(完整版)分子生物学与基因工程

1、绪论 分子生物学 广义： 研究蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能， 也就是从分子水平阐明生 命现象和生物学规律。狭义： 研究生物体主要遗传物质基因或DNA的结构及其复制、 转录、 表达和调节控制等过程的科学。基因工程：是指将一种或多种生物体的基因或基因组提取出来 , 或者人工合成的基因 , 按照 人们的愿望 , 进行严密的设计 , 经过体外加工重组 , 通过一定的方法 , 转移到另一种生物 体的细胞内 , 使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。里程碑事件： 1944 年， Avery 在肺炎双球菌转化实验中证实了 DNA是遗传的物质基础， 标志 着分子生物学的诞生。1953年， Wat

2、son和Crick 提出 DNA双螺旋模型，为分子生物学的发展奠定了坚实的基础。 1961 年，法国科学家 Jacob 和 Monod提出了乳糖操纵子模型。1972年， Berg 构建了世界上第一个重组 DNA分子，开辟了生物学新领域遗传工程。 1983 年， Mullis 发明了聚合酶链式反应（ PCR）技术，极大地推动了分子生物学的发展。90 年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组 时代”。目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代” 。第二讲核酸的化学成分： 核酸是一种高分子的化合物， 它的构成单元是核苷酸， 核苷酸分子由三个部分组成：碱

3、基：嘧啶、嘌呤 五碳糖：核糖或脱氧核糖是核苷酸的多聚体。核苷核苷酸脱氧核糖核酸（ DNA）和核糖核酸（ RNA）（1）DNA含的糖分子是脱氧核糖， RNA含的是核糖；（2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（ A）、胞嘧啶（ C）、鸟嘌呤（ G）和胸腺嘧啶（ T）， RNA含有 的碱基前 3 个与 DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替；（3）DNA通常是双链，而 RNA主要为单链；（4）DNA的分子链一般较长，而 RNA分子链较短。核酸的分布： 真核生物的绝大部分 DNA存在于细胞核内的染色体上， 它是构成染色体的主要 成分之一，还有少量的 DNA 存在于细胞质中的叶绿体、线粒体等细

4、胞器内。RNA 在细胞核和细胞质中都有，核内则更多地集中在核仁上，少量在染色体上。细菌也含有DNA 和 RNA；多数噬菌体只有 DNA ；多数植物病毒只有 RNA；动物病毒有些含有 RNA，有些含有 DNA 。 间接证据：（ 1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的 DNA含量则刚好是体细胞的一半。 多倍体生物细胞的 DNA含量是按其 染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。（2）DNA在代谢上较稳定。（3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，

5、但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体 有其自己的 DNA。（5）在各类生物中能引起 DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。 直接证据： 肺炎链球菌试验；噬菌体侵染实验；烟草花叶病毒侵染烟草实验（RNA）DNA结构： 多核苷酸链片段（一级） ；双螺旋结构（二级）（1）两条多核苷酸链以右手螺旋的形式彼此以一定的空间距离，平行地环绕于同一轴上；5' 3'方向，而另一条为2）两条多核苷酸链走向为反向平行，即一条链磷酸二酯键为 3'一 5'方向，二者刚好相反； （3）每条长链的内侧是扁平的盘状碱基，碱基一方面与脱氧核糖相联系，另一方面通过氢 键与它互补的碱基相联

6、系。 互补碱基对 A与T之间形成两对氢键， 而 C与 G之间形成三对氢 键。上下碱基对之间的距离为 0.34nm；（ 4）每个螺旋为 3.4nm 长，刚好含有 10 个碱基对，其直径约为 2nm；（5）在双螺旋分子的表面大沟和小沟交替出现。维持双螺旋结构稳定性的力： （ 1）氢键（ 2）疏水作用碱基堆集力（ 3）范德华力（ 4） 磷酸基的负电荷静电斥力（ 5）碱基分子内能Tm：是指吸收值增加的中点。 影响因素： 1）DNA序列中 G + C 的含量或比例，含量越高， Tm值也越大（决定性因素） ； 2 ）溶液的离子强度； 3 ）核酸分子的长度有关：核酸分子越 长， Tm值越大； 4 ）某些化学

7、物质； 5）溶液 pH值Z-DNA是左手螺旋，每个螺旋含 12 个碱基对，比 A-DNA拧得更紧 ; 双螺旋中不存在深沟，只 有浅沟DNA的精细结构（1）依赖于序列的 B-DNA 构象变化：双螺旋的许多结构参数是随碱基序列的不同而在一定 范围内变化的， 这称为 DNA的局部构象。 在 DNA中，随碱基序列的不同而变化的参数有许多， 其中重要的有 螺旋扭转角、螺旋桨扭角、 碱基对转动角 等，此外碱基对间还会发生滑动。以 上这些变化使 DNA形成了精细结构。 而精细结构正是 DNA发挥功能时， 相应蛋白质因子与靶 位点作专一性识别和结合的标志。（2）连续 AT 序列的构象；（3）含错配碱基对的 B

8、-DNA；（4）DNA的局部构象与 DNA结合蛋白：各种酶（如 DNA聚合酶、 RNA聚合酶等）；调节蛋白 （如 CAP，Cro 阻遏物等）；这些蛋白质与 DNA的结合涉及到生物学中的一些基本问题， 如遗 传和个体发育等，因此，核酸 - 蛋白质交互作用已成为分子生物学中的一个研究热点。 DNA的超螺旋结构（此处含有一道大题，详见平时的作业本） DNA结构的变化可以用数学式来表述：L = T WL 称为 DNA的连接数； T 称为盘绕数； W为超盘绕数。天然的 DNA都呈负超螺旋， 但在体外可得正超螺旋环形 DNA分子会由超螺旋化而变得更为致密， 它们在 超离心 中的沉降速度和在 凝胶电泳 中的

9、 迁移速度都增加，故超螺旋 DNA可通过这两种方法来检测和分离。拓扑异构酶 含义：指细胞内存在着一类能催化DNA拓扑异构体相互转化的酶DNA中的不寻常结构： 交替的嘧啶、嘌呤重复序列倾向形成Z-DNA；反向重复序列倾向形成十字形结构；构成 镜像重复 的同型嘧啶 -同型嘌呤序列可能形成 三链结构（ T-A-T; C-G-C ）； 富含 G 的序列可能形成 四链结构（端粒酶） G-GG-Gk对 DNA具有特征性，它与 DNA的碱基对数目成反相关，因此，Cot 曲线提供了一种测定DNA分子量的方法。 Cot 曲线也揭示单一来源的 DNA所具有的不同复杂性部分。 Southern 杂交鉴别 DNA第三

10、讲 染色体的结构特征 : 染色体是由染色质构成的， 染色质是由 DNA、RNA和蛋白质形成的复合体。 组蛋白在进化中是保守的；组蛋白在翻译后是受到修饰的，其中包括特异精、组、赖、丝和 苏氨酸残基的甲基化、乙酰基化和磷酸化。染色质基本单位核小体。核小体由约 200 bp 的 DNA和 H2A，H2BH3 及 H4 各 2 分子所组成。 念珠状。C值的含义： 在真核生物中，每种生物的单倍体基因组的DNA总量是恒定的，称之为 C 值，它是每种生物的一个特性，不同物种的 C 值差别很大。C 值悖理： 一般认为，一个生物的形态学复杂性应该与其C 值的大小大致相关，但是， C 值和进化之间的复杂性并没有严

11、格的相应关系。DNA的形状与大小： DNA一般为长而无分支的双股线性分子，但有些为环型，也有少数为单 股环型。不同的 DNA大小相差悬殊。虽然一般而言，复杂的有机体需要更多的DNA，但不存在严格的对应关系。DNA的序列组织： 真核生物 DNA碱基组成上的异质性主要由于存在着以下3类 DNA序列： 高度重复序列 （卫星 DNA；微卫星 DNA：Alu 家族）；中度重复序列 （中度重复序列包括 rRNA 和组蛋白基因， 每一基因组约含 1000 拷贝）；单一序列 （包括酶在内的各种蛋白质基因） 。 简述真核生物基因组特点（ 此处含有一个问答大题，详见平时的作业本 ）第四讲丙氨酸AlaA精氨酸Arg

12、R天冬酰氨AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GlnQ谷氨酸GluE甘氨酸GlyG组氨酸HisH异亮氨酸IleI亮氨酸LeuL赖氨酸LysK甲硫氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸ProP丝氨酸SerS苏氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY缬氨酸ValV蛋白质概述： 蛋白质是由 20 种左右的 -氨基酸通过肽键相互连接而成的一类具有特定的空 间构象和生物学功能的高分子有机化合物。螺旋和双螺旋的异同点（ 此处含有一个简答题，详见平时作业 ） 蛋白质功能与结构的关系： 蛋白质一级结构是空间结构的基础； 一级结构相似的蛋白质， 其 基本构象及功能也相似； 在蛋白质的一级结构中， 参与功

13、能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基， 即使在整个分子中发生一个残基的异常， 那么该蛋白质的功能也会受到明 显的影响“分子病”的镰刀状红细胞性贫血仅仅是 574 个氨基酸残基中，一个氨基酸 残基即亚基 N 端的第 6 号氨基酸残基发生了变异所造成的，这种变异来源于基因上遗传 信息的突变；蛋白质的空间构象是其功能活性的基础。（ 此处含有一个简答题，详见平时作业） 蛋白质的别构效应： 在生物体内， 当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合， 触发该 蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化。第五、六讲DNA 、RNA 合成：（ 分析题 ）SSBP ：单链结合蛋白 半保留复制：

14、DNA 在复制时首先两条链之间的氢键断裂使两条链分开，然后以每一条链分 别做模板各自合成一条新的 DNA 链，这样新合成的子代 DNA 分子中一条链来自亲代 DNA ， 另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。（ 名词解释 ）半不连续复制： DNA 复制时，两条链分别作模板，有一条链是连续合成的，这条链称为前 导链；而另一条链合成时， 只能以 5 ' 3 '先合成冈崎片段，然后利用 DNA 连接酶将各 个片段连接起来形成随从链。 （名词解释 ） 不对称转录： RNA 的转录合成是以 DNA 的一条链为模板而进行的， 这种转录方式又叫做不 对称转录（ 名词解释 ） 解释复制

15、方向 5 3： RNA 聚合酶在 DNA 复制起始处做为引物，它们的 3 OH 末 端提供了由 DNA 聚合酶催化形成 DNA 分子第一个磷酸二酯键的位置。 DNA 聚合酶催化 dNTP 加到引物的 3OH 末端，因而 DNA 合成的方向是 5 3 （简答题 ） DNA 复制过程中的酶： 拓扑异构酶 I DNA 解链酶 引物酶 DNA 聚合酶 I DNA 聚合 酶 III / DNA 连接酶 拓扑异构酶 II （ 填空题 ）DNA 复制时，先由拓扑异构酶作用于 DNA 双螺旋分子，使之松弛，然后由 DNA 解链 酶作用，解开双链，此时在引发酶的作用下合成一段 RNA 作为引物，在 DNA po

16、l III 的聚合 作用下连续地合成前导链； 随从链的合成依靠多种酶与蛋白质因子的参与： 首先在引发酶的 作用下合成 RNA 引物，然后在 DNA pol III 的聚合作用下合成 DNA 片段，它们共同形成冈 崎片段。 RNA引物是靠 DNA 聚合酶 I进行切割的，并由 DNA聚合酶 I填补RNA 引物切除 后留下的空隙，最后由 DNA 连接酶形成一条完整的链。DNA 复制的准确性很高， 在原核生物中主要依靠 DNA 聚合酶 I 的外切活性来校正复制 过程中的碱基错配，而真核生物则依靠 DNA 聚合酶来完成。在真核生物中， DNA 复制一般有多个起始点，主要依靠 DNA 聚合酶 和 来完成，

17、 另外还需要 PCNA 等多种蛋白质因子参与。DDRP ：转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做 依赖 DNA 的 RNA 聚合 酶。DDRP ： 依赖 DNA 的 DNA 聚合酶 。第七讲 参与蛋白质生物合成的物质基础： （ 1）合成原料。自然界由 mRNA 编码的氨基酸共有 20 种，只有这些氨基酸能够作为蛋白质生物合成的直接原料。（2 ）mRNA 是合成蛋白质的直接模板。 mRNA 以它分子中的核苷酸排列顺序携带从 DNA 传递来的遗传信息， 作为蛋白 质生物合成的直接模板，决定蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。（3） tRNA 是氨基酸的运载工具。 tRNA 是一类小分子 RNA

18、，长度为 73-94 个核苷酸， tRNA 分子中富含 稀有碱基 和修饰碱基 ，tRNA 分子 3'端均为 CCA 序列，氨基酸分子通过共价键与 A 结合，此处的结构也叫 氨基酸臂 。 tRNA 分子中还有一个 反密码环 （4）核糖体蛋白质的合成场所（5）蛋白质生物合成的必需因子。起始因子（IF）。延长因子（ EF ）。释放因子（ RF ）。1968 霍利 柯拉那 尼伦伯格 遗传密码的特点： （1）起始码（ 2）终止码 （ 3）密码无标点符号 （ 4）密码的兼并性。 一 种氨基酸有几组密码子， 或者几组密码子代表一种氨基酸的现象称为密码子的兼并性， 这种 简并性主要是由于密码子的第三个

19、碱基发生摆动现象形成的， 也就是说密码子的专一性主要 由前两个碱基决定， 即使第三个碱基发生突变也能翻译出正确的氨基酸， 这对于保证物种的 稳定性有一定意义。如： GCU ， GCC ， GCA ，GCG 都代表丙氨酸。 （ 5）密码的通用性 核糖体作为合成场所的原因： （ 解释，分析，简答 ） 任何生物的核糖体都是由大、小两个亚基组成。 （ 1）mRNA 结合位点：由几种蛋白质构成 一个结构域，负责与 mRNA 的结合。（2） P 位点：又叫做肽酰基 tRNA 位或给位。它是结 合起始 tRNA 并向 A 位给出氨基酸的位置。 （ 3）A 位点：叫做氨基酰 tRNA 位或受位。是 结合一个新

20、进入的氨基酰 tRNA 的位置。（ 4）转肽酶活性部位： 位于 P 位和 A 位的连接处。 （5）结合参与蛋白质合成的起始因子（ IF）、延长因子 （EF）和终止因子或释放因子 （RF） 。 蛋白质生物合成的基本过程： （ 含一道大题，详见平时作业本 ） 蛋白质翻译后加工修饰： （ 1）氨基端和羧基端的修饰。 氨基端乙酰化；甲酰基经酶水解而 除去， 蛋氨酸残基由氨肽酶催化而水解除去， 包括除去信号肽序列，因此， 成熟的蛋白质分 子 N- 端没有甲酰基，或没有蛋氨酸。 （2）共价修饰。 羟基化，糖基化，磷酸化，二硫键的 形成 （3）亚基的聚合。 有许多蛋白质是由二个以上亚基构成的，这就需这些多肽

21、链通过非 共价键聚合成多聚体才能表现生物活性 （成人血红蛋白由两条链， 两条链及四分子血红 素所组成）。（ 4）水解断链。 一般真核细胞中一个基因对应一个 mRNA ，一个 mRNA 对应 一条多肽链， 但也有少数的情况， 即一种翻译后的多肽链经水解后产生几种不同的蛋白质或 多肽（哺乳动物的鸦片样促黑皮激素） 。第八讲 基因表达指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。 简述大肠杆菌乳糖操纵子的结构、各部分的功能及基因表达调控机理（ 此处含有一道大题， 详见平时作业本 ） 基因表达组成性表达： 指不大受环境变动而变化的一类基因表达。 其中某些基因表达产物是 细胞或生物体整个

22、生命过程中都持续需要而必不可少的， 这类基因可称为看家基因， 这些基 因中不少是在生物个体其它组织细胞、 甚至在同一物种的细胞中都是持续表达的， 可以看成 是细胞基本的基因表达。 组成性基因表达也不是一成不变的， 其表达强弱也是受一定机制调 控的。基因表达适应性表达： 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。 应环境条件变 化基因表达水平增高的现象称为诱导， 这类基因被称为可诱导的基因； 相反， 随环境条件变 化而基因表达水平降低的现象称为阻遏，相应的基因被称为可阻遏的基因。BAC ： 细菌人工染色体载体 （ 名词解释 ）YAC ：是酵母人工染色体，是目前能容纳最大外源 DNA 片段的

23、载体 （名词解释 ） MAC ： 乳类人工染色体载体 （名词解释 ）结构基因群： 操纵元中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因（SG ），各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。启动子： 指能被 RNA 聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA 序列。（ 填空题 ） 操纵子： 指能被调控蛋白特异性结合的一段 DNA 序列。终止子： 指给予 RNA 聚合酶转录终止信号的 DNA 序列。增强子： 一种能够提高转录效率的顺式调控元件。 调控基因： 它是指编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。与操纵子结合后能减弱或阻止其调控基因转录的 调控蛋白 称为 阻遏蛋白 ，其介导的调控 方式称为 负

24、性调控 。与操纵子结合后能增强或起动调控基因转录的调控蛋白称为 激活蛋白 ， 所介导的调控方式称为 正性调控 。调控基因可以在结构基因群附近、 也可以远离结构基因， 它是通过其基因产物调控 蛋白来发挥作用的，因而调控基因不仅能对同一条 DNA 链上的结构基因起表达调控作用， 而且能对不在一条 DNA 链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为 反式作用 ，调控基因 就属于 反式作用元件 ，其编码产生的调控蛋白称为 反式调控因子。启动子、 操纵子位于紧邻结构基因群的上游， 终止子在结构基因群之后， 它们都在结构 基因的附近，只能对同一条 DNA 链上的基因表达起调控作用，这种作用在遗传学实验上称

25、为顺式作用 ，启动子、操纵子和终止子就属于 顺式作用元件。操纵元的基本组成： 1）结构基因群； 2 ）启动子； 3）操纵子； 4 ）调控基因； 5）终止子 基因表达的组织特异性；阶段特异性。 一个受精卵含有发育成一个成熟个体的全部遗传信 息，在个体发育分化的各个阶段， 显示出 基因表达调控在空间和时间上极高的有序性 ，从而 逐步生成形态与功能各不相同、极为协调、巧妙有序的组织脏器。第九讲基因工程工具酶的概念：在 DNA 分子水平的操作中，依赖于一些重要的酶，如限制性核酸内切酶、连接酶等，作为工具对 DNA 进行切割和拼接，这些酶统称为基因工程工具酶。 工具酶分类： 1 ）核酸水解酶类（核酸内切

26、酶、核酸外切酶） ；2 ）核酸合成酶类（ DNA 聚合 酶、 RNA 聚合酶、 DNA 连接酶）；3）核酸修饰酶类（甲基化酶、核苷酸激酶、核苷酸转移 酶、磷酸酶）限制性内切酶 定义： 指能识别双链 DNA 分子内部特异位点并在识别位点或附近水解磷酸 二酯键的一类内切核酸酶，简称为限制酶。分类：即I型、 II型、 III 型酶三类。特性： 分子质量为 60kd ，单链多肽，最适 pH 为 6 8。 NaCl 有抑制作用，能被 Mg2+ 激活，巯基有保护作用。对热不稳定，通常贮存于20 环境。为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有 50 甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。1）

27、每一种酶都有各自特异识别位点；2）大多数限制酶是错位切割双链 DNA ，产生 5 '或 3 '粘性末端； 3 ）部分限制酶沿识别序列内的对称轴上切割DNA 双链，产生平末端根据限制性内切核酸酶来源和菌株进行命名：1 、用来源细菌的英文缩写斜体符号命名 2 、它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1 个字母 3 、第二、三字母小写，来源细菌种名的头 2 个字母 4 、第四个字母代表菌株5 、最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。回文结构： 限制性核酸内切酶识别序列具有180°旋转对称的回文结构。5' -GAATTC-3 '3'-CTTAAG

28、-5影响因素： 温度：一般 37 盐离子浓度： Na， Mg2 缓冲体系：具有稳定 pH 环境的 Tris-HCl 缓冲体系， DTT 用于保持酶稳定性和活性 反应体积和甘油 浓度：商品化的限制性内切核酸酶均加 50 甘油作为保护剂，一般在 -20 保存。 反 应时间：通常为 1h ；进行大量 DNA 酶切反应时一般让酶解过夜 DNA 纯度和结构： 一个酶单位定义： 1h 内完全酶解 1 g噬菌体 DNA 所需的酶量 同尾酶： 某些限制酶来源不同、识别序列不同，但可产生相同的粘性末端。（ 名词解释 ）同位酶： 识别相同的序列但切割位点不一样的限制性核酸内切酶。 （ 名词解释 ） 同功异源酶（同

29、裂酶） ： 来源不同但能识别和切割同一位点的限制酶。 （ 名词解释 ） 酶的活性单位 1 个活性单位：在适当的反应条件下 （包括温度、 pH 和离子强度等 ）,1h 内在50 l容积中完全酶解 1g特定DNA 底物（通常用入 DNA）所需要的酶量。 （名词解释） DNA 连接酶作用机理： 连接酶的作用：在双链 DNA 中， DNA 连接酶能催化具有邻近 3' 羟基和 5'磷酸基的单链形成磷酸二酯键， 促使具有互补粘性末端或平末端的载体和供 体 DNA 片段连接，使之成为一个完整的重组 DNA 分子。 连接的部位：磷酸二酯键， 不是氢键。 结果：黏性末端（包括平末端）连接起来。作

30、用过程 1）连接酶与辅助因子 ATP 或 NAD 形成酶 -AMP 复合物； 2 ）AMP 作用于 DNA 缺口的 5'-末端磷酸基团； 3）缺口 3' -OH 对活跃的磷原子作亲核攻击，形成新的磷酸 二酯键，封闭切口Taq DNA 聚合酶： 从栖热水生菌中分离纯化的依赖 DNA 的 DNA 聚合酶，最适温度 75 -80 ；最适 pH7.8（Tris-HCl） ；需要 Mg2+（10 mmol L），在低浓度 Mn2+（2 mmol/L） 中有低 活性， Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至 0.1 moIL 对活性无影响，而最适浓度 NaCl 为 40 mmol/L ， K

31、Cl 为 60 mmol/L 。第十讲概念： 携带目的基因进入宿主细胞进行复制、 扩增和表达的工具称载体。即用于克隆、 运载 和转移目的基因并能自我复制的 DNA 分子。必备条件： 具复制原点： 在宿主细胞中不仅能独立地自我复制， 而且能与携带的外源 DNA 一起复制 能与目的基因连接 - 具多个限制酶切点便于筛选鉴定 - 具有标记基因，而宿主细胞并不具有 操作简单分子量小、高拷贝数、转化效率高、容易从宿 主细胞中分离纯化克隆载体： 可以克隆和运载目的基因并转移到宿主细胞中进行复制和扩增。 细菌质粒载体 、 噬菌体载体 、 柯斯质粒载体 。概念： 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、

32、能自我复制、 易分离和导入的环状双链 DNA 分子 10kb 。 分类： F 质粒（ F 因子或性质粒）R 质粒（抗药性因子）Col 质粒（大肠杆菌素因子）pBR322 是以 4 个不同质粒 DNA 为基础通过 DNA 重组技术发展构建而成的克隆载体。 pBR322 载体的特点：分子量小（ 4.3kb ）、拷贝数高、含四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗 性基因作为选择标记、对多种常见的限制性内切核酸酶仅有一个切割位点。pUC 载体 系统以 pBR322 为基础，去除了包括四环素抗性基因在内40的 DNA ，换用了M13 噬菌体的 476bp 片段，内含 LacZ 基因的 5' -序列以表达

33、半乳糖苷酶的片段， LacZ 的上游包括乳糖操纵子上的启动子 Plac 和操纵基因 O命名规则： pUC19“ p ”表示质粒（ plasmid ）“UC ”表示发现或构建该质粒的作者或实验室名称 “19”表示该质粒的实验编号蓝白斑： 如果在多克隆位点中插入外源 DNA ，打断了 -半乳糖苷酶的部分基因，不再产生 - 肽链，就不能和宿主细胞产生的多肽片段结合生成有活性的-半乳糖苷酶，结果 X-gal保持无色，插入外源 DNA 菌落呈白色。 检测结果 ：重组子菌落是白（无）色的，而空载体 转化的菌落是蓝色的。噬菌体即细菌病毒一类的总称。 25kb柯斯质粒载体 又叫粘粒载体， 这是一种由人工构建的

34、含有噬菌体 DNA 的 cos 位点和质粒 复制子的特殊类型的杂和质粒载体 ,具有质粒和噬菌体的双重特征，被称为cosmid ，指带有粘性末端位点的质粒 40kb 。 构建基因文库 表达载体： 克隆、运载和转移目的基因到受体细胞中进行复制和扩增,使之表达。表达载体的特点： 具有克隆载体所具有的基本特性； 具有可被宿主细胞识别的基因表达调控 元件：启动子、核糖体结合位点（ RBS ）（RBS 由 SD 序列、核糖体小亚基识别序列和起始 密码（ ATG ）组成，但有时也将 SD 序列称为核糖体结合位点。 SD ：Shine-Dalgarno ，人 名）、终止子（依赖因子的转录终止；不依赖因子的转录

35、终止）第十一、第十二讲PCR （聚合酶链式反应）定义： 在试管中，利用 DNA 聚合酶、一对引物和四种 dNTP ，对 模板 DNA 反复多次地进行复制，从而得到大量扩增特定产物的反应过程。PCR 体系： 待扩增的 DNA （模板），一对寡聚核苷酸引物，耐高温的 Taq DNA 聚合酶， 4 种脱氧核苷酸的混合物（ dNTP ）， Mg 2+ /Thris-HClPCR 反应程序： 变性 94 退火 55 延伸 72预变性 4min变性退火 3060 秒延伸再延伸 7min反转录 PCR（ RT-PCR ）: 反转录 PCR即以mRNA 作为模板，进行反转录合成 cDNA （单 链 DNA ）

36、的 PCR 方法 . 。 一般分两步进行：第一步用反转录酶将 RNA 反转录成 cDNA ， 第二步以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。目前已发现一种 rTth 酶 ，既有反转录酶活性又有 DNA 聚合酶活性。因此做 RT-PCR 可简 单到用一种酶和一种缓冲体系在一个反应管内直接扩增 RNA 。生物芯片： 是将细胞、蛋白质、 DNA 及其他生物组分，通过微加工技术和微电子技术集中 点在一个平方厘米大小的固体芯片表面， 以实现对它们的准确、快速、 高效、 敏感的大信息 量的检测、分析和处理。 特点： 高通量、微型化、自动化 生物芯片主要分为 基因芯片 和 蛋白芯片DNA 测序技术： ddN

37、TP ，双脱氧核苷酸终止法： 原理：利用 DNA 聚合酶合成 DNA ，在 DNA 的聚合过程中在特异性的核苷酸位置终止反应而进行测序。反应的终止依赖于底物 2' ,3' -双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP ）。在 DNA 聚合酶作用下 能通过其 5 '三磷酸基团掺入到正在增长的 DNA 链中，形成磷酸二酯键，但由于缺乏3 '羟基而不能同后续的 dNTP 或 ddNTP 形成磷酸二酯键， 因此， 一旦 ddNTP 掺入 DNA 的新 生链中，聚合反应就会终止。化学修饰法： 用 4 组化学试剂裂解末端标记的 DNA 分子，其中每一组化学试剂特异地针对 一种或一类碱基进行切割，由此产生的 4 组裂解产物均为不同长度的 DNA 片段的混合物。 每一组反应产物中都有一套带相同标记末端的长短不一的 DNA 片段原理： 1 ）放射性同位素标记待测 DNA3 末端或 5末端 ;2 ）用特殊的化学试剂处理来裂解具末端放射标记的DNA 分子 ,造成碱基的特异性切割，由此产