原核表达的详细步骤

1、原核表达详细步骤Part I选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA(cDNA序列，有几种方式寻找正确的读码顺序： 利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在 DNA的 ORF中找到正确的读码。 实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。 利用mRNA勺特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起 始密码子与终止密码子(cDNA。2. 注意事项： 区别ORF和CDS>ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终 止密码子；CD列以是DNAh的定义，也可以是mRN上的定义，分为complete CDS 和parti

2、al CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去， complete CDS读码是“M、*”， partial CDS 的读码是相应的 AA 在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由612氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列(蛋白质一级结构) 组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物， 用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会 暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可

3、能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对 抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。2、选择原则：(1) 、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。(2) 、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。(3) 、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白 质的N端及C端是很好的抗原决定簇区域。3、选定抗原决定簇的步骤：(1) 预测：如软件预测 DNAstar (Protean )预测，Dnaman在线网站预测(/molbio/hla bind/index.shtmlandhtt

4、p:/www.imtech.resn/raghava/propred/algorithm.html)(2) 选定：接近 N、C端；选取在此区间内，(Antigenic Index ) Jameson-wolf 抗原决定簇选正分高处；(Hydrophilicity plot ) Kyte-Doolittle 预测亲水性 强的区域。同时符合以上3点的区域较好(命名为多肽片断 A)。注：如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区，即头端信号肽 所在的区域(3) NCBI (BlastP )比对：将多肽片断A放入blastp进行同源性比对。如果制 备某一动物种属的抗体，该区必须与该动物的氨基

5、酸序列没有较高的同源性。注：这一步往往容易漏掉，所以学会应用生物信息学，可以减少走弯路！ ！(4) 抗原合成：原核表达：化学合成：需要做化学偶联增强多肽稳定性。多肽的纯度越纯越好，一般 80% 就完全可以了。合成5-10 mg就可以了。Part U选择表达系统一、选择表达载体1、选择表达载体的原则(1) 蛋白质大小：决定在胞质中表达还是以包涵体的形式表达，是否加标签或 以融合蛋白的形式表达。(2) 蛋白需求量：根据实验方案确定蛋白需求量，选择合适的载体。(3) 蛋白质是否需要保留活性：有活性的可溶性蛋白表达(胞质蛋白)，无活性的不溶的蛋白(包涵体蛋白)2、原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体

6、应具有以下几种元件：(1) 选择标志的编码序列：用于筛选重组子，有抗生素抗性基因、报告基因(GFP 等)(2) 可控转录的启动子：启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表 达不可缺少的重要调控序列。启动子的强弱是对表达量有决定影响的因素之一。 没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子， 因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA勺合成极为重要。在转录起始点上游 510 bp处，有一段由68个碱基组成，富含A 和T的区域，称为Pribnow盒，又名TATA盒或一

7、10区。来源不同的启动子, Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。 -35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起 始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯 键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的 RNA链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有 Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启 动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、IPL (I噬菌体的左向启动子)、T7 噬菌体启动子等。(3) 转录终

8、止子：在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3¢末端往往有特定的核苷酸 序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA 的延伸也停止在终止信号上，完成转录的 RNA从 RNAR合酶上释放出来。对 RNA 聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域,G/C富含区域又具有回文对称结构。这段终止子 转录后形成的RNA具有茎环结构，并且有与A/T富含区对应的一串UL转录终止 的机制较为复杂，并且结论尚不统一。但

9、在构建表达载体时，为了稳定载体系统， 防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一 段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。(4) 核糖体结合位点(SD序列)：1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNAt有核糖体的结合位点，它们是 起始密码子AUG和一段位于AUG上游310 bp处的由39 bp组成的序列。这 段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补， 是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为 Shine-Dalgarno序列， 简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRN转录、

10、翻译成蛋白的 重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRN与核糖体的结合，从而 影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在 ATG之后，才能 产生一个完整的蛋白质。（5）多克隆位点（MCS :选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列，否 则在构建重组子进行酶切时会把靶基因给切开。在惠赠或交换的质粒中确定 MCS的正确性，否则会造成错读密码子。6）复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1 pMBI（pUC类的复制子（复制起始部位）的拷贝数高 达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正

11、相关,当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元（？）是否相容的问题。（7）融合Tag：基因融合是将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接起来，并 且正确读码。在表达靶蛋白是加上融合标签的好处，（a保护靶蛋白免受原核宿 主蛋白酶的降解；b提供亲和纯化的配基结合位点；c改善靶蛋白的溶解性，使 其正确折叠；d与已知酶或抗原结构域连接，可以进行标记和分离；e与信号肽连接，可将融合蛋白分泌到特定细胞区域。） 注：选择融合蛋白表达载体时，融合标签与靶蛋白的连接处如果有酶切位点， 且 想除去标签，贝懺体的酶切序列在靶蛋白中不能出现。二、选择表达宿主首

12、先要看靶基因中有没有细菌不常用的密码子一一如果有，需要考虑换表达菌 株。每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改 造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。不同的载体要配合一定的菌株使用，像 pET系列就一定需要有T7 RNA聚合酶片段整合 在细菌中的菌株才可用于表达。采用不同调控机制会使用不同的表达菌株， 所以 换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。以 Novagen为例，如果使用 BL21（DE3）表达不成功的话可以换 Rosetta系列菌株，它能够由一种氯霉素抗性 的、与pET相容的质粒提供 AUA AGG AGA CUA CCC和 GG

13、A的 tRNA 所以这 类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。有时不明原因的表达蛋白截短（比预期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密码子造成的。另外一种可能是不严谨的本底表达产物抑制。1.原核表达系统（大肠杆菌）优点：遗传图谱明确容易培养且费用低对许多外源蛋白耐受能力强能高 水平表达这些蛋白 缺点：蛋白质不能进行翻译后修饰（在真核高尔基复合体中的糖基化修饰，特 点位点的切割等产生具有活性的蛋白）具有密码子的偏好（？）2. 真核表达系统优点：可以产生修饰的蛋白缺点：真核表达系统复杂费用高注：不同的表达宿主有相应的表达载体，二者应是最佳表达组合。Part川构建重组子一、重组子的

14、构建1. 设计引物：a保证引物序列扩出的靶基因插入到表达载体 MCSk，能够正确 读码；b引物两端加入酶切位点；c遵循引物设计原则（一般性引物自动搜索可 采用“ Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“ Oligo 6”软件）。2. 扩增靶基因：（1）通过PCF方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。（2）通过RT-PCF方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总 RNA以mRN为模 板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。注：但在PCR过程中，需

15、要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。尤其注意不要引入终止密码子。3. 限制性内切核酸酶消化载体 DNA和目的基因：（1）载体双酶切后回收：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收 Kit或冻融法回收载体大片段。（减少假阳性的重组质粒连接，去除切下的小片段多克隆位点）（2）PCR产物双酶切后回收：限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。一般先用PCRT增带酶切位点的目标基因，克隆进 T-载体，然后用与消化载体 相同的内切酶进行消化和胶回收。注：双酶切后，进行回收纯化，可以提高阳性克隆的几率。4. 连接

16、目的基因和载体二、重组子的验证1将连接产物转化到相应的宿主菌（感受肽的制备，转化）2. 鉴定带有重组质粒克隆：常用方法的有 a -互补、小规模制备质粒DNA®行 酶切分析、PCR以及杂交筛选。如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落（甚 至全部为重组子）。3. 筛选出含重组子的转化菌落，DNA序列测定。（正确测序）测序结果出来后，首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号， 读码是否正确，这是最有说服力的鉴定结 果。有时载体几经多个实验人员的周转， 反复插入片断，或者是粘端相同的不同 酶切片断之间的连接，会意外在启动子后面带入终止位点，特别

17、是用到Xbal之类的酶要小心。然后要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的 情况。注：长期保存的重组子在高浓度甘油（19%）中会导致质粒不稳定，即脱质粒。 可以将载体和宿主分别保存。Part W诱导表达一、 诱导表达1. 诱导表达类型组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子， 也就是一直努力不停表达目的 蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不 适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能 表达目的产物。

18、 这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响， 又 可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。 特别适合解决有毒蛋白的表达。 另外也有 启动子是组成型的， 但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的， 也属于诱导表达 系统。融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签(Tag),表达产物为 融合蛋白(有分N端或者C端融合表达)，方便后继的纯化步骤或者检测。对于 特别小的分子建议用较大的Tag (如GST以获得稳定表达；而一般的基因多选 择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。分泌表达： 在起始密码和目的基因之间加入信号肽， 可以引导目的蛋白穿越细胞 膜，避免表达

19、产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长， 或者形成包含体， 而且 表达产物是可溶的活性状态不需要复性。 通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞 壁之间的周质空间。可溶性表达： 大肠杆菌表达效率很高， 特别是强启动子， 目的蛋白来不及折叠而 形成不溶的包含体颗粒，包涵体容易纯化但是复性效率不高(非常股复杂)。分 泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如 Thio，pMAL系统。2. 诱导表达(1) 挑取含重组质粒的菌体单斑至 2ml LB (含Amp50i g/ml)中37C过夜培养。(2) 按1 : 50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的培养瓶

20、 中，37 C震荡培养至 OD60鸽0.4-1.0 (最好0.6，大约需3h。(3) 取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入100mMIPT至终浓度为0.4mM (T7启动子)或1 mM( T7lac启动子)，作为实验组,两组继续37C震荡培养3h。(4) 分别取菌体1ml,离心12000gX 30s收获沉淀，用PBS重悬、洗涤、离心。(5) 对细菌沉淀进行处理，做 SDS-PAG等分析。3. 注意事项：(1)关于表达不出来的原因有很多a 如果测序都是正确的话，设计一个 postive expression control ，验证整个表 达系统没问题。b检测是否有毒性。涂一个IPTG的板子看

21、菌落生长情况如何。c看看稀有密码子情况，是不是存在成簇的N端的稀有密码子。d看看稳定性，上swiss prot看看在大肠杆菌中的稳定时间是多少。e如果表达的是真核蛋白，可能问题更复杂，可能涉及到伴侣蛋白等问题？f有人会检测mRNA勺稳定性。g可以用亲和层析等办法富集你的目的蛋白，然后再跑胶。因为有时你的目的蛋 白表达丰度过低，SDS-PAG检测不到。(1) 提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因 的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。(2) IPTG IPTG浓度0.2-0.5mM IPTG足够了，不会降低表达量，反而会增加 蛋白的可溶性。IPTG浓度过高，易使蛋白

22、表达速度增大，来不及正确折叠而产 生不溶性蛋白(包涵体)。T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最 佳浓度(25uM-1mML间)使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。(3) 温度：一般37E诱导3-4小时，30E诱导6小时是蛋白表达的最大产量期。 22C、18C、16C等低温诱导时间在12h-48h。低温诱导可使蛋白缓慢合成，利 于蛋白正确折叠形成可溶性蛋白。 为了得到更多的可溶性蛋白，可以考虑将温度 再降(但表达总量会有所降低)，可以考虑 25°，诱导8-10个小时；20°诱导14-18个小时；甚至15° 24-36小时诱导。二、检测诱导表达1. 细

23、菌的裂解裂常用方法有：高温珠磨法；高压匀浆；超声破碎法；酶溶法；化学渗 透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法、已在工业生产中得到应用，后 三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法结合使用的实验步骤。(1) 常用的溶解酶有溶菌酶；B -1,3 -葡聚糖酶；B -1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶； 壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显 著。4 C, 5000rpm离心，15 min，收集诱导表达的细菌培养液(30 mL )。 弃上清，1mL裂解缓冲液，悬浮沉淀，30 C作用1h。(2) 超声破碎细菌,40w,10s,10s,50 次；12000r

24、pm ,4 C离心,15min，分别收集上清液和沉淀。分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2X凝胶电泳加样缓冲液，待检测。注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关， 应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经 3 -4次冻溶后更容易破碎。2 .进行SDS - PAG瞪测(1) 表达结果：a细胞质中表达；b包涵体形式表达。(2) 包涵体的纯化a包涵体的洗涤；b包涵体的溶解；c包涵体的检测从基因角度改造一下，如果能够去掉一些疏水区段会很大程度上改善蛋白的可溶性(4) 注意事项a所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性；b根据自己的需要选择不同的表达载体， 并注意不同的

25、表达载体上的融合标签和 携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。具体的序列和说明都可以从 中下载。c包涵体蛋白溶液保存在四度里，避免反复冻融，否则体系不稳定，蛋白以沉淀 析出；胞质蛋白不能在四度放置很久，因为上清中含有很多蛋白酶，会把靶蛋白 降解掉。1. 了解实验课题对目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的(是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体， 不同目的对蛋白要求不同)；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成 型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行 纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除 (即标签的存在是否会 影响蛋白的活性)。还要

26、对目的蛋白进行稀有密码子(仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时 参考，注意稀有密码子的多少，位置 5位或3位，稀有密码子是否成串出现等) 和可溶性网上预测等。稀有密码子预测网址：http：/.ru/e ng/scripts/01 11.html/mmaduro/codo nu sage/usage.htm/RACC//sumcha n/caltor.html原核表达蛋白可溶性预测网址：http:/www.biot

27、/综合以上，选取合适的表达载体及宿主菌。注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用， 有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。一般我们最常用的是胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的方法来控制表达水平）。2. 搜索要表达的目的基因的序列，根据其编码区序列来设计引物；注意：要注意在引物上加入限制性内切酶识别位点（首先应分析蛋白编码区内是否含有相同的内切酶识别位点），并通过查阅资料看两种酶（上下游引物分别加 入酶切位点）是否可以在同一反应体系中起作用，并注意标签序列是在 N端还 是在C端，若要在C端保留标签，则需要将下游引物的终止

28、密码子替换掉；若 要在引物上引入标签序列，则引物上应加入标签序列碱基（即在上游引物或下游 引物处引入His的密码子）；另外，还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改 变；1，2步的分析至关重要，只有在完成前两步的工作后才可以进行后续的实验操 作。3. 摇菌，进行RNA抽提（注意选取不同表现型的菌株），摇菌的时间一定不 要太长，太长的话RNA活性不高；4. mRNA反转成cDNA （此步应在第三步完成后立即操作，RNA存放时间长易 降解）；5. 以cDNA为模板，利于设计好的引物进行 PCR扩增；6. 通过胶回收试剂盒回收目的 DNA片段真核基因组DNA的克隆cDNA的克隆化技术的成熟，很多染色体

29、的mRNA互补的序列已弄清楚，为丰富人体遗传信息库做出了贡献。除此以外，真核细胞染色体 DNA消化后的片段，合适的载体进行克隆， 也是得到目的基因的重要方法。染色体DNA序列大部分含有插入序列， 即内含子（intron）.内含子的数量不等。而 cDNA则仅代表了外显子（exon）的序列。大肠杆菌等原核细胞不能识 别真核细胞染色体 DNA的内含子，因此其表达研究，仅可应用cDNA，而不能应用真核基因组带有内含子的 DNA ,基因治疗中的目的基因，既可选择。DNA ,也可选择染色体 DNA。一、染色体DNA克隆的载体构建染色体DNA文库并进行克隆的载体有两大类：入噬菌体载体和粘粒载体。质粒载体其

30、容量有限，而染色体 DNA由于带有内含子序列而较长；单链丝状噬菌体载体仅用于克隆单 链DNA,因此质粒载体和单链丝状噬菌体载体都不适用干染色体DNA的克隆。由于粘粒可接纳近 45kb的外源DNA ,几乎是入噬菌体载体载量的2倍，因此，在一个哺乳动物基因组 DNA文库中，仅需 350000个重组枯粒，则可望某一特定的单拷贝序列存在于 其中的概率达 99%。然而，在粘粒中构建和贮存文库要比在入噬菌体中更困难得多，因而 只有当靶基因过大，而不能为单个入噬菌体所包容，或者要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时，才采用粘粒。染色体DNA克隆最为常用的载体还是入噬菌体载体。以入噬菌体为基础构建的

31、载体尽管已是分离众多真核cDNA及基因组DNA的有力工具，但它们也只能接纳大小在一定范围内的插入片段。许多基因由于过于庞大，而不能作为单一片段克隆于这些载体之中，如人凝血因子讯基因长达180kb，肌营养不良基因至少长 1800kb,因此需要建立容量更大的克隆载体。酵母人工染色体（YAC ）方法的建立，使克隆 DNA大区段的工作至少有了可循之经。使用 YAC载体进行克隆时，基因组DNA须在剪切力较小的条件下从实验组织中小心制备，以便得到平均数百万碱基对大小的片段。随后应用一限制酶（如EcoRD部分消化DNA，以产生平均大小为20。一 500kb的大片段 这些片段再连接到经过适当处理以防止自身环化的YAC载体两臂上。除 EooRI以外，也可用Notl和Mlul 类切点稀少的限制酶进行完全消化。二、从哺乳动物细胞中分离高分子量DNA哺乳功物DNA的