经皮神经电刺激治疗自发性高血压大鼠的实验研究

1、中图分类号:R89;R36;R39 硕士学位论文经皮神经电刺激治疗自发性高血压大鼠的实验研究院(系、所临床医学院研究生姓名钟冬胜学科、专业外科学导师姓名杨福兵教授二一二年四月目录1 经皮神经电刺激治疗自发性高血压大鼠的实验研究 (11.1 中文摘要 (11.2 英文摘要 (41.3 前言 (81.4 1.5 1.6 材料与方法 (13结果 (19讨论 (341.7 结论 (391.8 参考文献 (411.9 英汉缩略词对照表 (462 致谢 (473 孤束核调节动脉血压机制的研究进展(综述 (48经皮神经电刺激治疗自发性高血压大鼠的实验研究摘要目的:神经源性高血压是原发性高血压的主要发病形式,

2、针对神经源性高血压的治疗手段单一,药物治疗容易出现血压波动,需要终身服药。通过经皮神经电刺激治疗自发性高血压大鼠,研究神经血管信号传导途径及机制。探讨经皮神经电刺激治疗神经源性高血压的理论基础,为物理治疗高血压寻找新的实验理论与依据。方法:以自发性高血压大鼠为研究对象,并设置正常血压的WKY大鼠做对照研究,建立合适的电刺激治疗参数模型,电刺激具体参数为:电压20V、刺激频率200Hz,波宽<0.1ms,刺激波形为正负双向lilly波形。采用无创大鼠尾套动脉血压检测、记录包括收缩压、舒张压、平均动脉压和心率等主要血压指标的动态变化。采用放射免疫技术检测AII浓度,利用免疫竞争机制原理,使1

3、25I-SI- AngII与血浆中AII产生免疫竞争反应,免疫分离剂分离血浆中结合部分AII与游离部分AII,测定结合部分AII的放射性强度。采用直接离子选择电极法检测治疗前后大鼠血循环内钠离子的浓度,分析血清钠浓度对降压效果的影响。研究经皮神经电刺激对高血压大鼠心血管中枢形态及功能的变化,通过HE染色观察神经元细胞的核分裂相及蛋白质合成功能。运用放射免疫自显影技术,分析结合碘的光密度/面积比值,研究孤束核区血管紧张素II受体1表达水平与动脉血压的关系。结果:经皮神经电刺激治疗自发性高血压大鼠(SHR组,治疗前后动脉血压有明显降低,P<0.05;与喂饲缬沙坦治疗SHR组比较降压效果无显著

4、性差异,P>0.05;经皮神经电刺激治疗自发性高血压大鼠降压效果较药物组缓和、稳定;经皮神电刺激对正常血压WKY大鼠组无明显降血压效果,WKY大鼠治疗前后动脉血压比较P>0.05,差异无显著性;所有实验样本均未观察到低血压的情况。各实验组大鼠心率、体重、血清钠离子浓度在治疗前后无显著性差异,P>0.05;血浆血管紧张素II(AII浓度与动脉血压无直接联系,喂饲缬沙坦自发性高血压大鼠组血浆血管紧张素II浓度明显升高,治疗前后比较,P<0.05,有显著性差异,经皮神经电刺激自发性高血压大鼠组、空白对照组、经皮神经电刺激WKY大鼠组治疗前后比较血管紧张素II浓度差异无显著性,

5、P>0.05;自发性高血压大鼠的血管紧张素II浓度较WKY大鼠高,P<0.05,差异有统计学意义;经皮神经电刺激治疗SHR大鼠组孤束核异染色质神经元细胞计数与药物组比较P>0.05,无显著性差异,与空白对照组及WKY大鼠组比较P<0.05,差异显著;血管紧张素II受体1放免自显影提示SHR空白对照组碘结合率最高,经皮神经电刺激SHR组与药物对照组无显著性差异P>0.05;经皮神经电刺激WKY大鼠组碘结合率最低,P<0.05,有显著性差异。结论:本研究通过经皮神经电刺激治疗自发性高血压大鼠,获得与喂饲缬沙坦治疗自发性高血压大鼠相似的降压效果,主要表现在收缩压和

6、舒张压的显著性降低。电刺激治疗组与空白对照组比较动脉血压差异明显。通过观察孤束核区神经元细胞形态和功能的变化,及血管紧张素II受体1表达的放免自显影实验,证实经皮神经电刺激治疗能够改善SHR大鼠的心血管中枢自稳状态,恢复动脉血压调定点的正常水平,调节自主神经功能,使动脉血压恢复正常。关键词:经皮神经电刺激高血压孤束核大鼠血管紧张素II Experimental Study on the Treatment of Spontaneously Hypertensive rats by Transcutaneous Electrical Nerve StimulationAbstract:Bject

7、ive: Neurogenic hypertension is the major morbidity in the form of essential hypertension.Single treatment of neurogenic hypertension, drug therapy is prone to fluctuations in blood pressure, and the need for lifelong medication. By transcutaneous electrical nerve stimulation in the treatment of spo

8、ntaneously hypertensive rats to study the signal transduction pathway and mechanism of neurovascular. Explore the theoretical basis for the treatment of neurogenic hypertension, transcutaneous electrical nerve stimulation and to find a new experimental theory and basis for the physical treatment of

9、hypertension.Methods :In this study, spontaneously hypertensive rats(SHRas the object of study,WKY rats were used as the comparative experiment.Appropriate electrical stimulation therapy parameter model, electrical stimulation of specific parameters: voltage 20V, the stimulation frequency 200Hz, pul

10、se width <0.1ms stimulus waveform Lilly waveform.We use non-invasive rat tail cuff arterial blood pressure monitoring records, including the dynamic changes of the arterial systolic blood pressure(SBP, arterial diastolic blood pressure(DBP, mean arterial blood pressure(MBP and heart rate(HR.Using

11、 radioimmunoassay (RIA detection of plasma angiotensin II concentration changes.According to the principle of the immune mechanism of competition, the angiotensin II antibody iodine combination of matter and plasma angiotensin II immune competition reactions, and immune separation agent will combine

12、 part of the free part of the separation, determination of the binding portion of the radioactivity.Using direct ion-selective electrode assay before and after treatmentthe concentration of sodium in the blood circulation of rats, analysis of serum sodium concentration of the antihypertensive effect

13、.The study of transcutaneous electrical nerve stimulation on changes in morphology and function of the SHR cardiovascular center, mitotic activity and protein synthesis observed solitary tract nucleus(NTS neurons by hematoxylin eosin(HE staining.Using radioimmunoassay imaging techniques, analysis io

14、dine optical density / area ratio(Iod/Area of the 125I-sarcosine1 isoleucine8-Angiotensin II recptor1(125I-SI-AngII. the study of the solitary tract nucleus area of angiotensin II receptor expression levels and changes in blood pressure between dialectical contact.Results: Transcutaneous electrical

15、nerve stimulation group treatment of spontaneously hypertensive rats(shrTENS before and after treatment of the arterial blood pressure decreased significantly (P <0.05. ShrTENS with the feeding of valsartan spontaneous hypertensive rats(drug compared the antihypertensive effect, no significant di

16、fference (P> 0.05.Transcutaneous electrical nerve stimulation treatment of the hypertensive effect than the drug group relaxation and stability;.Transcutaneous electrical nerve stimulation no significant blood pressure lowering effect on normal blood pressure in Wistar Tyoto rats group(wkyTENS, a

17、rterial blood pressure in WKY rats before treatment and after treatment (P> 0.05, no significant difference.All experimental samples was not observed in the case of low blood pressure.Each experimental group rat's heart rate, body weight, serum sodium concentration before treatment and after

18、treatment showed no significant difference (P <0.05.No direct contact with plasma angiotensin II(AII concentration and arterial blood pressure, feeding valsartan in spontaneously hypertensive rats plasmaangiotensin II concentrations were significantly increased before treatment and after treatmen

19、t (P <0.05, there are significant differences.Analysis of shortens,control,wkyTENS before treatment and after treatment of angiotensin II concentration was no significant difference (P> 0.05.Concentration of angiotensin II of SHR more than in WKY angiotensin II at concentrations (P <0.05 di

20、fference was statistically.Heterochromatin in neurons of the the comparison shrTENS the NTS cell count heterochromatin neurons of the NTS with drug counts, P> 0.05, no significant difference, Heterochromatin in neurons of the the comparison shrTENS the NTS cell count heterochromatin neurons of th

21、e NTS with drug counts, P> 0.05, no significant difference, comparison shorTENS with control group and wkyTENS, P <0.05, difference significant.Analysis of angiotensin II receptor 1 an RIA prompt blank self-developing Iod/Area ratio in the control group the iodine binding rate is the highest.C

22、omparison of shrTENS group and the drug control group no significant differences P> 0.05.WkyTENS group iodine combined with the lowest rate, P <0.05, there are significant differences.In this study, treatment of spontaneously hypertensive rats by transcutaneous electrical nerve stimulation, th

23、e treatment of spontaneously hypertensive rats fed with valsartan antihypertensive effect, mainly in the systolic and diastolic blood pressure significantly decreased. Electrical stimulation treatment group and the control group arterial blood pressure significantly different.Changes in the observed

24、 solitary tract nucleus neurons in cell morphology and function, and angiotensin II receptor expression in a radioimmunoassay autoradiography experiments confirmed transcutaneous electrical nerve stimulation therapy can improve the cardiovascularcenter of the SHR, since steady staterestore normal le

25、vels of arterial blood pressure set point, regulation of autonomic nervous function, arterial blood pressure returned to normal.Key Words: transcutaneous electrical nerve stimulation;solitary tract nucleus; hypertension;rat;Angiotensin II;前言我国心脑血管病的主要危险因素是高血压,近年来随着人口老龄化、环境及生活行为的改变导致高血压患病率持续增加,根据2010

26、年中国高血压防治指南的数据估计目前部分省市成人患病率达25%左右,据不完全统计全国至少有2亿高血压病患者。我国与高血压相关的心脑血管疾病死亡患者占总死亡人数的40%,70%的脑卒中和50%的心肌梗死的发病与高血压有关,我国每年用于高血压的医疗费达数百亿元,且高血压的并发症(脑卒中、心脏病及肾脏病等严重危害我国居民健康, 因此高血压成为我国重大公共卫生问题1。95%以上的高血压为原发性高血压,其致病原因十分复杂,神经系统功能紊乱引起的神经源性高血压是原发性高血压的主要形式2。药物治疗是高血压治疗的主要手段,大多数高血压患者需 2 种或2 种以上的降压药方可达到目标血压。上世纪80年代以来高血压的

27、诊断和治疗方法飞速发展,世界卫生组织推荐六大类抗高血压药物:利尿剂、钙拮抗剂(CCB、受体阻滞剂、1受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI、血管紧张素受体拮抗剂(ARB;但高血压的控制率仍然不令人满意,尤其缺乏针对神经源性高血压的治疗药物,目前主要的降血压药物不能根本改善神经系统的功能,并容易导致血压波动,且需终身服药。由于高血压的病因较为复杂,加之药物治疗的副作用与耐药问题,中国高血压的达标率仍然很低。长期的高血压会导致心脏、脑、肾等重要器官的损伤,从而造成脑卒中、心肌梗死、肾功能衰竭等严重后果。即使在发达国家如美国,其血压达标率也仅为34%3,而在2005年中国高血压防治指南的数据显

28、示我国人群高血压控制率仅为6.1%4。高血压防治任务艰巨。电刺激的定义是对生物体兴奋组织上施加特定波形和频率的电流、电压或电场,使呈现静息电位的“可兴奋细胞”通过电化学活动产生动作电位,发挥各种生理效应5。电刺激治疗可以纠正神经系统对恶性刺激产生的不良反射,使已经产生功能障碍的器官恢复正常状态。作为一种有效的治疗方法,在临床实践中越来越受到医学界的重视,尤其在神经系统疾病治疗方面,达到了其他外科手术或内科药物治疗不可替代的作用,同时避免了药物治疗带来的毒副反应和手术治疗产生的痛苦和创伤。低频脉冲电流的重要作用是能够兴奋神经组织,而哺乳动物运动神经的绝对不应期多在0.51ms左右,采用低于200

29、Hz的低脉冲电流既能达到治疗目的,又不会引起器官和组织的病理损害。10200Hz特别是100Hz左右的频率可以阻断恶性神经刺激信号的传导,产生镇痛和镇静中枢神经的作用。对于植物神经, 4-10Hz的频率可以兴奋交感神经;2040Hz可以兴奋迷走神经6。电刺激治疗必须克服高电阻率的皮肤而达到刺激深层组织的目的,这就要求在治疗中采用的电刺激频率往往比理论值要大7,高选择性的电流强度和频率在满足疗效的同时使病人易于接受、感觉舒适而又不损伤周围组织。颈动脉窦是颈总动脉末端和颈内动脉起始处的膨大部分,有血管壁牵张感受器,能感受血压的变化,压力感受器对搏动性的压力变化比非搏动性的压力变化更敏感。颈动脉窦压

30、力感受性反射(Carotid sinus baroreceptor reflex是动脉血压在生理范围内波动时最敏感的压力调节性反射,对维持动脉血压稳定有非常重要的意义8-9。血压随着生理状况和环境变化而不断波动以适应机体生理功能的需要,利用颈动脉窦压力反射调节血压可能是高血压非药物治疗的新途径。有文献表明,原发性高血压患者常表现为肾上腺素活性过强,而压力感受器反射与去甲肾上腺素(NE呈显著负相关,压力反射的损害所介导的交感活性增加有可能是原发性高血压的发病机制之一10。因此,人为对压力感受器施加电刺激,改变压力感受器的敏感度,抑制交感神经活性,可反射性地起到降低血压的作用。颈动脉窦压力感受器是

31、血压调节反射的基本途径,神经信号通过舌咽神经和迷走神经上传入中枢,大量研究发现压力感受器主要与血压的急性调节有关11。颈动脉窦电刺激可以使顽固性高血压的舒张压、收缩压、心率和肌肉交感神经活性下降,心率变异性与心率波动无明显变化,交感神经活性降低而副交感神经活性增加,显著提高压力反射敏感度(baroreflex sensitivity,BRS,降低去甲肾上腺素和肾素水平12,并对压力反射调节无负效应13。近年来有研究报道证明采用植入式电刺激装置治疗心血管系统疾病,是一个安全有效的治疗途径,利用颈动脉窦血压感受器反射调节机制,给予适宜的电流强度、频率和脉冲宽度,兴奋颈动脉窦压力感受器,启动血压的中

32、枢神经反馈调节系统14,国外有报道利用罗氏颈动脉窦压力感受器刺激系统治疗难治性高血压已得到良好的疗效,目前该系统已在欧洲、美国多地9个中心进行大量的临床试验,随访2年的患者中,26%的患者收缩压降至140mmHg以下15,16,17。国内尚无电刺激颈动脉窦压力感受器治疗高血压的实验研究。赖新生等人总结中医的针灸与穴位原理,采用电针和针刺技术,探索高血压治疗的疗效与机理。用针刺人迎穴(颈动脉窦附近的方法治疗原发性高血压患者,效果理想18,19。研究表明利用植入式刺激系统刺激颈动脉窦压力感受器可降低顽固性高血压患者的血压值,但其最大的缺点是使用寿命的限制,电能耗尽后必须通过外科手术进行更换。而且电

33、极植入会影响舌下神经,出现声音嘶哑和吞咽不适的症状,并伴有排斥反应和局部刺激症状,如咽喉瘙痒、咳嗽、疼痛、炎症等以及引起心动过缓等副反应20。我们采用经皮神经电刺激疗法(Transcuta neouselectrical nerve stimulation, TENS治疗自发性高血压大鼠,是一种替代植入式神经电刺激创新性的实验方案,经皮神经电刺激刺激颈动脉窦,利用神经细胞对电刺激的响应来传递外加的人工控制信号。将特定的低频脉冲电流通过皮肤输入大鼠颈动脉窦,兴奋颈动脉窦血压感受器,通过舌咽神经及迷走神经的兴奋激活血压反馈调节机制;促使血压调节中枢神经细胞产生与自然激发引起的动作电位完全一致的神经

34、冲动,影响神经细胞血压相关受体、激素的表达,并重塑神经传导通路。同时抑制交感神经系统的活性,兴奋副交感神经系统,降低血压调节中枢血管紧张素II受体1的表达,影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统代谢水平。TENS无需植入电极,具有无创性、无痛苦,使用方便、安全、适应证广泛、不受人群限制等优点。通过大量的实验寻找压力感受器参与血压调节的证据,观察经皮电刺激颈动脉窦对血压性调节作用,明确经皮电刺激疗法治疗高血压(尤其是神经源性高血压的治疗效果,建立经皮电刺激颈动脉窦治疗高血压的最优治疗方案,并通过多种检测手段探讨此方法的治疗机制,为更加全面地了解生物体的血压调节系统提供实验支持,为开拓高血压的临床非药物

35、治疗新方法提供理论依据。材料与方法1 实验材料与仪器1.1 实验动物:采用清洁级10周龄雄性自发性高血压大鼠近交系(spontaneously hypertensive rats SHRNCrlVr45只,合格证号NO.110312,自发性高血压大鼠的血压标准为180/120mmHg。清洁级同龄正常血压(150-110mmHg/120-80mmHg的雄性Wistar-Kyoto大鼠(WKY15只,合格证号NO.110365,上述实验动物均由泸州医学院实验动物中心提供,生产许可证号SCXK (川2008-17。实验大鼠体重控制在250+10g之间,实验动物从业人员资格证号:川实动管2010年(1

36、139。1.1.1 实验动物饲养及管理:安静单笼饲养,温度在21+2,湿度在30%-70%,12小时昼夜节律,光照8:00时-20:00时。饲养时间为21天,喂食本校动物中心条状颗粒饲料(含蛋白23%,脂肪4.7%,钠盐0.24%,动物进入实验平台饲养7天,适应环境后开始实验,疗程14天,治疗结束后采用20%氨基甲酸乙酯(1.4g /kg腹腔麻醉,心脏灌注冰生理盐水处死实验大鼠,并采集延髓标本。实验过程中尽量减少动物痛苦和不适,处置措施符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的关于善待实验动物的指导性意见标准21。2 主要实验试剂2.1 主要试剂配制0.01M PBs溶液NaCl8.09,K

37、Cl 0.209,Na2HP04.12H203.492g,KH2P04 0.20g,溶于900ml三蒸水中,然后定容至1000m1,再调PH值至7.40,放置4o C保存备用。0.1M PBs溶液:溶质浓度为上述PBS溶液的lO倍,配法同上。4%多聚甲醛:多聚甲醛40g加入900ml O.1M PBS溶液中,加热至60度,边加热边搅拌,同时用lN NaoH滴定至多聚甲醛完全溶解,过滤后定容至1000ml,并调PH值至7.4,常温保存备用。AM5 buffer:150mM NaCl,5mM EDTA,0.1mM 杆菌肽,50mM磷酸钠缓冲液。EDTANa2抗凝液:8-羟基喹10ul/ml,二巯基

38、丙醇5ul/ml,10%EDTANa215ul/ml。2.2主要购买的试剂缬沙坦瑞士诺华公司氨基甲酸乙酯北京化学试剂公司血浆血管紧张素II放免试剂盒北京福瑞生物工程公司125I-SI AngII 北京福瑞生物工程公司AT2受体阻断剂(PD123319北京福瑞生物工程公司3 主要实验仪器BP-6 动物无创血压测试仪成都泰盟科技有限公司大鼠经皮神经电刺激仪清华大学医学物理研究室赠送Kodak Biomax MR-1 生物显影仪柯达公司光学显微镜日本奥林巴斯公司DeltaGB 303电子分析天平宁波普瑞斯电子有限公司电热干烘箱南京方欧机械设备有限公司IMS一972电解质分析仪常州锐品精密仪器有限公司

39、4低温冰箱日本SANYO公司-20低温冰箱日本SANYO公司实验室专用制冰机XBJ-50 广州柯尼塔电器有限公司恒温冰冻切片机泸州医学院附属医院中心实验室Delta 320 PH计瑞士梅特勒-托利多公司0.52.5ul移液器德国Brand公司1810AC型石英自动双重纯水蒸馏器西安明克斯公司C-MAGHS7磁力搅拌器上海翼悾机电有限公司F-2008P3-放射免疫计数器西安核仪器厂电热恒温水槽恒仪器设备有限公司4 实验方法4.1 实验分组:SHR大鼠随机分为3组,每组15只,第1组为SHR大鼠经皮神经电刺激治疗组(shrTENS,第2组为SHR大鼠空白对照组(control,第3组为喂饲血管紧张

40、素受体拮抗药物缬沙坦对照组(drug。第4组为正常血压WKY大鼠电刺激治疗对照组(wkyTENS。4.2 实验动物药物喂饲:喂饲剂量采用公斤体重计算公式:Db =Da·Sa·Rab·Sb。D b 为所求大鼠的缬沙坦公斤体重剂量,Da为人的缬沙坦公斤体重剂量,Rab为大鼠与人的换算系数0.162,Sa 和Sb是非标准体重动物的校正系数,标准体重的大鼠其校正系数默认为122。晨间通过大鼠自由饮水喂饲药物一次,将每只大鼠的缬沙坦服用剂量8mg/kg/日溶解于装有10mL纯净水的饮水瓶中,缬沙坦溶解液饮完后,再补充每日剩余的饮水量(大鼠每日饮水量1012mL/100g。4

41、.3 电刺激实验设计:SHR电刺激治疗实验组、空白对照组和WKY电刺激对照组大鼠均用脱毛膏脱去双侧颈部体毛,实验前5分钟用生理盐水清洗皮肤后,涂抹电解液(见图1,图2。空白对照组大鼠颈部带电极与电极线进入电刺激笼,模拟电刺激治疗组相同的环境与时程,不做电流刺激。经皮神经电刺激仪为清华大学医学院医学物理研究室研制(见图3,刺激电极由导线联结的两个直径为1.0x1.5cm 的长方形电极组成,置于两侧颈部。采用正负双向电流脉冲波lilly 波形(见图 4正负脉冲之间有一个延迟时间,可有效减少电流对血管、肌肉等局部组织的伤害性刺激。刺激电压20V、刺激频率200Hz,波宽<0.1ms,刺激强度为

42、能感知电极片搏动,而不会导致皮肤振颤及不适23。治疗时动物保持清醒,安静,空腹,环境温度维持在25.0o C,每日8时做电刺激治疗1次,治疗时程30分钟。 图1皮肤处理图2 电极部位 图3 经皮神经电刺激仪图4 lilly刺激波形图4.4 实验动物无创血压检测:采用大鼠尾套无创测血压法监测血压,大鼠置入避光、通气、内壁带网的恒温电刺激鼠笼内,于鼠尾根部套上血压套(见图5。适应20min左右使其情绪稳定后开始检测血压,测血压时鼠笼温度升到35o C,尾动脉充分扩张后开始加气。加气时间间隔2min,保气时间8s,待阻断后的大鼠尾动脉血管充分扩张后,再开始下次加气,尾套压力感受器的灵敏度设置为4,通

43、过监测尾动脉压力得到大鼠血压变化图(见图6。治疗前检测基础血压3次,电刺激治疗时每10分钟测血压一次,治疗后10分钟测血压3次,取平均值。大鼠血压的分级:高血压为大于或等于180/120mmHg ;临界高血压为小于180/120mmHg、大于或等于150/120 mmHg;正常血压为小于150/120 mmHg大于或等于110/80mmHg;低血压为小于110/80mmHg(平均动脉压小于50mmHg24。 图5 动物无创血压测试仪图6 鼠尾血压套压力变化图。4.5放射免疫检测血浆血管紧张素II水平:采用免疫竞争原理,将结合碘125的血管紧张素特异性抗体(125I-AII与血浆样品中的AII产

44、生竞争性免疫反应, 125I-AII的抗体结合量与样品中AII的含量呈一定的函数关系。按照试剂盒操作步骤,用免疫分离剂将结合部分AII与游离部分AII分离,测定结合部分AII的放射性强度,并计算相应结合率。用已知标准AII含量与对应结合率作图,得到标准抑制曲线,从标准曲线上查知对应结合率的血浆样品中AII的含量。每个样本均作双管测定,取平均值,结果以(pg/mL血浆表示,试剂盒的灵敏度为10pg /mL。测定步骤见表1:表1 操作程序表单位l 4.6血清钠离子检测:采用直接离子选择电极法(ion selectiveelectrode,ISE,ISE仪器上装有含玻璃膜的钠电极,检测有样本的电极表

45、面电位的改变,与参比电极电位变化的差值大小来估计样本中含量,分析系统参照钠离子的标准值,作为计算因素储存在微处理器记忆中,用作未知浓度样本的计算。4.7 孤束核放射免疫自显影实验:实验在具有完善的辐射防护环境下操作,取出保存1周的切片,室温下复温,加入含有AM5 buffer液的预孵箱中30分钟,再加入80PM-1900PM的碘125血管紧张素显影剂(125I-SI AngII和10M AT2受体阻断剂(PD123319,继续孵育2小时,取出切片用双蒸水冲洗2次,AM5 buffer液中浸泡1分钟后,双蒸水冲洗2次,置于含干燥剂的暗盒中,风干切片,标号。4条件下曝光24小时,用柯达生物影像仪拍

46、片25,26。4.8 HE染色:切片组织经低到高浓度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡包埋,切片,片厚5um,贴片后入45o C恒温箱烘干,苏木精水溶液染色5分钟,盐酸及氨水分色8秒,流水冲洗1小时,分别用70%和90%酒精脱水10分钟,伊红染色3分钟, 90%酒精脱水10分钟,二甲苯透明,滴加拿大树胶盖上盖玻片封片,常温、流通空气环境下干燥后标号。4.9 灌注固定和取材:4.9.1延髓组织:用20%氨基甲酸乙酯(1.4g/kg腹腔注射麻醉,麻醉满意后开胸,剪开右心耳,经心脏左心室做小切口,置入灌洗管至主动脉根,先用200ml冰生理盐水快速灌注至流出液清亮后,迅速取脑,冰冻切片。孤束核平面连续恒冷冠状

47、切片,片厚20um,每6片取一张做放射免疫自显影实验,明胶封片,烘干-20O C恒温冰箱中保存。另5张切片组织放入4%多聚甲醛溶液中固定6h,再浸入30%的蔗糖0.1MPBS(pH7.2中,沉底4过夜做HE染色。4.9.2血浆标本:分别于治疗前、治疗第1周、治疗第2周,采集清晨空腹大鼠尾静脉血。用于血浆血管紧张素II和血清钠离子的检测。鼠笼固定大鼠,清洁消毒鼠尾,电吹热风使尾静脉充盈,4号针头(0.21mm穿刺,一次性采集6mL静脉血。其中1mL即时检测血清钠离子;5mL作为检测血管紧张素II的样本注入到带盖酶抑制剂抗凝管中,避光、封好管口上下颠倒数次混匀,恒温4o C、2500转/分,离心7

48、分钟,分离血浆-20恒稳冰箱保存、待测。4.9 数据统计处理:采用Image Pro P1us6.0专业图形分析软件对图像进行累积光密度(IOD SUM和孤束核组织面积的测量,测量前先进行标尺和光密度的校正每张图片上显影结合碘的平均光密度(averageoptical density可由IOD/ Area 比值得到。采用SPSS13.0 for Windows统计分析软件包及Excel for Windows进行统计和图形处理,以上数据均以X +S表示,分别采用t检验、卡方分析、单因素方差分析、重复测量方差分析进行数据差异分析,以P<0.05作为检验水准。结果1.大鼠降压实验:采集各组大

49、鼠收缩压、舒张压和心率的实验数据,并分别作统计分析。第1组为经皮神经电刺激自发性高血压大鼠(shrTENS,第2组为自发性高血压大鼠空白组(control,第3组为自发性高血压大鼠喂饲缬沙坦组(drug,第4组为经皮神经电刺激Wistar大鼠对照组(wkyTENS。以治疗前2011年4月26日,治疗1周2011年5月2日,治疗2周2011年5月9日为时间点,分别对收缩压(SBP、舒张压(MBP、心率(HR、平均动脉压(DBP等主要的血压指标进行统计分析。1.1收缩压:自发性高血压大鼠治疗结束后,采用重复测量方差分析方法研究4组不同处理方法大鼠SBP的差异,统计数据描述如表2:4组大鼠总样本差F

50、=2.585,P<0.05,差别有显著性。组内变量和组间变量交互作用分析,方差齐性检验P<0.05 ,提示方差不齐,球形检验不对称,需选择多元方差分析;采用两两比较方差分析,不假定相等方差,Dunnett,sT3选项,结果如表3:第1组和第3组之间P=0.819,P>0.05差别无统计学意义;其他组间两两比较P<0.05,差别有显著性。组内各时间点SBP变化采用单因素方差分析,结果见SBP均值条形图(图7:第1组降压效果明显,F=84.171,P<0.05有显著性差异;第2组SBP一直维持高水平F=0.004,P=0.996,无统计学差异;第3组F=140.118

51、,P=0.00,有显著性差异;第4组SBP稳定正常,未见低血压出现,F=0.68,P=0.514,无统计学差异。表2 SBP统计描述mm/Hg X+ S Date 1=shrTENS,2=control,3=drug,4=wkyTENSN Mean Std.Deviation2011/4/26 1.00 12 205.1667 8.110972.00 12 197.2500 6.422623.00 12 206.0238 5.933094.00 12 139.16675.02418Total 48 186.9018 28.75506 2011/5/2 1.00 12 179.5417 7.37

52、7662.00 12 194.7917 7.518033.00 12 186.0583 8.902244.00 12 139.0417 4.81219Total 48 174.8583 22.72756 2011/5/9 1.00 12 139.0833 12.844942.00 12 196.37503.269173.00 12 142.5417 20.037984.00 12 136.50005.23537Total 48 153.6250 27.71905表3:SBP重复测量方差分析Multiple ComparisonsMeasure: MEASURE_1Dunnett T3(I1=s

53、hrTENS,2=control,3=drug, 4=wkyTENS (J1=shrTENS,2=control,3=drug,4=wkyTENSMeanDifference(I-JStd.ErrorSig. 95% Confidence IntervalLower UpperBound Bound1.002.00 -21.5417(* 1.92004 .000 -27.1787 -15.90463.00 -3.6107 3.15678 .819 -12.8381 5.61674.00 36.3611(* 1.83997 .000 30.8860 41.83622.00 1.00 21.541

54、7(* 1.92004 .000 15.9046 27.17873.00 17.9310(* 2.85124 .000 9.2944 26.56764.00 57.9028(* 1.24490 .000 54.3157 61.4899 3.00 1.00 3.6107 3.15678 .819 -5.6167 12.83812.00 -17.9310(* 2.85124 .000 -26.5676 -9.29444.00 39.9718(* 2.79794 .000 31.4123 48.5314 4.00 1.00 -36.3611(* 1.83997 .000 -41.8362 -30.8

55、8602.00 -57.9028(* 1.24490 .000 -61.4899 -54.3157 Based on observed means.* The mean difference is significant at the .05 level.图7 SBP 血压均值图1.2 舒张压(DBP:采用重复测量方差分析方法研究4组不同处理方法大鼠DBP 的差异数据描述见表4:总样本差F=1.747,P=0.026,差异有显著性。组内变量和组间变量交互作用分析,方差齐性检验P<0.05 ,方差不齐,球形检验对称;选择两两比较方差分析,不假定相等方差Dunnett,sT3选项,结果如表5

56、:第1组和第3组之间P值为0.989,P>0.05差别无统计学意义;其他组间两两比较P<0.05,差别有显著性。组内各时间点舒张压变化采用单因素方差分析,结果见舒张压均值条形图(图8:第1组F=92.231,P=0.00 有显著性差异;第2组DBP一直维持高水平F=1.195 ,P=0.316,无统计学差异;第3组F=178.991, P=0.00,有显著性差异;第4组F=1.749,P=0.19,无统计学差异。各组实验样本SBP与DBP变化表现为一致性。表4 DBP统计描述mmHg X+ S Date 1=shrTENS,2=control,N Mean Std.Deviatio

57、n 3=drug,4=wkyTENS2011/4/26 1.00 12 167.5833 7.609302.00 12 173.4167 5.160313.00 12 178.4167 6.316764.00 12 91.7500 9.39173Total 48 152.7917 36.513452011/5/2 1.00 12 149.3250 9.705402.00 12 168.1250 10.063723.00 12 142.7083 9.475954.00 12 86.0833 6.41317Total 48 136.5604 32.13344 2011/5/9 1.00 12 10

58、2.1667 17.107062.00 12 170.5833 9.132443.00 12 91.8333 15.846334.00 12 87.8333 6.63097Total 48 113.1042 36.19009 表5 DBP重复测量方差分析Multiple ComparisonsMeasure: MEASURE_1Dunnett T3(I1=shrTENS, 2=control,3=drug, 4=wkyTENS (J1=shrTENS,2=control,3=drug,4=wkyTENSMeanDifference(I-JStd.ErrorSig. 95%Confidence IntervalLower UpperBound Bound1.002.00 -31.0167(* 2.96140 .000 -39.6337