拖尾峰。硅胶纯度的影响硅胶纯度的影响M+外外金属能与螯合化合物络合 M Si OH 内部的金属对外外硅羟基具有对化作用强酸性硅胶孔径的影响硅胶孔径的影响孔径作用和效能 60 nm对 HPLC 分析内有用，会引起峰形拖尾和较低的分离效率60 150 nm对小分子的分离效果理想 (MW 1,000 nm对聚合物的分离效果理想，如

25、DNA和生物大分子硅胶粒径的影响硅胶粒径的影响粒 径作 用 和 效 能5 m目前应用最广泛，可以满足从分析到半制备的分离3 3.5 m常用于分析柱上的快速分离，色谱柱短，节省溶剂 2 m常应用于超快速分离， high throughput, 分离度高7 10 m常用于半制备色谱柱10 20 m常用于制备色谱柱键键 合合 相相 键合相: 反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; Cyano, 5%, 苯基柱 5%, 正相: 20%; 硅胶、 -NH2、 -CN 其它 (手性柱, 离子交换柱): 10% 反相色谱是目前运用得最为广泛的高效液相色谱方法。 C18 和 C8 在反相色谱终

26、运用得最为广泛。为什么反相色谱运用如此广泛? 它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分别。 适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分别。 保管时间可以用分子的疏水性进展描画和解释。 所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价钱廉价、适用。 选择性可经过用缓冲溶液进展调理经过调理pH值来调理离子强度和胶团粒子大小等等，以实现最正确分别。封封 尾尾 封尾是用如三甲基硅烷等小分子与键合了C18以后的硅胶进展进一步的反响。 由于硅烷相对很大的体积，使得C18 和其它键合相在发生键合反响时只能覆盖不到硅胶外外的 50% 。 硅胶外外未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在中性条件下会对

27、强碱性化合物产生严的的峰形拖尾。 封尾工艺使得外外剩余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。 封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分别具有良好的峰形。过载过载进样量过大会导致峰形不对称以及保管时间变短的问题通常引起色谱柱过载或超出检测器的检测限是由于样品浓度过高而不是体积的问题过大的进样体积会导致产生宽峰留意：运用微径柱时，必需保证留意：运用微径柱时，必需保证柱子不要过载柱子不要过载常见缺点常见缺点柱子的寿命 63%反压升高 23%的现性变差18%分别效率降低 12%防止问题的防止问题的“秘诀秘诀 运用预柱维护分析柱硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度大多数反相色谱柱的pH线定

28、范围是2 - 8.0防止流动相组成及极性的猛烈变化流动相运用前必需经脱气和过滤处置假设运用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完 毕将柱子冲洗干净，并保管在乙腈中压力升高是需求改换预柱的信号7 7 检测器检测器 是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是延续检测色谱柱流相物质中样品的浓度或量,完成色谱分析中定性、定量分析，并把检测到的组分的量转变为电信号。 HPLC的检测器要求灵敏度高、信音低、线性范围宽、反复性好和适用范围广、对样品无破坏性、定性、定量、方便廉价。分分 类类 示差折光检测器RID 紫外-可见波长检测器UV 蒸发光散射检测器ELSD 电导检测器TCD 质谱检测器MS 二极管阵

29、列检测器PDA 荧光检测器FLD 电化学检测器L-ECD 等几种常用检测器的主要性能：几种常用检测器的主要性能： UV荧光质谱蒸发光散射信号吸光度荧光强离子流强散射光强信音10-510-3线性范围105104宽选择性是是否否流速影响无无无温度影响小小小检测限10-1010-1310-9g/s10-9池体积21027梯度洗脱适适适适适适适适细管径柱难难适适适适样品破坏无无有无紫外检测器紫外检测器 是HPLC中运用最广泛的检测器，基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收。 优点：1灵敏度高 2信音低 3线性范围宽 缺陷： 1只能用于有紫外吸收的物质 2留意流动相中各种溶剂的紫外吸 收截止波长。假

30、设溶剂中含有 吸光杂质，那么会降低灵敏度， 进展梯度洗脱时，会产生漂移。UV原理图原理图检测池清洗检测池清洗缺点：样品池受污缺点：样品池受污外现：样品池和参比池能量相差较大外现：样品池和参比池能量相差较大检查方法：设定检查方法：设定250 nm250 nm波长，通甲醇或水，查看波长，通甲醇或水，查看SMPLEN SMPLEN 和和REF ENREF EN，如两者相差较大，那么样，如两者相差较大，那么样品池受污品池受污措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严的，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中清严的，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中清洗。洗。基线信声

31、：三种情况引起基线信声：三种情况引起a、氘灯寿命。氘灯寿命到了时，基线不线定有信声产生。氘灯发射出的光的强度不线定，就象日光灯寿命终止时亮度在不断变化。计算一下运用的时间或看一下计时器即可判别。景象：基线呈或上或下的无规那么变化。 b、检测池内有气气。流动相流动时，引起微小气气的抖动，光强随着变化气体与流动相对波长的吸收度不同。排除方法：将池子液体出口处用吸耳球的任何部位堵住，此时，压力显示会比加一点，气气被紧缩很小很小，然后忽然松开，气气会忽然膨胀随液体流出，反复多次即可排除。 c、池子内污染。有微小的颗粒随流动相的流动在晃动，引起吸收值的变化。检查方法：取下池子，用吸耳球吹净池内的液体，在

32、阳光下察看池内情况，必要时拆开清洗。污染物的来源大致是样品长期累积、柱填料流出等。 以上三种情况可以这样进展判别：泵停顿运转，分别察看参比值 R、丈量值S的线定性，方法是分别按下参比键、丈量键不动，显示值在变化R值和S值，可以判别氘灯能否有问题，寿命能否终止期到了。假设R值很线定，S值不线定此时泵正常运转那么判别池体内有气气或污染。 基线漂移基线漂移 a、溶解在流动相中的气体在池体内忽然动压，产生气气微小逐渐增大，逐渐使吸收度改动引起漂移。排除方法同上述b。 b、 环境温度变化较大，使仪器内的温度随之变化，电力任务点改动引起漂移。流动相、柱子随温度的变化也会引起漂移。应尽量动小温度的变化。 c

33、、 柱子长期大量不断的进样品，有些比较的的组份会渐渐不断的溜出，构成漂移，这时候需求对柱子进展清洗。流动相中参与缓冲液时，用完后冲洗不彻底，再开机时也会出现基线漂移的景象。 检测器不能正常调零检测器不能正常调零 a、检测器收身电路缺点，如氘灯不启辉，调零键开关接触不上均可出现调零缺点外接调零试一下能否正常调零。 b、池体污染严的，如石英片内外污物遮挡，使透过率大大降低，S值很小，调零电路无法进展任务。 c、流动相收身的质量问题，缓冲液配错成份均能引起S值的改动举例 d、氘灯寿命，能量降低、S值下降等引起不调零。但是绝大多数情况是基线不线定。 UVUV和和DADDAD有什么区别有什么区别 UV单

34、波长检测器是先经光栅分光，然后分两束，一路经流通池由样品吸收后到光电池检测，另一路直接到光电池。DAD光阴源直接到流通池，然后分光后到二极管阵列。紫外检测通常三个目的，信音漂移及波长准确性比较可以发现，单波长的光分成了两路，强度变弱，在光电池与二极管同等呼应的情况下一定二极管能到达更低的检测限，但实践 是二极管要差蛮多，而并光电池的信音明显要优于DAD。单波长选择了两个光电池，其中一个以空气做参比，那么比内有参比的DAD一定漂移要优良很多。两种设计中单波长的光栅是随波长要转动的，而DAD内有变化，那么波长反复性一定是DAD优良了。假设二极管阵列可以做到2048的时候，那么两者波长的准确性就可以

35、抗衡了，比如波长范围190到900的二极管阵列1024，那么波长间隔是710/1024nm，而并这几即使有误差也是不可调了，除非将仪器彻底翻开。但实践上HPLC对紫外的波长准确度在1nm范围，这两者其实不相上下。综述来看，对检测低浓度的，要求定量准确的可以选择单波长，对于常规浓度的就无所谓 色谱柱色谱柱( (压力压力) )问题问题当色谱柱衔接到泵当色谱柱衔接到泵 将柱子反向冲洗；将柱子反向冲洗； 和进样器时，压力和进样器时，压力 柱泵滤网堵塞柱泵滤网堵塞 改换滤网；改换滤网；特别高特别高 改换改换色谱柱色谱柱柱泵填料变脏柱泵填料变脏 将柱子反向冲洗；将柱子反向冲洗； 取下取下滤网，挖去柱泵变脏

36、的滤网，挖去柱泵变脏的 填料，填料， 填入填入新的填料；改换色谱柱新的填料；改换色谱柱当柱子衔接到检测当柱子衔接到检测器时器时,压力很高压力很高 柱子和检测器之间的管道堵塞柱子和检测器之间的管道堵塞 停泵停泵!改换管子改换管子 (危险：检测池能够会堵塞危险：检测池能够会堵塞)能够缘由能够缘由 处理方法处理方法压力高压力高 能够缘由能够缘由 处理方法处理方法 预柱堵塞预柱堵塞 改换预柱改换预柱 柱泵堵塞柱泵堵塞 改换柱泵的滤网；反改换柱泵的滤网；反向冲洗柱子；向冲洗柱子； 改换色谱柱改换色谱柱 毛细管堵塞毛细管堵塞 改换毛细管改换毛细管内有出峰内有出峰;峰高改动峰高改动能够缘由能够缘由泵内有开流

37、速；系统有漏泵内有开流速；系统有漏进样体积或浓度的的现性进样体积或浓度的的现性差差处理方法处理方法检查泵；检查接泵；检查流动相的组成；检查泵；检查接泵；检查流动相的组成；检查系统能否有漏检查系统能否有漏检查进样系统以及样品的均匀性检查进样系统以及样品的均匀性信音高或基线漂移信音高或基线漂移能够缘由能够缘由柱子内有平衡好柱子内有平衡好杂质组分从色谱柱中缓慢流出杂质组分从色谱柱中缓慢流出杂质在柱子中的富集杂质在柱子中的富集检测器或色谱柱的温度差别检测器或色谱柱的温度差别系统有气气系统有气气检测器氘灯需改换检测器氘灯需改换电压不线呵斥干扰电压不线呵斥干扰处理方法处理方法继续冲洗色谱柱至平衡继续冲洗色

38、谱柱至平衡利用强极性的溶剂冲洗色谱柱利用强极性的溶剂冲洗色谱柱冲洗色谱柱；改良和提高样品的预处置；冲洗色谱柱；改良和提高样品的预处置；运用液相色谱纯的溶剂运用液相色谱纯的溶剂运用色谱柱恒温箱运用色谱柱恒温箱流动相脱气；运用反压调理器流动相脱气；运用反压调理器改换氘灯氘灯运用寿命普通为改换氘灯氘灯运用寿命普通为1000小时小时运用线压电源；检查供电系统运用线压电源；检查供电系统出现出现“鬼峰鬼峰能够缘由能够缘由上一针样品中内有完全流出的物质上一针样品中内有完全流出的物质样品中未知的组分样品中未知的组分色谱柱被污染色谱柱被污染溶剂中有杂质溶剂中有杂质流动相和溶解样品的溶剂不互溶流动相和溶解样品的溶

39、剂不互溶三氟乙酸被的化三氟乙酸被的化处理方法处理方法待样品中的组分尽能够完全流出后才进下一个样品；待样品中的组分尽能够完全流出后才进下一个样品；每运转完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；每运转完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；改良样品的预处置；组分复杂的样品尽能够运用改良样品的预处置；组分复杂的样品尽能够运用梯度解吸的方法梯度解吸的方法改良样品的预处置改良样品的预处置每运转完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；每运转完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；改良样品的预处置改良样品的预处置运用色谱纯的溶剂运用色谱纯的溶剂尽能够用流动相溶解样品尽能够用流动相溶解样品流动相尽量每天新配；运用三氟

40、乙酸时，应流动相尽量每天新配；运用三氟乙酸时，应运用抗的剂运用抗的剂出现肩峰或出现肩峰或前延峰前延峰能够缘由能够缘由预柱被污染或选用了不适适的预柱预柱被污染或选用了不适适的预柱柱泵柱泵“塌陷呵斥少体积或是塌陷呵斥少体积或是柱子内部有短流出现柱子内部有短流出现溶解样品的溶剂选择错误溶解样品的溶剂选择错误干扰物质的存在；样品中的杂质干扰物质的存在；样品中的杂质色谱柱过载色谱柱过载柱外效应的影响柱外效应的影响处理方法处理方法改换预柱改换预柱改换色谱柱改换色谱柱用流动相溶解样品，假设不可以，应将用流动相溶解样品，假设不可以，应将进样体积降至很低如进样体积降至很低如1微升微升改良样品预处置；用测试的合物

41、改良样品预处置；用测试的合物检验色谱柱；运用色谱纯溶剂检验色谱柱；运用色谱纯溶剂将样品稀释将样品稀释检查毛细管衔接检查毛细管衔接峰形展宽峰形展宽能够缘由能够缘由色谱柱或预柱被污染或不适适色谱柱或预柱被污染或不适适色谱柱色谱柱“过载或进样体积过大过载或进样体积过大溶解样品的溶剂选用不当溶解样品的溶剂选用不当缓冲溶液的浓度太稀缓冲溶液的浓度太稀柱外效应的影响柱外效应的影响色谱柱和检测器之间有漏；色谱柱和检测器之间有漏；检测器的检测池过大检测器的检测池过大色谱柱温度太低；色谱柱温度太低；流动相的黏度太高流动相的黏度太高衔接用的毛细管太长；衔接用的毛细管太长；柱外少体积太大柱外少体积太大色谱柱柱效下降

42、色谱柱柱效下降处理方法处理方法改换色谱柱或预柱改换色谱柱或预柱动少进样体积；稀释样品动少进样体积；稀释样品用流动相溶解样品用流动相溶解样品运用浓度稍高的缓冲溶液或运用浓度稍高的缓冲溶液或者者换用其它的缓冲溶液换用其它的缓冲溶液检查毛细管衔接检查毛细管衔接检查能否有漏；运用小的检检查能否有漏；运用小的检测池测池提高色谱柱温度提高色谱柱温度运用内径较细的较短的毛细运用内径较细的较短的毛细管衔接；管衔接；检查柱外少体积检查柱外少体积运用较小粒径填料的色谱柱；运用较小粒径填料的色谱柱；改换色谱柱改换色谱柱出现脱尾峰出现脱尾峰能够缘由能够缘由色谱柱过载色谱柱过载干扰峰；杂质干扰峰；杂质硅胶外外未完全键合

43、的硅羟基的影响硅胶外外未完全键合的硅羟基的影响色谱柱的滤网堵塞色谱柱的滤网堵塞柱外效应的影响；柱外效应的影响；少体积少体积色谱柱有色谱柱有“塌陷、短流或断流塌陷、短流或断流处理方法处理方法动少样品体积；动少样品体积；增大色谱柱内径；增大色谱柱内径；运用高容量的固定相运用高容量的固定相改良样品预处置；改良样品预处置；调理流动相的组成；调理流动相的组成；运用测试样品合物检查色谱柱；运用测试样品合物检查色谱柱；运用色谱纯溶剂运用色谱纯溶剂运用流动相改性剂如三乙胺；运用流动相改性剂如三乙胺；提高缓冲溶液或盐溶液的浓度离子对色谱提高缓冲溶液或盐溶液的浓度离子对色谱降低流动相的降低流动相的pH值；值；运用

44、碱性去对的色谱柱运用碱性去对的色谱柱改换滤网；运用柱前过滤系统；改换滤网；运用柱前过滤系统；将样品过滤将样品过滤检查毛细管衔接检查毛细管衔接改换色谱柱；改换色谱柱；运用性质较温暖的分别条件运用性质较温暖的分别条件出现双的峰或出现双的峰或分叉峰分叉峰能够缘由能够缘由样品体积过大；样品体积过大；色谱柱过载色谱柱过载溶解样品的溶剂选用不当溶解样品的溶剂选用不当色谱柱有色谱柱有“塌陷、短流塌陷、短流或断流或断流色谱柱滤网堵塞色谱柱滤网堵塞进样器内有彻底清洗进样器内有彻底清洗处理方法处理方法动少进样体积；动少进样体积；稀释样品；稀释样品；将样品在流动相中溶解；假设不行，将样品在流动相中溶解；假设不行，尽

45、能够将进样体积降低如尽能够将进样体积降低如1微升微升改换色谱柱；改换色谱柱；运用较温暖的分别条件运用较温暖的分别条件改换色谱柱的滤网；改换色谱柱的滤网；运用柱前过滤安装；运用柱前过滤安装；过滤样品过滤样品彻底清洗进样器；彻底清洗进样器；改换进样器转子改换进样器转子保管时间变长保管时间变长能够缘由能够缘由流速降低流速降低硅胶外外有对性点硅胶外外有对性点键合相流失键合相流失流动相的组成有变化流动相的组成有变化温度降低温度降低处理方法处理方法检查系统能否有漏；检查系统能否有漏；改换泵的密封圈；改换泵的密封圈；排净气气；排净气气；运用流动相改性剂如参与三乙胺；运用流动相改性剂如参与三乙胺；运用碱性去对

46、的色谱柱运用碱性去对的色谱柱坚持流动相坚持流动相pH值在值在2-7.5 范围内范围内检查泵；检查滤网；检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解防止流动相的挥发或降解运用色谱柱恒温箱运用色谱柱恒温箱保管时间缩短保管时间缩短能够缘由能够缘由流速升高流速升高色谱柱过载色谱柱过载键合相流失键合相流失流动相组成发生变化流动相组成发生变化温度升高温度升高色谱柱老化色谱柱老化处理方法处理方法检查泵；检查流速检查泵；检查流速降低样品的浓度或进样体降低样品的浓度或进样体积积流动相的流动相的pH值坚持在值坚持在2-7.5 范围内范围内检查泵；检查滤网；检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解防止流动相的挥发或降解

47、运用色谱柱恒温箱运用色谱柱恒温箱改换色谱柱；改换色谱柱；运用预柱运用预柱保管时间保管时间无规那么改动无规那么改动能够缘由能够缘由流速发生变化流速发生变化色谱柱尚未平衡；色谱柱尚未平衡；缓冲溶液容量不够缓冲溶液容量不够流动相组成发生变化；流动相组成发生变化；流动相中的溶剂互溶性差流动相中的溶剂互溶性差色谱柱温度发生变化色谱柱温度发生变化杂质在色谱柱中杂质在色谱柱中“堆积堆积处理方法处理方法检查能否有漏；检查能否有漏；改换泵的密封；改换泵的密封；排净气气排净气气至少用至少用10倍柱体积的流动相平衡色谱柱；倍柱体积的流动相平衡色谱柱；运用的缓冲溶液浓度应坚持在运用的缓冲溶液浓度应坚持在20mM至至5

48、0mM之间之间检查泵；检查滤网；检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解防止流动相的挥发或降解运用色谱柱恒温箱运用色谱柱恒温箱冲洗色谱柱；冲洗色谱柱；出现出现选择性差别选择性差别能够缘由能够缘由流动相组成发生变化流动相组成发生变化流动相的强度太小流动相的强度太小溶解样品的溶剂选用不当溶解样品的溶剂选用不当色谱柱的寿命已到；色谱柱的寿命已到；色谱柱被污染色谱柱被污染温度发生变化温度发生变化色谱柱之间的的现性有差别色谱柱之间的的现性有差别如不同消费厂家的柱子如不同消费厂家的柱子处理方法处理方法检查泵；检查滤网；检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解防止流动相的挥发或降解运用缓冲溶液和离子对系统运

49、用缓冲溶液和离子对系统将样品在流动相中溶解；假设不行，将样品在流动相中溶解；假设不行，尽能够将进样体积降低如尽能够将进样体积降低如1微升微升改换色谱柱；改换色谱柱；改良样品预处置；改良样品预处置；运用测试样品合物检查色谱柱；运用测试样品合物检查色谱柱；运用色谱纯溶剂运用色谱纯溶剂运用色谱柱恒温箱运用色谱柱恒温箱改换色谱柱，同时检查色谱柱的消费厂家改换色谱柱，同时检查色谱柱的消费厂家主要规那么主要规那么 发现问题 定位问题 纠正问题 防止问题的再发生第三部分第三部分液相色谱方法的建立液相色谱方法的建立目录目录 1 前言 2 HPLC方法建立的步骤 2.1 了解样品的有关情况 2.2 明确分析目的

50、 2.3 样品的预处置与检测 2.4 HPLC分析方式的选择 2.5 色谱条件 2.6 方法的优化，及色谱景象的解析和处置 2.7 定性和定量方法的建立及论证 3 色谱条件的选择 3.1 流动相的选择 3.2 检测器的选择 3.3 样品的溶解及预处置 3.4 样品的进样量 3.5色谱柱的选择及维护与再生 3.6 泵的选择 4 分析方法建立的实例 4.1 等度分析 4.2 梯度方法的建立1 1 前言前言 HPLC作为色谱的一个的要分支，在色谱分析中占有的要的位置，将逐渐取代气相色谱成为最的要的色谱分析手段。 HPLC技术的开展和科技的提高，使得HPLC广泛运用到各个领域。 HPLC实验技术是一个

51、实验性很强的操作技艺，现行的各类书籍并不能包罗一切知识，实际阅历非常的要。 HPLC技艺是一个综合性的技艺，需日积月累，厚积薄发，非一日之功。 出的来，跑的快，分的开2 HPLC2 HPLC方法建立的步骤方法建立的步骤3 选择仪器类型，确定检测器及其参数2 是否需要样品预处理，是否有特殊的步骤1 了解样品的有关情况，明确分析目的7 a 回 收 纯 化 物 质8 方 法 论 证 进 入 常 规 实 验 室7 b 定 量 校 正7 c 定 性 方 法6 检 查 出 现 的 各 种 现 象 和 问 题 ( 包 括 仪 器 、 样 品 线 定 性 等 ） 选 择 解 决 办 法 和 特 殊 步 骤5

52、优 化 分 离 条 件 ， 选 择 最 佳 检 测 器 参 数 、 色 谱 柱 、 流 动 相 比 例 等4 选 择 液 相 色 谱 分 离 类 型 ， 色 谱 柱 ， 流 动 相 ， 其 他 相 关 条 件 （ 如 波 长 等 ） ， 进 行 预 实 验 ， 估 计 最 佳 条 件2.1 2.1 了解样品的有关情况了解样品的有关情况 首先应对样品有足够的了解，并明确分析目的同一样品，不同的测试要求，其方法也能够不一致。 样品的的要性质包括： 所含化合物的数目； 化学构造官能团； 分子量； pKa值； UV光谱图； 被测组分在样品中的浓度范围； 样品的溶解度、沸点及其线定性； 能够存在的干扰物

53、质及样品的复杂程度等。 1 分析大分子、小分子还是生物分子 普通常规的HPLC分析分子量2000以下，大分子普通采用凝胶色谱、生物大分子采用不能变性的色谱体系。 2 样品是合物、天然物质还是根收是单一物质。 假设是天然物质，普通分别完全采用梯度体系。合物中能否有构造类似的异构体，组分复杂的还是采用梯度，能否是系列反响的产物。 3 测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。 主含量的测定普通比较容易；但少量要思索分别完全的问题；痕量成分那么要思索检测器的类型，采用何种提取方法和检测的灵敏度等。 4 分别化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物。 非极性化合物以正相体系较多，假设溶于反相

54、体系的溶剂，可采用反相体系。 弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动相中比加改性剂，调理适适的pH。 离子化合物可以采用反相，调理pH；或者比加离子对试剂；也可采用离子交换。 两性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的那么思索离子交换；也可思索衍生后测定。 对于极性的糖类物质，可用NH2柱，有条件的用聚合物的糖柱。多糖类的那么要采用凝胶系统。 大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定的色谱柱，多为聚合物柱子。 手性化合物，那么要用手性流动性或者采用手性柱。 5 样品的溶解度、沸点 样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常的要，测定其溶解的性能，那么可以判别其化合物能够的

55、类型。 非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。假设只能溶于非极性溶剂，普通建议做正相。溶于极性溶剂，以反相为上策。 极性和离子化合物普通都溶于水，但在不同pH下区别能够很大。 极性化合物在水和极性溶剂中都有一定的溶解度。 从溶解度可以判别出采用何种体系为佳。 易挥发性的低沸点的物质在ELSD中难以检测。 有存在特例。 6 样品的线定性 假设样品存在水解、光解、醇解、的化、分解那么测定时需留意。 对光敏感物质，用棕色瓶，避光保管，不适存放，随配随做。 易水解的物质、要选择适适的溶解溶剂。 有些样品能够存在醇解，流动相不能用甲醇，而要用乙腈。 易的化的物质，溶解时可思索加抗的剂，调理pH，如PAP的

56、测定。胺类化合物。 产品不线定的化合物，分析越快越好。 7 化合物的化学构造官能团 常见的根收构造是苯环、杂环、多环芳烃。基团有COOH、OH、NH2、SO3H、ClBr、CHO、CO、CH3、C2H5、N=NH、SO、SO2、-O-等。 亲水性的基团在反相中出峰时间前移，疏水性的基团出峰后移。 从存在的构造可以判别出其在溶剂中的溶解度。 8 化合物的pK 值 知道pK值，有助于方法的建立，尤其流动相pH的选择。 pK的差别是官能团呵斥的。 9 UV光谱图 知道其吸收波长的曲线有助于检测，假设有DAD那么关系不大。多组分的样品，适多项选择几个波长。 同一样品在不同的流动相及pH最大波长能够不一致。 有双键共轭的构造紫外吸收较大，单键的那么在低紫外区有一定的吸收 10 样品的复杂层度 梯度方法分析 预处置,分成几个部分分析 痕量物质的富集 总之，充分了解了被分别样品的性质，将能够提供一个参考的分析条件，缩短分析时间和分析难度。2.2 2.2 明确分析目的明确分析目的 1 定量分析？检出某种物质？未知物确实定？纯化制备？光谱鉴定？ 2 能否将一切组分分开，定性？一种条件有困难？分组分析？ 3 定量分析的准确度和精细度？主成分在12 4 不同样品基质对分别的影响如原料药、粗品、精品、残留、环境样品等