武汉大学基因工程李立家

1、基因工程学：分离基因以及工程基因过程、方法和相应的原理的一门学科。基因工程就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割，再和载体拼接重组。然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新形状，并使之稳定地遗传给下代。现代基因工程学是和基因组学，蛋白质组学和计算机相结合的产物。基因工程主要包括克隆和表达，其基本过程如下：（1）外源DNA制备及限制性核酸内切酶切割；（2）载体DNA制备及相应的限制性核酸内切酶切割；（3）用DNA连接酶连接外源DNA和载体DNA；（4）通过转化或转染方法将上述

2、重组DNA转入受体细 胞中；（5）筛选和鉴定转化细胞；（6）表达目的基因和应用。基因工程三大要素：载体，工具酶，受体（细胞）-细菌、植物和动物加上DNA转移手段基因工程载体：用于承载、克隆、转移目的基因(也叫外源基因，DNA片段)，能自我复制的DNA分子。常用基因工程载体有：细菌质粒；噬菌体；柯斯质粒；穿梭质粒；细菌人工染色体；酵母人工染色体；Ti质粒及其衍生载体载体的要求：A、复制：具有能在受体细胞中复制的复制起点；B、选择性标记：一般情况下，所要扩增的基因不便于选择，所以作为载体要求具有选择标记；C、限制性酶切位点：对于某一种限制性酶，它的切点数要求是单一的。现在已发展了许多具有多种单一的

3、限制性酶识别位点的载体；D、载体的大小：原则上要求载体越小越好；E、外源基因的性状表达：结构基因的表达需要启动子；F、载体的安全性：要求载体不能随便转移。质粒的改造：A、删除不必要的DNA区域。尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。B、减少限制性酶切点。缺失突变，限制性酶、核酸外切酶核连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。C、加入易于识别的选择性标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。D、关于质粒安全性能的改造。灭活质粒在细菌之间转移的mob基因。常用的生化遗传标记基因：1.-半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ：-半

4、乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。 -半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观； b. lacZ编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性；c. lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大。2.葡萄糖苷酸酶基因（GUS）：该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸及其

5、衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。3.荧光素酶基因：荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。4.发光蛋白质基因(GFP)：发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落发绿色荧光。质粒载体的分类及用途：A、克隆载体。用于克隆和扩增外源基因，它们或者含有能为氯霉素扩增的松弛型复制子结构，如pBR系列；

6、或者复制子经过人工诱变，解除对质粒拷贝数的负调控作用，使质粒在每个细胞中可达数千个复制拷贝。B、测序载体。这类载体通常高拷贝复制，并含有Polylinker,便于各种DNA片段的克隆与扩增。在Polylinker的两端含有两个不同的引物序列（T3/T5），使得重组质粒经碱变性后即可进行DNA测序反应，如pUC18/pUC19系列。另一种测序质粒是M13噬菌体DNA与质粒DNA的杂合分子，如M13mp系列，它们在受体细胞中复制后，可以特定的单链DNA形式分泌到细胞外，克隆在这种质粒上的外源基因无需变性即可直接用于测序反应。C、穿梭载体。这种载体分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择

7、性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞种复制并检测，如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。D、探针载体。这类载体被用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子等。它通常装有一个可以定量检测其表达程度的报告基因（如抗生素的抗性基因），但缺少相应的启动子或终止子，因此载体分子本身不能表达报告基因，只有当含有启动子或终止子的外源DNA片段插入到载体合适的位点上，报告基因才能表达，而且其表达量的大小直接反映了被克隆的基因表达调控元件的强弱。E、表达载体。这类载体在Polylinker的上游和下游分别装有转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点（SD-序列）以及强有力的终止子

8、结构，使得克隆的外源基因均能在受体细胞中高效表达，如pSPORT系列和pSP系列。 噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。噬菌体的改造和构建:(1)缩短长度；(2)删除重复的酶切位点增加一些单一的酶切位点； (3)加装选择标记；(4)构建琥珀密码子的突变体，琥珀型突变（amber mutation)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变,抑制基因（sup）可以抑制这种突变。-DNA作为载体的优点:1.-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌。2.-DNA

9、载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量。3.重组-DNA分子的筛选较为方便。M13噬菌体载体作为克隆载体的优越性在于能象质粒那样转化进入受体细胞，也可以使用类似于质粒分离纯化方法制备M13 DNA分子，同时又可以采用类似于噬菌体分离纯化方法制备单链M13 DNA，单链DNA在序列测定及定位诱变等中极为有用。柯斯质粒（Cosmids):它是由噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。柯斯质粒的优点：1.具有噬菌体的特性(体外包装，高效感染进入受体细胞)；2.具有质粒载体的特性(易于克隆操作、也能转化进入受体细胞、选择及高拷贝等)；3.具有较高容量（4

10、5 kb）的克隆能力；4.排斥非重组子；5.不能体内包装，不裂解受体细胞，不形成噬菌体颗粒，因而不形成噬菌斑。噬菌粒载体(phagemids):由丝状噬菌体DNA和质粒组成的杂合分子。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。优点：A、具有质粒性质，便于外源DNA的克隆及重组子的筛选；B、提高装载量；C、较稳定。人工染色体载体酵母人工染色体YAC(Yeast artificial chromosome):包含一个染色体在酵母中繁殖所需的三个序列成分：A、 酵

11、母染色体的复制起点；B、一个着丝粒，保证染色体分离进入后代细胞中；C、端粒，染色体末端封合。细菌人工染色体BAC (Bacterial artificial chromosome)以F1质粒衍生而来，能克隆约100kb-350kb的外源DNA片段，可以通过转化进入受体细胞，象一般质粒制备原理分离。基因工程工具酶2.1限制性核酸内切酶(Restriction Endonuclease, RE):在研究寄主细胞对噬菌体的限制-修饰系统中发现，它能在DNA特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。基本特征 识别序列为4、5或6个碱基对且具有180°旋转对称的回文结构 同位酶

12、：识别相同的序列但切点不同。 一般来说，识别序列的碱基对越多，则这种酶在DNA上出现的频率越低；不同生物碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同。 切开的DNA末端有平头末端和粘性末端（双链DNA的一条链突出，如5或 3突出末端，在适当的温度下，两个互补粘性末端能退火形成双链分子。2.2 DNA 连接酶:DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应形式是将DNA双链上相邻的3羟基和5磷酸基团共价结合形成3-5磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来，因此它在DNA复制，修复以及体内体外重组过程中起着重要作用。2.3 DNA聚合酶和Klenow大片段酶:DNA聚合酶以一条DNA为

13、模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3-OH端而合成新的DNA。2.4 碱性磷酸酶:细菌的碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠的碱性磷酸酶（CIP）均能催化DNA，RNA，核苷酸的5端除磷反应，因此在DNA重组实验中，该酶用于载体DNA的5末端除磷操作以防止载体自身连接，提高重组效率；用于末端标记。2.5 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT):该酶来源于小牛胸腺，它是一种不需要模板的DNA聚合酶，其合适的底物形式为带有3游离羟基的双链DNA分子,当底物为3端突出的双链DNA时，TdT在Mg2+的存在下，即可将脱氧核苷酸随机聚合在两条链的3端，对于平头或3凹端DNA底物，则需要Co激活，但聚合反应

14、仍不按模板要求进行.TdT在人工粘性末端的构建中极为有用。2.6 S1核酸酶(S1,Nuclease):该酶来源于米曲霉茵，催化反应通常由Zn 2+激活，并在酸性pH（4.0-4.5）条件下进行，其特征是：（1）降解单链DNA或RNA，包括不能形成双链的区域（如发夹结构中的环状部分），但降解DNA的速度大于降解RNA的速度；（2）降解反应的方式为内切和外切；(3)酶量过大时会伴有双链核酸的降解。因为该酶的双链降解活性比单链低7.5万倍，因此在DNA重组及分子生物学研究中，S1核酸酶常用来切平突出的单链末端以及制作S1图谱。用途：(1)测定真核基因中间隔子序列位置；(2)去除DNA片段中突出的单

15、链尾巴；(3)打开cDNA合成时形成的发夹环结构。2.7 影响限制性核酸内切酶活性的因素（1）DNA的纯度：一个限制性核酸内切酶单位u：在最佳缓冲系统中，在37下反应1小时完全降解1gDNA所需的酶量。（2）温度：大部分限制性核酸内切酶最适反应温度为37，但也有例外，如Sma的反应温度为25, SfiI为50 。降低最适反应温度，会导致只产生切口，而不是切断双链DNA。(3)盐离子浓度：不同的核酸限制性内切酶对盐离子强度（Na+）有不同的要求，一般按离子强度不同分为低(0-50 mM) 、中(100mM)、高盐(150mM)三类。Mg2+也是限制性内切酶酶切反应所需(4)缓冲体系：核酸限制性内

16、切酶要求有稳定的pH值环境，这通常由Tris-HCl缓冲体系来完成。(5)反应体积和甘油浓度：商品化的限制性内切酶均加50%甘油作为保护剂，一般在-20下贮藏。在进行酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%，若加酶的体积太大，甘油浓度过高，则会影响酶切反应。(6)限制性内切酶反应的时间：通常为1小时，但大多数酶活性可维持很长的时间，进行大量DNA酶解反应时，一般让酶解过夜。(7)限制性内切酶星号活性：限制性核酸内切酶有特异性识别序列和切割位点，但当酶解条件发生变化时，酶切反应的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种识别位点，这种现象称为星号活性。31凝胶电泳技术：以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶

17、、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyzcrylamide gel electrophoresis,PAGE）琼脂糖凝胶电泳的条件影响：DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。随着电场的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小，即分辨率降低。DNA分子在TAE和TBE等缓冲液中带负电荷，在电场中向正 极移动。琼脂糖浓度。采用不同的凝胶能分辨不同分子量的DNA分子, 琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙。浓度高,空隙小。空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。电场方向。电场方向改变，DNA分子被迫改

18、变路径，DNA分子越大，为适应新的电场方向而重新排列所需的时间就越长。因此可以通过脉冲电场凝胶电泳来分辨极大的DNA分子。32 核酸的分子杂交技术探针与探针标记：带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。切口平移（Nick translation)：DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nick translation)随机引物：能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。South

19、ern杂交技术：待分析的基因组DNA或其它DNA首先用一种或几种限制性核酸内切酶消化，消化后的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳按照分子量的大小进行分离，凝胶经碱变性处理，将DNA分子变性成单链，经毛细管作用或物理方法将凝胶中的单链DNA分子从胶上转移到固相支持物上（一般使用的是尼龙膜和纤维素膜）。然后用标记的DNA或RNA探针对附着于膜上的DNA进行杂交来检测这些被转移的DNA片段，与探针有同源性的DNA片段在膜上的位置可以通过特定的检测方法如放射自显影或显色而显示。Northern 杂交是将RNA样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素滤膜上，用同位素或生物素标记的DNA或RNA 特异

20、探针针对固定于膜上的mRNA 进行杂交，洗脱除去非特异性杂交信号，对杂交信号进行分析，以确定目的基因的是否转录，是检测RNA（主要是mRNA）的方法。1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同2、鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段4、待测样品为总RNA或mRNAWestern blot：将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条

21、带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。操作过程：蛋白质样品制备 SDS-PAGE电泳转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭一抗洗涤 酶标二抗反应洗涤显色或化学发光显影Northern印迹与Southern 印迹的不同点：1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理3、靶核酸为RNA，不需限制酶消化基因文库（gene library)或DNA文库：在细菌中增殖来自某一生物的染色体基因组DNA（或来自所有不同的mRNA种的每一种cD

22、NA分子）所形成的的全部DNA片段之集合体。有基因组DNA文库(克隆)和cDNA文库(克隆)。cDNA克隆文库：来自某一生物的某种组织的所有不同的mRNA合成的cDNA分子再将cDNA重组到载体上，导入大肠肝菌细胞增殖。基因组DNA文库构建载体DNA片段的制备：DNA分离纯化限制酶切 脱磷酸化反应；供体DNA片段的制备：总DNA分离纯化物理切割法或机械搅拌或限制性核酸内切酶酶切法（内切酶Sau3A进行局部消化，可得到10-30kb的随机片段）分离特定大小DNA片段； DNA片段大小分离和富集：琼脂糖凝胶电泳和蔗糖梯度离心技术；载体与基因组DNA大片段的连接。转化（transformation)

23、: 感受态的大肠杆菌捕获和表达外源质粒DNA分子的过程；转染（transfection):感受态的大肠杆菌捕获和表达外源噬菌体DNA分子的过程。感受态：细菌吸收转化因子的生理状态。一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力。载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆。克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。cDNA文库优越性：A、一些RNA病毒基因克隆的唯一手段。B、比基因组DNA文库小很多，容易构建,筛选较简单。C、假阳性几率低。D、生产表达产物蛋白质。E、功

24、能研究,不含内含子序列,可以在细菌中直接表达（一般选 用的载体都是表达型的）。聚合酶链反应（PCR）：能在体外特异快速扩增DNA片段。组成：DNA单链模板、引物和DNA聚合酶（包括缓冲液）。A、Taq DNA聚合酶；B、引物：引物是保证PCR特异性的关键因素，一般使用两个引物来扩增专性序列。C、反应缓冲液：Mg2+: 可显著影响PCR的产量及产物特异性，一般用量为1.5mM。 过高则出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。D、dNTP：dATP, dGTP, CTP 和 dTTP贮备液浓度均为5mM，保存于-20，使用浓度为200mM。过低则反应速度下降，过高则特异性下降。E、反应条件：变性温度

25、和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩 增成功的关键。复性温度和时间：PCR反应的特异性取决于复性过程中引物与模板的结合，一般为40-60.越高, 产物的特异性也越高。时间一般为30-60s。延伸温度和时间：一般位于Taq酶最适作用温度70-75之间。小于1kb的片段一般1-2min就足够了, 而更大片段需延长时间。循环数：在25-30个循环内, 扩增DNA增加明显, 以指数方式增加，后进入相对稳定状态, 此时, 引物和 dNTP下降；Taq酶活性下降；扩增产物（焦磷酸盐和DNA）的阻碍作用；高浓度的产物可能降低Taq酶的延伸和加工能力。所以一味增加循环次数只会增加非特异扩增。PCR

26、技术的应用：A、基因组DNA PCR克隆和cDNA的RT-PCR克隆B、基因组的RAPD（随机扩增多态DNA分析，random amplified polymorphic DNA)标记分析。使用随机的短核苷酸引物，在低的退火温度下进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳所呈显的带型，反映着用作扩增模板的DNA分子的总体结构特征。C、临床诊断和法医鉴定 如男女性别鉴定，病毒性感染病的诊断，对单根毛发或单个 精子作遗传学鉴定等。D、基因表达定量分析DNA测序：Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学修饰法。目的基因的克隆策略是是建立在基因的分子生物学的基础上综合利用各种基因工程技术手段和理

27、论建立发展起来的。目前主要有如下几种策略：PCR或杂交分离、图位克隆、转座子示踪等。A.PCR或杂交分离；B. mRNA差别显示技术（Differential Display of Reverse Transcriptional PCR, DDRT-PCR）；C. 差别杂交 (differential hybridization)；D. 基因图位克隆（map-based cloning)用于分离其编码产物尚不知道的目的基因的一种有效方法。RFLP（restriction fragment length polymorphism), 即DNA限制片段长度多态性，它是指应用特定的核酸限制性内切酶切

28、割有关的DNA分子，所产生出来的DNA片段在长度上的简单变化。分子(DNA)标记(molecular marker)： 分子标记是在所有生物学标记中用途最为广泛的标记。分子标记是一个用作遗传分析的DNA路标，它反映的是不同生物个体DNA序列水平的差异。分子标记的特点：直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；表现为中性，不影响目标性状的表达；许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。染色体步移（chromosome walki

29、ng)：根据高密度的分子标记遗传图谱，利用在目的基因的两侧最紧密连锁的一个或一对分子标记作探针，通过筛选基因组文库分离出阳性克隆，以阳性克隆的末端单拷贝序列为探针再筛选基因组文库分离出阳性克隆，并通过DNA指纹分析将分离出的基因组克隆重叠连接在一起形成重叠群。如此重复多次直到克隆重叠群覆盖目的基因。这种技术称为染色体步移。大肠杆菌表达系统优缺点优越性: (1) 结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是其基因表达调控机制有了清楚的了解；(2)易于大规模培养，成本低廉；（3）经过了遗传改造，已发展为一种安全的基因工程实验系统，拥有各种不同的菌株和载体系列。不足之处（表达真核基因的障碍）:（1) 真

30、核基因具有内含子，所以只能用其cDNA；（2）许多真核生物基因仅在大肠杆菌中合成无特异性空间结构的多肽链；（3）许多真核基因的蛋白质产物，都要经受翻译后的加工修饰，而大肠杆菌缺乏蛋白质加工系统；（4）大肠杆菌内源性蛋白酶易降解外来的真核生物基因所表达的蛋白质分子；（5）大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理涉及三个方面：（1）强化蛋白质的生物合成（重组质粒的拷贝数，转录水平和翻译速率）；（2）抑制蛋白质产物降解；（3) 恢复维持蛋白质特异性空间结构。1.启动子影响表达效率的主要因素之一是启动子的强度，（1）启动子本身的序列，尤

31、其是-10区（TATAAT）和-35区（TTGACA）两个六聚体盒的碱基组成；（2）-10区和-35区的间隔距离，接近于17个碱基对，启动子活性强度也就越强，若大于17，则启动子活性强度也就越弱；（3）与启动子和外源基因转录起始位点之间的距离有很大关系。高水平表达的最佳启动子必须具备的条件：（1）它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10-30；（2）这种启动子应该是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。2.终止子：有效的转录终止子的必要性：（1）转录产物越长，所需时间就多，外源基因本身的转录效率下降；（2）转录通读进入质粒功能区，可能干扰质粒的

32、复制和其他生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；（3）转录终止子能增强mRNA分子的稳定从而大大提高了蛋白质产物的水平；（4）转录产物过长影响翻译效率。3 .SD序列：外源基因在大肠杆菌中的高效表达不仅取决于转录启动频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌mRNA的翻译起始效率主要由其5端的结构序列所决定，即核糖体结合位点（RBS），它包括4个结构要素：（1）起始密码子上游的6-8个核苷酸序列UAAGGAGG,即Shine-Dalgarno(SD)序列；（2）起始密码子AUG；（3）SD与起始密码子之间的距离及碱基组成；（4）基因编码区5端若干密码子的碱基序列，至少这

33、一序列不能与mRNA的5端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。4 .密码子： 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有不同程度的差异性，因此，外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：首先，采用外源基因全合成的方法，按照大肠杆菌密码子偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素，干扰素以及生长激素在大肠肝菌中的高效表达均采用了这种方法；其次，对于那些含有不和谐密码子种类单一，出现频率较高而本身分子量又较大的外源基因而言，

34、则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。5.质粒拷贝数：提高产量除了使用强启动子以提高转录效率外，还可以增加质粒拷贝数以增加基因的剂量，这可以通过构建高拷贝载体而实现。质粒的稳定性对工程菌株高效表达产物非常重要。在寄主细胞快速生长期间质粒易于丢失，出现无质粒细胞。减少质粒丢失的措施：（1）保持抗生素的选择压力；（2）在载体中保留或连接质粒分配功能区bar；（3）避免质粒多体的形成；（4）将重组质粒的扩增纳入可控制轨道。(5)对于分子量较小的蛋白或多肽可采用将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因克隆在高拷贝载体上表达的策略。6.减轻宿主细胞的代谢负荷：合理地

35、调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。7 .防止被宿主的酶降解：1）设计成融合蛋白这是避免被降解的最好措施。2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。3）表达分泌蛋白包涵体是由一群不溶性蛋白质聚集在一起形成的晶体结构物，被膜包裹或无膜裸露。大肠杆菌形成的包涵体大部分存在于细胞质中。外源基因在大肠杆菌中高效表达的蛋白质常形成包涵体，1.以包涵体形式表达异源蛋白的优点： （1）易于分离；（2）蛋白质受到保护而免受胞内蛋白酶的降解；（3）蛋白质没有生物活性，对寄主细胞没有影响。不足的地方： （1）分离时易丢失（终产量偏低）；（2）复性较复杂困难。2.分泌型异源蛋白的表达：

36、这种蛋白质分泌定位于细胞周质，或分泌到胞外培养基中。优点: (1) 易于纯化，因为周质和胞外的蛋白质种类较少；（2）蛋白酶活性较低，蛋白质较稳定；（3）N端甲硫氨酸残基被切除。不足：（1）外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达；（2）表达率较低，分泌到胞外培养基中的蛋白质浓度相当稀。3.融合型异源蛋白的表达：将外源基因和受体菌自身蛋白质编码基因拼接在一起，作为一个阅读框架进行表达，这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白质。真核生物基因表达与调控的特点：1. 转录与翻译不偶联；2. 调控是多层次的；3. 具有组织和细胞类型特异性；4. 对信号分子反应不同。二、真核生物基因表达载体的组成特

37、征 1. 原核DNA序列；2. 启动子：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、杂合启动子3. 增强子；4. 终止子；5. 内含子；6. polyA加尾信号；7. 选择标记基因和报告基因。1. 酵母表达系统：酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。2.昆虫表达系统：是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工以及转移外源蛋白的能力。是建立在对果蝇等昆虫细胞进行稳定转化的基础之上的，在稳定性和表达效率方面有着更为突出的优点。昆虫表达系统的缺点：1. 载

38、体大量复制，最终导致宿主细胞或幼虫死亡，不能连续生产外源蛋白。2. 昆虫细胞对蛋白产物的糖基化方式与哺乳动物有所差异，可能影响到产物蛋白的活性和免疫原性。3. 昆虫细胞的大规模培养费用大。3. 哺乳动物细胞表达系统：哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化和准确的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。4. 植物表达系统：以植物个体、果实或器官作为生物反应器,将目标基因与植物病毒或特定的植物调控元件构建融合基因，以此制造转基

39、因植物,目标基因将在预定时期和部位表达。6.1植物转基因技术的基本路线1）分离能够编码所需产物的DNA片段（目的基因）。2）将目的基因克隆到适当的载体DNA中形成重组DNA，并且 连接了一个控制目的基因转录表达的启动子和一个控制目的基因转录终止终止子，还连接了一个编码特殊性质的蛋白质（如荧光蛋白）标记基因。3）利用细菌繁殖扩增重组DNA。4）利用基因枪、农杆菌等方法将连接了启动子和终止子的目的基因导入到目标植物的细胞中。5）筛选含有外源基因的转化细胞，并诱导产生转基因植株。6）转基因植株大规模种植。 外源基因导入植物的方法外源基因导入植物细胞的方法可分为DNA直接转化（naked DNA tr

40、ansfer）和以载体为媒介的基因转化（vector mediated gene transfer）。A. DNA直接转移法：DNA的直接转移是通过物理化学法将外源基因转入受体植物细胞的技术。 1. 化学刺激法：它的主要原理是植物细胞的原生质体经过某些化学药品（PEG、PNA、磷酸钙、氯化钙）处理后，能够捕获外源DNA。 2. 电击法：电击法是一种直接转移外源基因进入受体植物细胞的方法，这种方法可适用于单子叶植物及双子叶植物细胞原生质体的转化。3. 显微注射法：微针注射是一种经典的物理转基因技术，它是借助显微注射仪，将外源DNA或mRNA通过机械方法直接注射到受体细胞。4.

41、 脂质体介导法： 当脂质体与植物原生质共温育时，脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，脂质体内的外源DNA通过融合或吞噬作用高效率地转运到原生质体细胞质和细胞核内。5. 基因枪法：基因枪技术（biolistics）也称微粒轰击法（mcroprojectile bombardment），是一种快速有效的植物DNA转移系统之一。其基本原理是利用带有外源DNA的金粉或钨粉微粒经过放电或机械加速后对细胞射击。6. 微激光束法：这种方法的原理是利用激光微束脉冲引起细胞膜可逆性穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞。 7. 花粉通道法（Pollen-tube pathway）：该法是将外源DNA片

42、段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备正常细胞壁的受精卵、合子及早期的胚体细胞。分子生物学检测方法：1.酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）检测。ELISA检测是利用抗原与抗体反应的特异性，当抗原与抗体结合时，通过结合在抗体上的酶作用于特定的底物后发生显色反应，借助于比色鉴定转基因植物。2. PCR技术检测：根据转基因植物中外源基因的特点，设计并合成相应的引物，以转基因植物DNA为模板在PCR仪中进行PCR扩增反应。与Southern分析相比，PCR检测DNA用量少，操作

43、简单，成本低，不需同位素即可完成。但PCR检测的假阳性高，从而造成检测结果的误差。与ELISA检测法相比，PCR检测不仅具有快速、灵敏、特异性强等特点，而且可应用于豆腐和油炸豆腐等食品的检测。从应用范围看，PCR检测应用较ELISA法更加普遍。3. 分子杂交：Southern杂交可以确定外源基因在植物中的组织结构、外源DNA整和的位置及拷贝数、转基因植株F1世代外源基因的稳定性。Northern杂交用于检测转基因在转录水平上的表达，与Southern杂交相比，更接近于性状表现，更有现实意义，被广泛用于转基因植株的检测。Western杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果，能直接显示目的基因在转化

44、体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现。植物作为制备基因工程疫苗生物反应器的优势 ：微生物发酵系统不能对真核蛋白质疫苗进行正确的翻译后 加工，有时导致其免疫原性变弱。而植物与动物细胞表达系统，可对表达产物进行转译后加工，保持了自然状态下的免疫原性。细菌在发酵过程中常产生一些不溶性聚合物，其要重新溶解并折叠成天然蛋白质则需要很高的成本，且发酵需要庞大设备投资。动物细胞生产基因工程疫苗，常用动物病毒作为载体导入抗原基因，在生产过程中也可能污染动物病毒。转基因植物中的外源基因可通过植物杂交的方法进行基因重组而达到在植物体内积累多基因的目的。 植物表达系统生产的疫苗可以直接储存在植物种

45、子和果实中，无需冷连系统设备进行储藏运输，故易于长距离运输和普及推广。不仅降低了成本且方便，可随时长期给药。疫苗抗原基因转入可食用的植物后，可供人直接服用或饲喂动物，不需要分离提纯。这样可节约许多仪器设备，降低生产成本，使用方便。粘膜免疫是病毒性腹泻的免疫保护机制，但在启动粘膜免疫方面尚属难题。转基因植物细胞是可以启动粘膜免疫的有效途径。提供营养。通过转基因植物生产的口服疫苗，不仅提供了疫苗，而且提供了营养。 转基因动物（transgenic animal）是指用DNA重组技术将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，使外源目的基因随细胞的分裂而增殖并在体内表达，且能稳定地遗传给后代

46、的动物。转基因动物的关键技术包括：(1)外源目的基因的分离 (基因的克隆及重组DNA的制备等)；(2)外源目的基因与专性基因表达起动子、增强子、报告基因等构件的拼接重组；(3)外源目的基因重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞；(4)胚胎移植技术 (Embryo Transfer，ET)；(5)转基因胚胎发育生长鉴定及筛选转基因动物品系；（6）目的基因整合率及表达效率的检测。在这些程序中最重要的方法是成功地把外源目的基因转入动物早期胚胎细胞中。显微注射法：在显微操作仪下用极细的微吸管将在体外构建的外源目的基因注射到处于原核时期的受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖过程中通过DNA的复制而整合到动物基因组中，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物。显微注射法的不足之处有(1)外源基因整合的效率低（尤其是大家畜）； (2)不能控制转基因的整合位