培养基血清浓度对人表皮干细胞增殖分化的影响

1、培养基血清浓度对人表皮干细胞增殖分化的影响南京大学医学院附属鼓楼医院 李云剑 林 樾 燕 辛 周宏礽 谭 谦【摘要】目的:比较不同血清浓度培养体系对表皮干细胞增殖分化的影响。方法: 采用两步酶消化法和型胶原差速贴壁相结合的方法获得人原代表皮干细胞,分别以0、5、10、15和20血清浓度的培养基在96孔板中进行培养。观察表皮干细胞形态，克隆形成及增殖的情况，应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活和生长情况,分析量效和时效关系；持续传代培养细胞，每次传代的同时取适量细胞，用免疫细胞化学的方法进行表皮干细胞和表皮细胞相应标志物（K19、K14和K10）的测定。结果：表皮干细胞在各种血清浓

2、度的培养基内均能形成克隆，增殖良好。用四甲基偶氮唑蓝(MTT) 比色法测定，所得相同时间点各组OD值在统计学上没有差异（P0.05），表皮干细胞生长速度各组间无差异。第1代表皮干细胞K19均有表达，而K14和K10表达均为阴性；其后高血清浓度（15、20）培养基中细胞较低血清浓度（0、5）先出现K14、K10蛋白的表达；培养至第10代是各组细胞均出现K10高表达，而K19、K14表达阴性。结论:在低血清浓度(0、5)的培养基中表皮干细胞生长良好，且能够相对较好保持表皮干细胞的特性。【关键词】 表皮干细胞 血清浓度 增殖分化 培养【Abstract】 Objective To study the

3、 proliferation and differentiation of epidermal stem cells in medium with different level of serum. Methods to obtain the primary epidermal stem cell with two step enzyme digestion method and type IV collagen coated chosen methods. Culture the cell in medium with different serum level-0、5、10、15 and

4、20. The shape and clone formation and proliferation of the cell was observed through inverted microscope, tested by the MTT METHOD Immunocytochemistry was used to observe the expression of corresponding marker such as K19、K14 and K10 on epidermal stem cells in every generation after passaging. Resul

5、ts the epidermal stem cell can form clones in every kind of serum-medium, with well proliferation. There was no statistically significant difference in the OD values between different time points using MTT test. The expressing of the K19、K14、K10 in levelled serum-medium did not have obvious differen

6、ce at first, but there can detect gradual difference between these subgroups with different level of serum during passaging. Conclusion the epidermal stem cell will keep its characteristics and grow better in medium with lower serum.【Keyword】epidermal stem cells level of serum proliferation and diff

7、erentiation culture近年研究表明，表皮干细胞(epidermal stem cell, ESC)是皮肤发生、修复和重建的关键“种子细胞”。建立体外表皮干细胞的分离、纯化和培养体系,探讨ESC增殖、分化和迁移等机制已成为皮肤创面修复领域的研究重点。其中，分离、诱导和调控ESC，是组织工程化皮肤走向临床应用的核心技术。虽然表皮干细胞可以在体外培养扩增,但其在培养过程中极易分化,临床所需的表皮干细胞来源仍非常紧张。因此，如何在体外建立良好的培养体系，使得体外培养的表皮干细胞能够快速增殖而不分化或者延迟分化便成了目前急需解决的问题。本研究中，我们通过改变培养基血清浓度，观测表皮干细胞

8、的增殖分化现象，得到相对满意的培养体系，为进一步研究表皮干细胞的分化、诱导等机制奠定了基础。1 材料和方法1.1.1材料 皮肤取自1825岁行包皮环切术患者，患者无泌尿系统感染等疾病。患者均知情同意。1.1.2 试剂 中性蛋白水解酶、胰蛋白酶+EDTA、型胶原、半琥珀酰氢化可的松、表皮生长因子、DMEM/F12(半琥珀酰氢化可的松，0.4mg/L；重组人表皮生长因子，10g/L；胰岛素,0.5ml/L)（美国Sigma公司），抗角蛋白（抗-K19）19，抗角蛋白14（抗-K14），抗角蛋白10（抗-K10）等抗体（北京中杉金桥生物公司），胎牛血清(FBS)（杭州四季青生物公司）。MTT试剂盒（

9、武汉博士德生物公司），D-Hank，s液自行配制准备。1.2 方法 1.2.1 表皮干细胞的分离、培养取得的新鲜包皮在含有青、链霉素的D-Hank 液洗涤数次至洗涤液纯净,无菌条件下，去除皮下组织，并将皮片剪成 1cm×1cm 大小,加入1U·ml1中性蛋白水解酶,4冰箱过夜。次日，用 D-Hank，s液清洗3次,分离表皮和真皮。获得的表皮放入 0.25 %胰蛋白酶+EDTA的消化液中,室温消化5min后,加入含10%FBS的培养液终止消化,经200目细胞筛过滤,获得角质形成细胞悬液。将角质形成细胞悬液1000 r· min1 离心 5min ,弃上清液 ,加入含

10、10g·L1 表皮细胞生长因子(epidermal growth factor ,EGF) 的和10FBS DMEM/F12表皮干细胞培养液调节细胞数为 5 ×105· mL1 ,接种于已经用型胶原包被过96孔板12中 ,每孔 0.1mL ,37,5%CO2孵箱中培养，约20min,去除悬浮的细胞和杂质，分5组分别加入含020的血清的培养液，继续孵箱内培养，隔日换液 ,观察细胞贴壁、增殖及克隆样生长的情况。1.2.2 MTT试验 用MTT法（参考MTT试剂盒说明书）观察培养第 2 、6、10、14 d 的细胞增殖（每不同血清浓度培养基每次测定6孔）情况。弃去 96

11、 孔培养板中的细胞培养基 ,每孔加入 50l 浓度为5 mg· mL1 的MTT ,置 37 5 % CO2 培养箱中培养 4h ,弃去上清液 ,每孔加入 200l 二甲亚砜 ,振荡 10 min 后 ,在酶联免疫检测仪上测定各孔OD 值。1.2.3 细胞的鉴定 在培养瓶中培养（不同血清浓度的培养体系）至长满瓶底85以上，按常规细胞传代的方法传代。同时取相应代数的细胞，以约1×104·孔1接种于放有玻片并预铺型胶原的24孔板中培养（培养液仍是020血清浓度）。24小时后，吸出培养液，DHanks冲洗3次，95的乙醇固定15min。D-Hank，s冲洗3次，3过氧化

12、氢室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；每孔分别加200l的鼠抗人单克隆抗体 (K19、K14、K10)，滴度均为1：100，对照组加入D-Hank，s液，4孵育过夜。D-Hank，s冲洗3次，每孔加100l辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠的IgG，室温下孵育30min；D-Hanks冲洗3次，DAB染色液显色，显微镜下观察，出现棕黄色后即可把玻片放入水中终止反应。苏木精复染，盐酸乙醇分色，氨水返蓝。观察K19、K14、K10染色阳性的细胞，比较各组间的差别。1.2.4 统计学处理 所有数据均以±s表示，采用SPSS13.0统计软件处理数据，组间均数比较用 t 检验处理。2

13、结果2.1不同血清浓度培养体系对表皮干细胞增殖的影响 两步酶消化结合型胶原差速贴壁法1制备的表皮干细胞为单个、散在、圆形，折光性强，细胞核大，轮廓清晰的贴壁细胞，24小时后便能见到34个细胞形成的集落，此时细胞开始呈多边形。随着培养时间的增加细胞集落内细胞数增多，并渐渐联合成片，约2周时间长满瓶底。MTT检测结果显示不同血清浓度培养基对表皮干细胞的增殖无明显影响（表1）。表 1 MTT检测各组吸光度OD值结果（n=6, ±s）0%5%10%15%20%2d 0.760±0.0450.766±0.0760.770±0.0670.753±0.054

14、0.786±0.0406d 0.881±0.0390.858±0.0270.849±0.0160.859±0.0520.874±0.04610d 1.065±0.0271.069±0.0171.069±0.0221.048±0.0181.086±0.02814d 1.445±0.048 1.313±0.025 1.297±0.048 1.290±0.052 1.275±0.058相同时间点各组比较 P0.052.2 细胞免疫化学染色结果

15、 第1代表皮干细胞K19均有表达（图1-1），而K14和K10表达均为阴性。细胞培养至第3代时，血清浓度较高（15、20）的培养基内K19表达减少而出现K14表达（图1-2），而低血清浓度(0、5)培养基内暂未出现K14的表达。当细胞培养至第6代左右时所有血清浓度培养基内K19表达均明显降低，镜下几乎见不到阳性细胞，低血清浓度(0、5)培养基内的细胞K14表达增加，未见明显K10阳性细胞表达；高血清浓度（15、20）培养基内的细胞K14表达亦有减少，出现了K10阳性细胞的表达。细胞培养至第10代时，各组血清浓度培养基内细胞均以K10表达为主（图1-3）。 图11细胞中K19的表达 图12细胞中

16、K14的表达 图13细胞中K10的表达（免疫组织化学×100）3 讨论 表皮干细胞在体能够自我复制并分化成皮肤组织而维持了皮肤组织的自我更新；在皮肤组织受损或者体外培养时都会被激活并增殖从而形成皮肤组织2-3。从而可以看出表皮干细胞极易分化，这对皮肤组织的自我更新是很有利的，但是从组织工程的角度看又是相当不利的。用组织工程的方法重建皮肤组织需要大量的维持干细胞特性的“种子细胞”，需要利用少量的表皮干细胞培养增殖达到足够重建皮肤“种子细胞”的量比较困难4。要想获得足够的“种子细胞”体外培养是必不可少的一项重要技术方法。大多数动物细胞的体外培养，都不同程度地依赖血清才能生长增殖。血清除了

17、供给细胞的营养成分外，还能促使细胞合成DNA，对细胞增殖的促进作用很大。现已清楚，血清在体外培养细胞中的作用，主要是提供了细胞增殖所必需的生长因子，然而，同时因为血清的成分十分复杂，特别是对一些基础理论研究，使用不同血清浓度也可能影响实验结果5。对表皮细胞培养的研究发现，根据其生长潜力可将其分为3类：(1)完全克隆细胞，即干细胞，具有强大的生长增殖潜力；(2)间生态克隆，即暂时扩充细胞(transit amplifying cell，TAC)；(3)终末分化细胞鳞状细胞6。已有研究表明随着分化程度的不同，表皮细胞表达不同的角蛋白，因而可用于鉴别ESC、TAC及终末细胞。19和15被认为是ESC

18、的阳性标志，TAC表达5和14，而分化的终末细胞表达1 和107-8。本研究中表皮干细胞在不同血清浓度培养体系中均能够成活、增殖。表皮干细胞成活率及增殖的速度并不随着血清浓度的增加而明显增加，各组间经MTT法所测得的OD值在统计学上并不存在差异。而在表皮干细胞及表皮细胞标志物的测定上却存在着明显差异,主要体现在细胞传代至36代，相应代数的不同组间细胞标志物的测定出现了明显的差异。提示不同血清浓度的培养体系在对表皮干细胞的分化上有着特殊的影响。血清是一种很复杂的混合物，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，能够维持表皮干细胞成活，并促进增殖。同时血清中含有的成分能诱导细胞使其发生分化，有研究者在行其

19、他干细胞研究时同样发现了不同血清浓度对其他干细胞的分化产生不同的影响9。可能与血清中含有的VEGF、EGF、bFGF等多种细胞生长因子有关，细胞生长因子对细胞增殖、分化影响均存在一定的量效关系。因此才出现本研究中随着培养基中血清浓度的逐渐增加对细胞的分化促进作用逐渐不同，即低血清浓度培养基内表皮干细胞特性的维持比高血清浓度培养基内的特性维持的时间要长，这些结果和刘缘10等人在神经干细胞研究中的结果一致。该实验所用低血清浓度培养体系能够使得表皮干细胞存活、快速增殖，并能够很好的维持表皮干细胞的特性。但是是血清中何种活性成分对表皮干细胞的分化影响较大，是一种活性成分在起作用，还是多种活性成分共同作

20、用，能够产生生物活性的浓度是多少，等等，都是需要进一步深入研究的问题。对这些问题的深入研究必将对表皮干细胞成为良好的“种子细胞”，为皮肤的组织工程的研究产生积极的影响。参考文献1Olszewski WL.Stem cells of the human skin epithelium-can they be isolated and resume function as single-cells transplanted into recipient skin defects? J Ann Transplant 2004,9:34-36 2胡葵葵，胡琼华，戴育成。表皮干细胞的研究进展M。国外医学皮肤性病学分册，2004，30：1051073 Bickenbach JRChism ESelection and extended growth of routine epidermal stem cells in cultureJExp Cell Res，1998.244（1)：l844 Morasso ML,Tomic-Canic M.Epidermal stem cells: the cradle of Epidermal determination ,differentiation and wound healingJ.Bio cell2005，97：173183