华南农业大学-LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt课件

1、一、实验目的：一、实验目的： 1.了解聚丙烯酰胺凝胶的制造过程及构造特点。 2.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及分别乳酸脱氢酶同工酶的电泳过程。二、实验原理二、实验原理 1. 1. 聚丙烯酰胺凝胶原理及影响要素同实聚丙烯酰胺凝胶原理及影响要素同实验三验三 2 2聚丙烯酰胺凝胶电泳原理同实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳原理同实验三 3. 3. 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)(LDH)同工酶圆盘电泳同工酶圆盘电泳 同工酶是指生物体中构造和性质不同而能同工酶是指生物体中构造和性质不同而能催化一样反响的一类酶。许多酶都具有同催化一样反响的一类酶。许多酶都具有同工酶约占知酶的工酶约占知酶的404050%50%，凝

2、胶电泳可，凝胶电泳可利用同工酶构造上的差别而将之分别。利用同工酶构造上的差别而将之分别。 乳酸脱氢酶lactate dehydrogenase 简称 LDH， EC.1.1.1.27是催化丙酮酸和乳酸可逆转化的酶。 1959年 Markert 等用电泳的方法将牛心肌提纯的LDH结晶分别出5条区带，接近阳极一端的称 LDHl ，接近阴极一端的称为LDH5；其他3种，由阳极到阴极依次命名为LDH2 ，LDH3及LDH4。它们均具有LDH 催化活性，从而首先提出了同工酶(isoenzyme)的概念。 目前知LDH同工酶是由亚基及M亚基按不同比例组成的四聚体，它们是H4LDHl，H3MLDH2，H2M

3、2LDH3，HM3LDH4及M4LDH55种。心肌中以LDHl含量高，骨骼肌及肝中LDH5 含量高。 LDHLDH同工酶底物染色显色反响如下：同工酶底物染色显色反响如下： 反响式中PMS为甲硫吩嗪phenazine methosulfate，NBT为氯化硝基四氮唑蓝nitroblue tetrazolium chloride的缩写，它们都是接受电子的染料。LDH与底物染色液在37温浴中脱下的氢最后传送给 NBT生成蓝紫色的 NBTH2称为甲膝，此物不溶于水，有利于显色后区带的保管，但可溶于氯仿及95%乙醇91的混合液。因此电泳后的显色区带可经过浸泡法浸出，于560nm比色，也可用光吸收扫描仪得

4、出LDH同工酶间的相对百分含量。 目前，LDH及同工酶检测已广泛用于临床，作为某些疾病鉴别诊断的根据，常用醋酸纤维薄膜电泳，琼脂糖电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳分别 LDH及共同工酶，这3种不同支持物电泳及染色原理完全一样，但灵敏度不同。三、实验资料、仪器和试剂三、实验资料、仪器和试剂 ( (一一) )实验资料由教师预备实验资料由教师预备 兔子血清和组织兔子血清和组织( (肝脏组织、心脏组织、肝脏组织、心脏组织、肾脏组织、肌肉组织、肺等肾脏组织、肌肉组织、肺等) )提取液组织提取液组织分量与组织匀浆缓冲液体积比为分量与组织匀浆缓冲液体积比为110110g/mLg/mL。 组织样品处置：称取组织样品处

5、置：称取0.50.5克兔血清和肝脏等克兔血清和肝脏等组织，各参与组织，各参与5mLPBS5mLPBS和少量石英沙于研钵和少量石英沙于研钵磨成匀浆，离心磨成匀浆，离心10000r/1010000r/1015min15min，取上，取上层清液层清液4 4保管作为母液。保管作为母液。 电泳样品：用移液枪各取电泳样品：用移液枪各取1mL1mL上述提取液，上述提取液，加加1mL40%1mL40%蔗糖溶液和蔗糖溶液和20uL20uL溴酚兰，混匀。溴酚兰，混匀。 (二) 仪器及器皿 1 全班共用： 圆盘电泳槽 直流稳压电电泳仪 恒温水浴锅 微量加样器 移样器 电炉等 电泳槽3个(12个管/个)，电泳仪3个，

6、200mL烧杯10个，100mL容量瓶5个，1000mL容量瓶1个(或1000mL量筒1个)，广泛pH试纸，塑料大烧杯2L2个, 塑料大烧杯L1个，剪细滤纸条1杯。 2 每组配备 长滴管1支，玻管及乳胶管带玻珠2个，长针头注射器1支，试管2支，洗耳球1个，10 mL离心管2个，玻棒。( (三三) )、试剂、试剂1 1 制备样品有关试剂教师配制备样品有关试剂教师配1 10.01mo10.01mo1L pH 6.5L pH 6.5磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液PBSPBS，用于组织匀浆缓冲液及，用于组织匀浆缓冲液及LDHLDH的的染色液染色液Na2HPO412H2O 0.2256g Na2HPO412H

7、2O 0.2256g ，NaH2PO4H2O NaH2PO4H2O 0.2g0.2g，加水定容到，加水定容到200mL200mL。2 240%40%蔗糖溶液蔗糖溶液 20g 20g蔗糖用水溶解定容至蔗糖用水溶解定容至50mL50mL。3 30.50.5溴酚兰溴酚兰 10mL 10mL2 2、制备、制备PAGEPAGE的试剂的试剂 在通风橱里加浓在通风橱里加浓HClHCl，每大组，每大组3 3个小组配以下试剂个小组配以下试剂1 1 凝胶贮备液凝胶贮备液A A：称：称TrisTris三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷 9g9g于于100mL100mL烧杯中，加浓烧杯中，加浓HCl 1 mLHCl 1

8、 mL，TEMEDTEMED四甲基乙二胺四甲基乙二胺原液原液 0.18 mL0.18 mL，于量筒加水定容至，于量筒加水定容至25mL25mL，用试纸检测，用试纸检测pHpH为为8.98.9。2 2 凝胶贮备液凝胶贮备液B B：丙烯酰胺：丙烯酰胺AcrAcr15g15g，甲叉双丙烯，甲叉双丙烯酰胺酰胺BisBis0.4 g;0.4 g;，加水于，加水于100mL100mL烧杯中溶解，然后混烧杯中溶解，然后混合于容量瓶加水定容至合于容量瓶加水定容至50mL50mL，假设有沉淀要过滤。，假设有沉淀要过滤。3 3 凝胶贮备液凝胶贮备液C C：过硫酸铵：过硫酸铵0.14g0.14g，溶解后，于容量瓶，

9、溶解后，于容量瓶加水定容至加水定容至50mL50mL制胶时现配现用。制胶时现配现用。4 4 电极缓冲液：电极缓冲液：Tris 3gTris 3g，甘氨酸，甘氨酸16g16g，加蒸馏水溶解，加蒸馏水溶解并定容至并定容至300 mL300 mL，pHpH为为8.38.3，运用时稀释，运用时稀释1010倍。每个倍。每个电泳槽可装电泳槽可装1000 mL1000 mL的电极缓冲液，的电极缓冲液，1212支管支管/ /盘，盘，3 3个圆个圆盘盘/ /班班3 3 、LDHLDH同工酶染色储存液同工酶染色储存液( (电泳过程中配制电泳过程中配制) )(1)(1)、5mg /mL NAD+5mg /mL NA

10、D+氧化型辅酶氧化型辅酶I I溶液：称溶液：称 400mg NAD+400mg NAD+定容至定容至80mL80mL，置棕色瓶中，置棕色瓶中，4 4C C可保可保管管2 2星期。星期。(2)(2)、1mol/L1mol/L乳酸钠乳酸钠 分子量分子量 112.06 112.06：取：取 60% 60%乳酸钠乳酸钠4.6 mL4.6 mL定容至定容至50 mL50 mL，置棕色瓶中，置棕色瓶中，4 4C C度度保管。保管。(3)(3)、0.1mol/L NaCl0.1mol/L NaCl：取：取0.584g NaCl0.584g NaCl，加蒸馏，加蒸馏水溶解并定容至水溶解并定容至100mL100

11、mL。(4)(4)、1mg/mL 1mg/mL 甲硫吩嗪甲硫吩嗪(PMS)(PMS)：取甲硫吩嗪：取甲硫吩嗪(PMS) (PMS) 25 mg PMS25 mg PMS，加蒸馏水溶解并定容至，加蒸馏水溶解并定容至25mL25mL。(5)、1mg/mL 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)溶液：160mg NBT，加蒸馏水溶解并定容至160mL,于棕色瓶4保管。每次用完请妥善保管。当黄色NBT变绿色或出现沉淀，不能再运用。6、0.01mol/L pH 6.5 PBS磷酸盐缓冲液，全班共用的量：Na2HPO412H2O 0.2256g ，NaH2PO4H2O 0.2g，加水定容到200mL 四四 操作步骤操

12、作步骤 1 1凝胶柱的制备凝胶柱的制备( (每人做每人做1 1条胶，玻璃管体积条胶，玻璃管体积2mL2mL，胶量胶量1.5mL)1.5mL) 将凝胶贮备液将凝胶贮备液A A、B B及水按及水按1 1：2 2：1 1的比例混合于的比例混合于烧杯中，另量取烧杯中，另量取4 4份的份的C C液于另一烧杯中液于另一烧杯中 留意：留意：每每6 6人配制如下：人配制如下： 1 1个烧杯配个烧杯配A A：B B：水：水1(3 mL)1(3 mL)：2(6 mL):1(3 mL)2(6 mL):1(3 mL) 另一烧杯配另一烧杯配C C液液4 4份份(12 mL)(12 mL) 当预备好带有玻珠乳胶管封底的玻

13、璃管后，可把两烧杯中的溶液混合，轻搅均匀，用长滴管沿玻管壁小心加到玻管中。胶液应灌到离管口约58mm处。用手指轻弹管壁，将管中胶液能够混有的气泡赶出，然后用滴管在胶液面上小心注入一层35mm蒸馏水，以防胶凝结时外表构成弯月面并隔绝空气。当见到水层与胶液交界处有一明晰界面时，阐明胶已聚合。2 2、预电泳、预电泳将乳胶管从凝胶聚合后的玻管中小心拔出，用滤将乳胶管从凝胶聚合后的玻管中小心拔出，用滤纸吸去凝胶上层的水，把凝胶管插入到圆盘电纸吸去凝胶上层的水，把凝胶管插入到圆盘电泳槽的槽洞橡皮塞中。上下槽中参与稀释好的泳槽的槽洞橡皮塞中。上下槽中参与稀释好的约约250mL250mL电极缓冲液，并使两管口

14、都不存气泡。电极缓冲液，并使两管口都不存气泡。为防止为防止LDHLDH及其同工酶受凝胶聚合后残留物及其同工酶受凝胶聚合后残留物( (如如 APAP等等) )的影响，引起酶的钝化或其它人为效应，的影响，引起酶的钝化或其它人为效应，在加样前，应进展预电泳，电泳条件：以每管在加样前，应进展预电泳，电泳条件：以每管2mA2mA的电流进展电泳，约的电流进展电泳，约151530min 30min 。 3 3加样和电泳每人点加样和电泳每人点1 1个样，样品：血、肝、个样，样品：血、肝、肌肉、心、肾、肺肌肉、心、肾、肺 封锁电源后预备加样，用封锁电源后预备加样，用2 2移液枪加样品移液枪加样品( (血加血加5

15、0uL50uL，其它样品加，其它样品加25uL)25uL)。上槽接负极，下槽接。上槽接负极，下槽接正极，以每管正极，以每管2mA2mA的电流进展电泳。当电泳指示的电流进展电泳。当电泳指示剂溴酚蓝带迁移出凝胶柱剂溴酚蓝带迁移出凝胶柱303060min60min时，可停顿时，可停顿电泳。电泳时间约电泳。电泳时间约2 23.5h3.5h。 4 4脱胶、染色和脱色脱胶、染色和脱色 把从电泳槽中取出的凝胶管用带长针头的注射器把从电泳槽中取出的凝胶管用带长针头的注射器脱胶。将吸满水的注射器针头沿壁插入玻管壁与脱胶。将吸满水的注射器针头沿壁插入玻管壁与凝胶之间，边注水边推进针头并缓慢旋转玻管，凝胶之间，边注

16、水边推进针头并缓慢旋转玻管，使凝胶与管壁分别，那么凝胶柱自然滑出，假设使凝胶与管壁分别，那么凝胶柱自然滑出，假设不能滑出可用洗耳球吹出。不能滑出可用洗耳球吹出。 1每个试管按下表1的顺序，在临用前将有关试剂混和配制约12 mL LDH活性染液每6人大组共配12672mL。NAD+ 乳酸钠 NaCl NBT PMS PBS总体积（mL）每人用量（mL）21.21.250.52.512六人用量（mL）127.27.23031572表1 LDH活性染色液每组用量 2把配好的染色液倒入试管中，脱出的凝胶放入盛有染色液的试管中,避光置37水浴中保温1020min，待LDH 同工酶呈现蓝紫色区带,回收染色液。 3用蒸馏水洗3次除去染色液，参与水浸泡，凝胶底色脱净，背景明晰，把凝胶柱放在灌满水的试管中，对光察看过乳酸脱氢酶同工酶谱，并画电泳图或拍照。 也可将凝胶板放在保管液中浸泡四四. .结果与分析结果与分析 1 对同工酶谱带进展绘图、记录或照