抗体的选择和保存指引

1、抗体选择指南抗体保存指南抗体说明书样本一扰体逸捧指南:检测任何目的轮蛋白都有不止一种抗体可供选择,为端小抗体的选择范围选中适宜的抗体,需要考虑如下几种因素：1. 分析或应用的类型2. 样本虽色的焙构性质3. 样本的种展4. 杭体宿主的种矣5. 杭体的林记和检澳1分析试验的应用类型一赦抗体说明书都列出该抗体经试胜验证过适用于啊；发型,如：" 用于WB IUC ICC ELASA分析等,如果抗体说明书没有提及的应用类型,并不意味着该抗体不适用于此种分析应用美型,而仅 是说明尚未经过此种分析试脸脸证,如果抗体不适用某些分析试脸,贝!会在杭体说明书上标注出来不适于某分析试验.2 样本蛋白的绪

2、枸性质 了解样本蛋白的堵构性质有助于选择景适宜的抗体,至少两方面因素需要毒虑O.w»样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫窗主而制备得来其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、 全有机体如：细茵或g 抗体说明书一欢都有免疫原的猫述,如果打算检激的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全 长的某一区域,那么必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体.如果打算用FACS流式检测活细胞的发面蛋白,叫带要选择含 该外表蛋白的肱外城来免疫制备的抗体.2样本的提：某些抗体要求样本经特殊处理.例如：许多抗体只识别复原和变性的、表位已暴露不受四级结构阻碍的蛋白样本,另一方面,某些抗体仅识别天然折

3、叠状态的蛋白.中选择免疫组化的抗体时,应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的坦织,而另一些抗体那么适用于无需抗原修复解交联步聚的甲酵固定石蜻包埋的组织,这些都会在抗体说明书上应用局部标示出来3样本的物种破选择物种相网或有交又反响的抗体,抗体可能与不同物种的同种秘蛋白有交又反响,因其氛基酸序列同源性较高.如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反响种属友中,并不意味着该抗体不适用于检浏该物神的蛋白,而只是表示该物种尚未用比抗体检溜脸证过,应通封序列比对的方法来预浏交叉反响,可应用Expasy和NCBI BLAST来道行不同物种蛋白同源性比对.4 一抗省主物神的选择 一般说来.在使用偶联二抗结合无僵联物

4、的一抗时,一务冲谑择较为重要,对于免疫坦化而言.尽可能选择与样本不同种系物种的一抗,从而预防二抗与样本内漳性免疫球蛋白产生交又反响,例如：检测小鼠样 本蛋白,那么不庄逸择小鼠或大鼠源的一杭,最好逸兔源的一杭,那么二抗那么可选择偈联了检测分子晦、荧光素.生物素等的 抗兔IgGe如果选绎布倡联物的一抗那么不适用上逑情况,除免疫绿化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法,那么抗体 宿主物种的彩响不大,如对不含IgG的细胞裂解物样本的western blotting尽管如此,含有血清的组织裂解物和组织培 养上清中含有免疫球蛋白,复原变性样本中含IgG,在western blot 中那么结合出现I

5、gG分子50 and 25 kDn的重链和轻楚条带,5二抗的逸舞二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源,例如：如果你的一抗是小鼠的单克隆抗体,二抗期选抗小鼠的二抗anti mouse secondary检查二抗说明书保证该抗体适用于你的检测应用,二抗一般连接荧光素FITC或发光团.6双重染色抗体的选鼻用未偶联一抗进行细胞焙养物或组织切片的双宣免疫染色要求一抗来源于不同种并且二抗分别识别其中之一,二抗说明书应描述其与其它物种来源的免疫球蛋有否布交叉吸附.7萸光愈化学发光标记变接于二抗的标记物是为了检刑抗体的结合,选择标记物依找于几个/数：检凋方法:荧光或着也沉淀,荧光标记物用特殊波长的光激发时发射

6、出可见光,下表列出了凡种荧光素的分子特征：荧光素醵色激发波发射波长Aminomethylcoumarin (AMCA)Blue353440410Fluorescein (FITC)Green495528390Fluorescein (DTAF)Green495528530Rhodamine (TRITC)Red550570444Texas RedtmRed596620625Cy2tmGreen489505897Cy3tmOrange552565949Cy3.5tmScariet5815961,286Cy5tmFar-Red650667975Cy5.5tmNear Intra-Red678703

7、1.312Cy7tmNear Infra-Red7437671.001R-Phycoerythrin (RPE)Red488575240.000B-Phycoerythrin (BPE)Red545575240.000C-PhycocyaninRed618640110.000R-PhycocyaninRed615620110.000二杭连接标记酶HRP and AP与其房物产生本.色的沉淀物辣根过氧化物醇碱性璘酸醇Horseradish peroxidase (HRP)Alkaline phosphatase (AP) AEC (red)Fast red (pink)DAB (brown)I

8、NT (yellow / brown)NBT (brown / purple)New Fuchsin (red)TNBT (purple)Vega red (pink)除上迷之外的发光基团是封片介质?仅免疫姐化.AEC. Fast Red. IM或其它水性发光基团是可以醇溶的并要求水性封片.有机的所以最好使用有机性封片介辰.荧光索标记物要求水性封片介质,藻红蛋白藻青舞/藻红素要求不添加甘油的水性封片介质,因其右淬灭荧光的效应,生物素化的抗体通菖用于增强亲和素生物素叫或荧光素复合物ABC试剂或亲和舜或镇盈亲和生连接酶或荧光素的信号抗体保存指南抗体保存得当与否,直接决定了抗体的活性和使用效果！如果

9、抗体保存得当,大国分抗体活性都可以推持数月甚至数年,本指南以abeam抗体保存方法为主,同样也可以应用到其他绝大局部公司的抗体产苗！请慢记！无论何眈请根据说明书推荐的存条件正保证存抗体！1.收到杭体后请务必在12000rpm *心20-30s后再翻开管假设逐行分荣和保存！质优的抗体使用非常特殊的储存管,只有在12000rp<n离心20 30s才能将附着在管堡或羞内的抗体全部离心下来.即使是在 lOOOOrpm也会导致离心不完会,导致出现抗体的量缺乏的现象！ 对于大邙分抗体.比拟适宜的保存方夫是分装后保存在-20度or-80度对给大多数杭体来说,保存在20度是充金足够了 没有任何证据显示保

10、存在-80度会有更多的好处, 分滨可以景大程度的降低反蔓冻融对抗体活性的报害,弓时乜降低了由于屡次从同一管中吸取抗体造成的占染可能性.分装的量以一次实狡用完为好,最少不能少于lOul每份.由于分装体税越小,抗体的浓度越可能会受到茏发以及管壁吸卅的影电夏融后的分英杭体如果一次用不完,将剌余母液保存在4度,预防再流起来！抗体工作液&该当天配制当天用充,在4度尽量不要蔑过I天宛对预防将抗体保存在自动除后冰箱中.尽量将抗体保存在冰箱里层,而不是门上3. 大局部抗体收到后4度短暂保存1-2周对抗体活性是没有彩响的.如果抗体怨诀1 2 .B会使用,推存在4度保存,这是为了预防反复冻融对抗体活性的损

11、害.如果要长期促存厩最好是在-20 度or 80度.最关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体！但是,残 ：的产品请在收到后立即冻起来！由于该类产品舍有大量的蛋白阵.长期在4度保存会导致抗体的降解！4. 大局部抗体的运输条件：一赦的运输过程需要1-2 的时间,所以是在4度的条件下来完成的.4度运辑最主要的目的是为了预防反复冻融对抗体活性的貌害如是使用于冰运辑,那么收豺时抗体是冻起来的,为了分 装就需要解冻.这就多了一次冻融的过程.所以运输过程中绝对预防千冰羊的！特殊抗体的保存条件：鼻暇抗体：水运保存在4度.遮免冻起来.否那么会导致阵活性锻下降或者丧失偈联抗体：所有偈联杭体都是在林色管

12、中或使用锦箝纸避光保存.尤其是荧光抗体,对光极为缺弟,因此在所有的突股阶段起是要避光漆作的！IgG3的同型对原：永远保存在4度,ST ,.由于如果 融it程,诙疵体*#易形成多聚体无论是保存还是运输,绝对遽免反复冻融！反复冻融会导致抗体变性,导薮多聚体形成,从而降低抗体的结合水平！抗体保存其它相关信息:关于参加甘油保存:V1- '-令到抗体中来姓免反复冻融,甘油在20度会降低W抗体可能是可行的但是abeam仅对非常小的一局部抗体检双过其在这种条件下的稳定性：而abeam只对根据推荐条件保存的抗体提供质量保证！ 参加甘油的溶液不建议在-80度保存,由于这巳经成过了廿油的冰点.如果您要参加

13、甘幼来保存抗体的话,清遂慎注意无菌操作,遮免污染！关于蛋白保护剂：蛋白在高浓度时更不容易降解(1 mg/ml或者更商,这就是为什么在抗体中参加BSA之类作为稳定剂的原因了；另一方面, 参加的蛋白也可以戏少抗体由于管壁吸附所造成的撮失.但是如果杭体要用来标记的话,那么不能参加蛋白快定剂,由于这些德 定剂会和抗体一起竞争结合标记物.关于登氮化钠(sodium azide)的使用*为了预防金生物污染,叠鬼化钠经常被参加我抗体中(终浓度0.02% (w/v)> . Abeam的银多抗体巳经舍有了 0.02%-0.05%的叠 氛化钠,在说明书的"Storage buffer*中有标明的.

14、在下述情况中不能使用叠氧化钠：9.如果杭体用于染色成处理活细胞,用亍体内疥究：:ft氮化钠在反抗微生物的同时,对其它大局部布机物也是书言的,由于它阻断了线粒体W cytochrome electron transport system.10.要仍联带有氯基基团的抗体：面氮化钠会干扰任何含相策基基团的偈联,因此在进行隅联之前,应将赍氮化钩去除.偶联后的抗体可以参加叠化钠保存, 但是浓度只能是0.01%对于需要偶联的抗体,thimerosal (merthiolate)可以替代叠兼化钠作为保护剂！注:登氮化敏的去除方式:可以通过凝胶电泳或过滤演方式去除！ 1四的分子量是150k!)H (I或是&#

15、39; 600kDQ；叠氮化钠放分子量只有65脸.使用cut off l lkDa放滤卜即可料叠氮0钠从抗体中去检扰体说明书样本Product NameNFkB pl05 / p50 antibody E381 (注:E381 是指克隆号)Product typePrimary antibodiesDescriptionRabbit monoclonal E381 to NFkB pl05 / p50InmunogenA synthetic peptide corresponding to residues in the nuclear factor NFkB p50 subunit.Reac

16、ts withHu. Ms. Rat 注：人小鼠大鼠SpecificityThis antibody bill detect both forms： p50 and pl05.Tested applicationsPlow Cyt. ICC. IHC P. WB流式细胞分析免疫细胞化学免疫缰织化学*辨包埋westernblot i ngApplication notesRecommended dilutionsFlow Cyt： 1/30.ICC： 1/2501/500.IIIC P： 1/2501/500.WB： 1 /5000. Detects bands of approximntely

17、 50 and 105 kDa (predicted nnlecular weight： 50 and 105 kDa).Is unsuitable for IP.Not yet tested in other applicat ions.Optimal dilut ions/concentrat ions should be determined by the end user.Positive controlHeLi cell lysate： human prostate carcinomaCellular localizationNuclear, but nlso found in th

18、e cytoplasm in an inactive form conplexed to an inhibitor (I kappa B).Research areasCancer » Signal transduction » Nucleai- signaling » NFkB pathwayChromatin » Transcription » Transcription FactorsNuclear Signal inq » Xue lc<ir Signaling Pathways » M'kB path

19、way» Iraiist z-ip: iun » 0:1:Cell Biology » Signal Transduction » Nuclear Sigruiling » NFkB PathwayImmunology » Innate Immuni ty » Macrophage Ini liimm.Cell Biolou? » Apoptosis » In: r<icel lulnr » FkB » p50RelevanceNFkB is a transcription re

20、gulator that is activnted by various intra and extra cellular stimul i such as cytokines, oxidant free radicals, ultraviolet irradiat ion, and bacterial or viral products. NI*B is a family of trnnscription factors that consists of homo and heterodimers of NFkBl/p50 and RelA/p65 subunits, and control

21、s a variety of cellular events i nc 1 ud i ng de ve 1 opmen t and immune responses. All members share a conserved amino terminus domain that includes dimerization, nuclear localization, and BNA binding regions, and a carboxy terminal transactivation domain. Serines 529 and 536 in the tninsactivation

22、 domain of RelA/p65 arephosphorylated in response to several stinnili including phorbol ester, IL1 alpha and TNF alpha as mediated by IkB kinase and p38 MAPK. Serine 529 is located in a negatively charged region (amino acids 422 S40) that is phosphorylated in response to phorbol myristate acetate pl

23、us calcium ionophore activation. Phosphorylation of serines 529 and 536 is critical for RelA/p65 transcriptional activity. Activated NFkB translocates into the nucleus and stimulates the expression of genes involved in a wide variety of biological functions. Inappropriate activation of NFkB has been associated with n number of infliimmatory diseases whi 1 e persistent inhibition of NFkB leads to inapprop