胶质源性神经营养因子对脊髓损伤后功能及前角运动神经元酶组织化学改变的研究

1、胶质源性神经营养因子对脊髓损伤后功能及前角运动神经元酶组织化学改变的研究摘要目的探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对损伤脊髓运动功能及前角运动神经元酶组织化学改变的影响。方法改良Allen撞击致T13脊髓不完全损伤，蛛网膜下腔分别给予生理盐水和GDNF，不同时间分别：测定大鼠后肢神经功能；利用酶组织化学染色方法显示脊髓侧前角运动神经元中胆碱酯酶（ChE）和酸性磷酸酶（ACP）活性并通过计算机像分析系统将酶活性量化、比较。结果神经功能随时间延长而逐渐恢复，GDNF有助于功能恢复，但3周时均未达正常标准；ChE和ACP活性随时间延长而向正常趋近，GDNF显著加强了这一趋势；随着ChE水平上升

2、和ACP水平隆低，大鼠后肢运动功能逐渐恢复，两者呈现较强的相关性。结论前角运动神经元酶学改变与神经功能恢复密切相关；GDNF加强前角运动神经元酶学改变，呈现对损伤神经元有保护作用。关键词胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）；脊髓；创伤与损伤；胆碱酯酶（ChE）；酸性磷酸酶（ACP）；运动神经元Effects of GDNF to Enzyme Histochemical Changes on Anterior Horn Motor Neurons Following Incomplete Spinal Cord Injury in RatsSong Haital，Jia Lianshun，Ch

3、en Zheyu（Department of Orthopedics, Changzheng Hospital, Shanghai 200003）AbstractObjectiveTo investigate effects of GDNF to enzyme histochemical changes on anterior horm motor neurons following incomplete spinal cord injury in rats. MethodsAnimals were divided into three groups of normal contrast, N

4、S and GDNF were supplied through subarachnoid cavity after T13 segments of spinal cord were injured by modified Allens crush method, the specimen of spinal cord were taken at different time and sectioned. Enzyme histochemical technique of ACP and ChE was conducted. The activity of ACP and ChE at fro

5、nt corner motor neuron were quantized and compared applying image analysis of computer. ResultsFollowing incomplete spinal cord injury in rats, (1)Nerve function of lower limbs got gradual recovery as time going on, and GDNF enhanced this function progression, but it could not reach normal criteria

6、after 3 weeks;(2)The enzyme activity of ChE and ACP at front corner motor neuron tended to normal standard gradually and GDNF could strengthen obviously this trend;(3)As the level of ChE increasing and ACP decreasing of anterior horn neurons, behind limbs of injuried rats got revovered gradually, an

7、d there is strong correlation between the activity of ChE and ACP and rat motor function.Conclusion(1)Enzyme changes of spinal cord front horn motor neuron were correlated closely with motor function restore;(2)GDNF consolided this enzyme changes and indicated that GDNF plays a role in protecting th

8、e spinal cord motor neuron against injury.Key wordsGlial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF); Spinal cord; Trauma and injury; Cholinesterase; Acid phosphatase; Motor neuron大鼠脊髓不完全损伤后运动功能可有不同程度恢复，最近研究表明其恢复过程中前角运动神经元内胆碱酯酶（ChE）和酸性磷酸酶（ACP）活性变化有一定规律，并与运动功能恢复呈较强的相关性1。胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line-d

9、erived neurotrophic factor, GDNF)是近年来发现特异性最强的多巴胺能神经元营养因子，对感觉、运动神经元的存活起支持作用2。本实验通过建立大鼠改良Allens脊髓损伤模型，观察外源性GDNF对大鼠损伤脊髓前角运动神经元ChE及ACP活性动态变化的影响，并结合大鼠双下肢运动功能变化，以探讨GDNF对损伤运动神经元有否保护作用。1材料和方法1.1实验动物及分组SD雄性大鼠54只，200250g，随机分成3组：（1）对照组6只，仅作椎板打开，不损伤脊髓；（2）生理盐水（NS）组24只，脊髓损伤后经蛛网膜下腔微量注射器注入NS201；（3）GDNF组24只，同样经蛛网膜下腔

10、给予GDNF201（GDNF）纯度为1g/1，由第二军医大学神经生物研究所陈哲宇博士惠赠3）。NS组及 GDNF 组均分为1 d及1、2、3周四个时段组。1.2改良Allens脊髓损伤模型的建立40.3%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔麻醉，大鼠俯卧位固定于江湾I型立体定向仪上，手术暴露T12、T13、L1脊髓节段，以T13脊髓为损伤区，以脊髓后正中血管为中心，用自制的改良Allen装置致伤脊髓（致伤力为10g7.5 cm）。掌握撞击成功的标志为：大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩样扑动，双下肢呈驰缓性瘫痪。微量注射器抽取NS，在损伤区上下两端分别向蛛网膜下腔注射各缓慢注射101，注射时间不

11、短于10 min。GDNF组同样注射GDNF201。各组术毕均肌肉注射舒氨新10mg，动物麻醉复苏后温室隔离喂养，每2 d挤压或穿刺排尿一次，直至处死。1.3神经功能评定分别于脊髓损伤后1 d及1、2、3周测定每组大鼠后肢运动功能。采用改良Rivlin法5，将大鼠身体轴线与斜板纵轴垂直放置，斜板每次升高5，以大鼠能够停留5秒钟的最大角度为其功能值。1.4酶组织化学染色分别于神经功能评定后处死动物：1%戊巴比妥钠致死剂量腹腔麻醉，4%多聚甲醛、苦味酸混合液（4）经左心室灌注固定，脊髓标本后固定12 h，置于20%蔗糖PBS缓冲液中待其自然下沉。标本冰冻连续切片（厚25m），每切5片取2片，分别行

12、Waters-Butcher法染色显示ACP，Karnovsky-Roots法染色显示ChE，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片6。表1大鼠脊髓损伤后不同时间斜板实验（爬坡平均角度，S）伤后时间对照组NS组GDNF组1天73.332.2235.003.3334.172.781周74.172.7845.502.5053.502.502周75.002.5049.672.7862.404.163周74.404.1651.174.1669.673.33注：GDNF组与NS组比较P0.05；GDNF组与对照比较P0.05；NS组与对照组比较均P0.05）。2.2损伤区ChE活性变化正常大鼠脊髓前角大

13、、中型神经元ChE活性反应强烈，细胞轮廓清晰，核不着色，神经元酶阳性反应颗粒呈红褐色（1）。NS组术后7 d脊髓前角外侧核大、中型神经元ChE活性最低：染色与正常侧相比明显变淡（表现为MG值降低），阳性细胞数量减少（表现为ED值降低），核仁偏位，轮廊不清（2）；术后14 d ChE活性上升，阳性细胞增加，染色仍淡；术后21 d ChE活性最高，但未达正常值，阳性细胞仍少，染色仍明显淡于正常组。GDNF组术后7 d ChE活性降低之后开始升高，14 d 时染色淡于正常，细胞轮廊较清晰；21 d CHE活性接近正常（与对照组比较MG值P0.05），阳性细胞染色趋向正常，细胞形态正常，轮廓清晰。经比

14、较，术后7至21d GDNF组ChE含量大于NS组（表2）。1大鼠正常脊髓ChE染色Karnovsky-Roots法，1002大鼠脊髓损伤后7d ChE染色Karnovsky-Roots法，1002.3损伤区ACP活性变化正常脊髓前角大、中型神经元酶阳性反应颗粒细小，均匀分布于细胞质中，呈浅棕色，细胞核及核仁清晰可见（3）。NS组损伤后7 d脊髓前角大、中型神经元酶阳性反应颗粒ACP活性明显升高（表现为MG、ED值增加）：反应颗粒呈深棕黑色，细胞数量减少，核偏位（4）；术后14 d酶反应缓解，细胞数量仍少，酶反应呈较深棕色；21 d时神经元染色呈棕色，ACP活性仍高于对照组。GDNF组术后7

15、d ACP活性升高，前角大、中型神经元酶阳性反应颗粒呈深棕红色，细胞数量略减少；术后14 d酶反应缓解，酶反应呈棕色，术后21 d呈较浅棕色，ACP活性基本达到正常水平。经比较术后7至21 d GDNF组脊髓前角ACP阳性反应颗粒的MG和ED值明显低于NS组，说明ACP反应GDNF组明显弱于NS组（表3）。3正常脊髓ACP染色Waters-Butcher法，1004脊髓损伤后7d Acp染色Waters-Butcher法，100表2术后不同时间脊髓侧前角神经元ChE阳性颗粒MG和ED变化（像分析采用的二分割值为84）术后时间MGED（天）NSGDNFP值NSGDNFP值721.122.0425

16、.971.020.051424.451.2328.251.360.0118.101.8421.704.450.012125.521.4330.111.520.0119.543.4124.294.070.05注：正常对照组MG为32.430.49，ED为26.446.71。 表3术后不同时间脊髓侧前角神经元ACP阳性颗粒MG和ED变化术后时间MGED（天）NSGDNFP值NSGDNFP值743.271.4041.031.530.0535.974.9922.035.710.051442.601.5940.251.300.0529.975.8423.766.110.0528.165.7322.135

17、.340.05注：正常对照组MG为36.841.13，ED为20.312.64 3讨论3.1GDNF对脊髓损伤后功能的影响脊髓不完全损伤后呈现暂时性截瘫，随时间推移根据致伤量大小的不同，运动功能不同程度恢复。朱悦等报道脊髓不完全损伤（10g5 cm）后4周大鼠运动功能基本恢复正常8。本实验10g7.5 cm致伤力下脊髓立即出现功能障碍，随时间推移NS组运动功能呈逐渐恢复趋势，但3周时仍明显差于对照组；GDNF能够有效改善大鼠脊髓损伤后运动功能，在第2、3周均明显优于NS组，而且在损伤后3周恢复接近对照组。3.2ACP和ChE活性变化反映脊髓神经元损伤程度脊髓损伤后部分神经元因挫伤严重而死亡，断

18、而消失；部分存活者呈现不同程度的退行性变：胞核偏位、粗面内质网解聚、溶酶体增多及一些酶的活性发生变化。ChE主要定位于粗面内质网中，并与粗面内质网的结构完整和功能活性密切相关，它包括乙酰胆碱酯酶（AchE)和丁酰胆碱酯酶（BuChE)7,它的活性间接代表着对ChE的灭活作用，因而其在胆碱能神经元中的含量与乙酰胆碱的合成呈平行关系。脊髓损伤后神经元中ChE活性减弱提示粗面内质网数量减少及AchE含量减低、胆碱能神经的功能减弱。ACP是细胞内溶酶体的标记酶，其活性高低代表着溶酶体膜渗透性的高低；脊髓损伤后神经元中ACP活性增加表明溶酶体数量增加和功能活跃、膜渗透性增高，多种酶释放增加促进细胞器分解

19、，使神经细胞受损甚至死亡。因而，损伤神经元中ACP和ChE的活性反映了细胞损伤及退变程度。3.3GDNF对损伤脊髓前角运动神经元酶活性变化的影响脊髓损伤后侧前角大、中型神经元内ACP和ChE活性的变化过程及反应强度从酶学角度反映了神经元细胞受损伤的程度及其转归过程。本研究表明脊髓不完全损伤后1周前角运动神经元内ChE活性明显减弱，并随时间的延续而呈上升趋势；ACP活性明显增强，随时间延续而减弱，但3周时ChE及ACP活性距正常水平仍有较大差距。GDNF能有效抑制前角运动神经元内ChE活性的减弱和ACP活性的增强，其作用随时间延续而得到加强，2周时作用最强，3周时ChE及ACP活性接近正常水平，

20、体现了GDNF对损伤运动神经元具有保护作用。3.4损伤脊髓前角运动神经元酶活性变化与神经功能恢复的关系Nakamura1最近研究表明大鼠颈髓不完全损伤后前角运动神经元内乙酰胆碱转移酶（ChAT）活性变化与运动功能恢复具有较强的相关性，从而阐明脊髓前角运动神经元在脊髓运动功能恢复中所起的作用。本组结果表明大鼠脊髓损伤后ChE活性降低及ACP活性上升，并随时间推移而逐渐向正常水平接近，GDNF能有效促进这一过程，表现在GDNF比NS更明显增加ChE活性和减弱ACP活性；大鼠脊髓不完全损伤后双下肢运动功能障碍，伤后1 d最重，随时间推移运动功能逐渐出现恢复，GDNF组后肢功能恢复明显优于NS组，但仍

21、未达到正常水平。结果提示，随着损伤脊髓前角运动神经元酶水平向正常接近，大鼠后肢运动功能逐渐恢复，两者呈现较强的相关性。这一结果还表明脊髓前角运动神经元在脊髓不完全损伤运动功能恢复中起重要作用。3.5GDNF对运动神经元的作用及对可能机制GDNF为一种多效能的神经营养因子，最早（Lin,1993）2发现GDNF的功能是使体外培养的鼠胚中脑腹侧多巴胺（DA）能神经元存活延长。近几年研究证实GDNF对运动神经元也有明显的助存活、促分化及增强代谢的功能9；一些实验还表明GDNF对运动神经元有显著的修复功能：切断新生鼠脊髓运动神经元，可使脊髓中40%50%相应运动神经元死亡，存活者也呈现萎缩；在断端加入

22、GDNF则可有效阻止神经元死亡和萎缩，存活神经元胞体还有一定程度增大10。目前关于NTF对神经元营养的主要机制有（1）维持细胞内Ca2+稳定；（2）减少自由基的损伤；（3）延缓细胞凋亡；（4）促进细胞功能恢复11。我们的另一项研究表明，GDNF在继发性脊髓损伤过程中可能通过减少神经细胞内Ca2+积聚、缓解组织肿胀、减轻脊髓组织缺血性损伤，对脊髓损伤起保护作用（另文发表）。因而，进一步探讨GDNF作用机理，对了解神经元发育及损伤机制具有十分重要的意义。本工作受国家重点基础研究规划：脑功能和脑重大疾病的基础研究项目资助(基金编号G1999054000)宋海涛（第二军医大学附属长征医院上海市2000

23、03）贾连顺（第二军医大学附属长征医院上海市200003）陈哲宇（第二军医大学基础部神经生物教研室）路长林（第二军医大学基础部神经生物教研室）参考文献1，Nakamura M, Fujimura Y, Yato Y, et al. Changes in choline acetyltransferase activity and distribution following incomplete cervical spinal cord injury in the rat. Neuroscience, 1996,75:4812，Lin HL, Doherty DH, Lile DJ, et al. GDNF: A glial cell-line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.Science,1993,260:1130323，陈哲宇，何成，王成海 等.人及大鼠胶质细胞源性神经营养因子cDNA的克隆与表达.第二军医大学学报，1998，19（1）：17194，Black P, Markowitz RS, D