引物设计条黄金法则 十

1、引物设计条黄金法则 十 1质粒扩增编辑质粒扩增是大量获取质粒的一种化学生物学方法，通常包括将细菌质粒转化到大肠杆菌中，然后从大肠杆菌中收获大量质粒的过程。2步骤编辑细菌铺板：让细菌在LB培养基上生长，培养基上为了防止杂菌生长，会加入抗生素，而含有目标质粒的细菌带有抗生素的抗性，能够正常生长，从而保证板子上长出来的会是目标菌落。挑选菌落：从LB培养基上挑选菌落备用细菌培养（ ）：将挑好的菌落放到大肠杆菌培养液当中，并于37摄氏度培养箱中以250rpm摇动812h，使大肠杆菌繁殖裂解抽提：采用细胞裂解的方式，从含目标质粒的大肠杆菌菌液中将质粒提取出来3用途介绍编辑这一实验主要用于获取较多的质粒，质

2、粒扩增需要的源头质粒量非常小，1微克的质粒都已经能够满足扩增的需要，这也使得质粒的使用和赠送变得非常容易。质粒的用途往往是用于转染细胞，通过转染的方式让细胞表达质粒中携带的基因，从而研究该基因对应蛋白的性能。在基础细胞生物学研究中起着非常重要的作用。PCR引物设计的11条黄金法则 2008-08-19 08:12:52| 分类： 分子生物学知识 |举报|字号 订阅1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.

3、引物长度一般在1530碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。3.引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好接近72。GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，

4、其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。4.引物3端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5.引物3端不能选择A，最好选择T。引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。6. 碱基要随机分 布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中

5、四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致

6、产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。8. 引物5 端和中间G值应该相对较高，而3 端G值较低。G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应当选用5 端和中间G值相对较高，而3 端G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3 端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的G值可以用Oligo 6软件进行分析）9.引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。引物的5 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5 端修饰包括：加酶切位点；标

7、记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3 端开始的，不能进行任何修饰。3 端也不能有形成任何二级结构可能。10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的

8、。11. 引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高 或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：1)避免重复碱基，尤其是G.2)Tm=58-60度。3）GC=30-80%.4)3&#3

9、9;端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。6)PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污

10、染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备-寻找合适的引物非常不容易。关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。关于引物设计的体会 2008-08-19 08:11:39| 分类： 分子生物学知识 |举报|字号 订阅第一贴记得当时搞引物设计的时候，还是我的大师兄领入门的，在此谢过了。师兄教了一些基本原则后，就放羊了

11、。接着自己捣鼓来捣鼓去，在导师的实验室内设计了十几条引物，用起来还蛮好的，逐渐赚了点名气。后来，就和上海鼎安合作了，帮别人设计引物在他们公司订购引物，拿点回扣。别人拿给我设计的引物，都是很头痛。因为客户往往都是自己捣鼓一下，不行了才到我这。到现在已经成功设计了四五十对引物了。不过至今money颗粒无收，就不了了之，主要是客户拖欠的问题，不过不后悔，毕竟是不错的经历啊。所以，也算是有点个人观点，和大家分享，不对的地方请指正。我用Primer 5.0搜索引物、Oligo 6.0评估引物，这是根据各自所长定的。但有个朋友，他就只用Oligo，说设计的引物也还可以。Primer 5.0搜索引物：1.P

12、rimer Length我常设置在1830bp,短了特异性不好，长了没有必 要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。2.PCR Product size最好是100500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是4060。其它参数默认就可以了。4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端2个A或T,或引物内部连续的G或C

13、太多,或引物3端2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。Oligo 6.0评估引物：1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable

14、 Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。2.Hairpin Formation根据黄金法则3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。 下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。G参照黄金法

15、则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以G绝对值越大结构越稳定。最后说一句，敢于尝试就会成功。第二贴科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和6

16、5°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法 则也不是没有例外，不是112那么确定。4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。谈一下我学这个引物设计的过程吧：入门前面我说过是我的大师兄把我领进门的，之后我就自己

17、捣鼓。一开始严格按照引物设计的黄金法则来，primer搜出来的引物oligo评估，我就这样一条引物一条引物地反复评估，不厌其烦，到处查阅资料，一做就是几个小时，幸运的是捣鼓出来一两条符合标准的引物。提高有了成功的经验后，就继续做，当时我们实验室要定很多引物，我就有了练手的素材，这也很重要什么东西不是练出来？！设计多了，问题也多了。有些引物按黄金法则来，行不通了，怎么办？1、我就把引物3端或5端延长或缩短一个或几个碱基，再反复评估2、有些引物还不行，我就把5端突变一个碱基，再反复评估3、再不行，我就放宽条件。放宽到什么样可以，不好说，自己摸索。有的 一对引物，其中一条错配很厉害，而另一条很可以，

18、在没有其它选择的情况下为什么不可以。有的人担心，这不一定跑的出来啊。对自己要有信心啊，原因有二：1.自己的引物谁有功夫帮你设计？所以啊，当时我就被“赶鸭子上架了”，反反复复搜索评估的基础上，出来的应该是目前最好的；2、还有，我经常看国外文章的引物，有的评估起来表面上差的要命，人家照用，结果还不是出来了。我就分析这样的引物，得出经验，胆子也大了。当然失败肯定是有一两次的。当然，有人说我就设计那么一条引物，输不起。那只好说Sorry了!总之，我的经验就是：立即上手，遇到问题再解决问题，不厌其烦，不就是个软件嘛,还征服不了？！第三贴个人觉得引物很有必要在NCBI上BLAST一下，看看非特异性引发如何！楼主说得很对，设计引物的最后一步就是验证引物的特异性，我有一贴就是说引物验证的，在此不赘述，见下：鉴于BLAST界面已改变，本人更新了依医战友的“图解BLAST引物验证教程”注：个人感觉一对引物设计出来，