膜分离与沉淀结合法提取肝素钠的工艺研究MicrosoftW

1、设计题目活性污泥法处理污水的技术研究学生姓名陈宽宽班级生化制药30805班专业名称生化制药系部名称制药工程系指导教师范继业提交日期答辩日期河北化工医药职业技术学院年月膜分离与沉淀结合法提取肝素钠的工艺研究摘要肝素钠是肝素的钠盐，本质上是分子量不同的粘多糖相混合在一起的硫酸氨基 多糖的钠盐，广泛存在于哺乳动物欧立（Ehrlich氏肥大细胞中，具有高效抗凝血、 防止血检形成和降血功效,并可用于治疗某些免疫复合体（Immuno Complex疾病,有 广泛使用和开发价值。肝素钠是我国传统出口生化制品，我国出口的肝素钠，由各地生产点提供粗品肝 素钠精制而成。由于各地制备工艺的差异，尤其是操作要领的掌握

2、能力和程度差异, 直接影响到肝素钠粗品质量，从而给肝素钠制备工序带来困难。用膜分离与沉淀剂结合法代替盐解-离子交换-乙醇沉淀法从猪小肠黏膜中提取 肝素钠，达到降低成本、增加收益的目的。方法：盐解-离子交换-沉淀-膜分离。结果：膜分离与沉淀结合法与盐解-离子交换-乙醇沉淀法相比较，乙醇用量减少 85流右，回收率和效价分别提高29.03 %和61.84 u/mg ;与膜分离法相比较回收 率和效价分别提高0.62 %和15.93 u/mg。结论：膜分离与沉淀结合法工艺设计合 理、方法可靠，适宜于中、小企业生产。摘要：肝素钠，钠盐，膜分离，沉淀剂结合法目录第一章绪论5第二章浅谈肝素钠肝素钠及其生产62

3、.1肝素钠62.2提取肝素钠的原料62.3肝素钠的效价62.4提取肝素钠的工艺原理72.6提取肝素钠所使用的设备和器具72.7原料规格及大致生产消耗7第三章膜分离与沉淀结合法提取肝素钠8一实验部分83.1试药与试剂83.2测定方法83.3规范药物配制83.4立足本职岗位，多渠道节支降耗8二条件的选择93.2.1滤膜的选择93.2.2沉淀剂用量的选择9三工艺过程103.3.1 吸附 10332洗涤与洗脱103.3.3 分离 .103.3.4除蛋白质取膜上截留部分 103.3.5 沉淀103.3.7活力回收试验11四讨论11第四章结论11参考文献 12致谢13第一章绪论肝素钠是一种广泛存在于哺乳动

4、物组织中的黏多糖，具有抗凝血作用，被广泛用于手术 和脑血栓、心肌梗死等的治疗。目前，肝素钠主要是从猪、羊小肠黏膜和牛肺、腌肠衣盐水等 中提取。其提取方法不下于30种，国内最常用的规模化生产的方法是盐解或酶解-离子交换-乙醇沉淀法。从目前情况看肝素钠的收购主要是国内一些制药厂。由于肝素钠现外贸出口量有所降 低，加上国内提取者继续生产，致使肝素钠的售价目前不是很高。从某些地方的情况看，收购 效价在100 一 120u的肝素钠前几年有过每公斤700元左右甚至更高的价格，而现在回落幅度较大。有些广告讲的目前每公斤ro以X多元那应是精品的近期价格。就目前的市场肝素钠价格来讲，生产者的利润是少了。但如果把

5、腌制肠衣、采取措施提高肝素钠的收率、节约原材料 及找好市场等很好地兼顾起来，还是可以收到不少利润的。许多生产者还把希望寄于中国的人 关，相信那时出口量及价格都可能会有所增加。因为国外对肝素钠的需求量很大。另外，应该 说目前的情况也是在调整肝素钠的市场。因为国内的生化制药厂对于生化药品制剂的生产量和 品种与国外相比还是较低、较少，所以患者临床使用的生化药品制剂的价格就比较高，这样就 限制了一般人的使用量。如果有关部门或生化制药部门能共同协调生产和市场，肝素钠及其它 生化产品的市场潜力将是很大的。-离子交换-乙醇沉淀法从猪小肠黏膜中提本文主要研究用膜分离与沉淀剂结合法和用盐解 取肝素钠哪个更经济，

6、更适合生产应用。第二章浅谈肝素钠肝素钠及其生产2.1肝素钠肝素钠是肝素以钠盐的形式被提取出来并被制成药用制剂。实际上产生药效的是肝素， 肝素是一种应用已久的抗凝血剂，后来发现它对其它一些疾病也有良好的预防和治疗作用。如 心肌梗塞、脑血栓、肾病患者的渗血治疗，治疗肝炎、皮肤病，防止癌细胞转移及消炎和抗过 敏作用等。肝素受酸碱等因素的影响比较大。肝素遇酸很不稳定。当用70C0.IN的盐酸处理1分钟，肝素便失去抗凝血效力70%。粗制肝素在pH2.5温度80 C的溶液中经过2小时，它的活力也损失一半。即使在温度不高的稀醋酸中，肝素也失效很快。肝素对于碱却是相当稳定的。纯度愈高，稳定性愈大。高纯度的肝素

7、的钠盐在10N碱及50%硫酸钱溶液中，经1小时加热到80C，没有引起活性的降低。粗制的肝素稳定性虽然差一 些，但在用稀碱浸出时，其活力也无损失。当然，碱的浓度和温度也不能随便增加，那样会造 成不良的后果。如：将肝素溶解于100C IN的氢氧化钠溶液中，5分钟后就会损失 75%的活力。 所以，把肝素制成合适的钠盐能便于它的保存、制剂和使用，使它不致于在一定时期内失去活 性和药用效力。2.2提取肝素钠的原料肝素广泛分布于哺乳动物的组织中。如肠粘膜、十二指肠、肝、肺、心、胰脏、胎盘、 血液等。目前国内大都用猪小肠粘膜作为原料来提取肝素钠。一是猪小肠量大，含肝素也比较 丰富；二是猪小肠刮制粘膜后可腌制

8、肠衣，外贸部门收购出口；三是粘膜废渣可以作为优质饲料，基本上能做到完全利用。这样相得益彰，效益也就好一些。其它原料一是相对价格较猪小 肠高，二是数量少，有些肝素的含量也少。当然，如果其它原料充足且价格又很便宜也是可以 使用的。如猪肺、血等。2.3肝素钠的效价提取肝素钠的关键是要提高它的效价。效价高，售出的价格也高。肝素钠产品的效价是以每毫克产品抗凝效价若干单位（u来表示的，符号为：u/mg。如某产品IKg，化验效价为loou/mg，则 IKg=l以洲x洲洲mgx1oou=l以X0C以Xu，故其总效价为1亿单位。若某产品的化验效价 为80u/mg ,则IKg产品的总效价为0.8亿单位，其余类推。

9、一般情况下都简单用每毫克的效价 来称谓每批产品的效价，即60、80、100、120。一般一次提取出来的是肝素钠的粗品。效价在1oou左右或以下的都称为粗品。若要得到精品，必须再经过精制。精制后的肝素钠效 价可达Zoou以上。所以肝素钠的价格是与效价有关的。2.4提取肝素钠的工艺原理 哺乳动物组织内的肝素与其它粘多糖在一起并与蛋白质结合成复合物，所以肝素的制备一般包 括肝素一 蛋白复合物的提取、肝素一蛋白复合物的分解和肝素的分级分离三步。241提取碱能打断肝素与蛋白质的结合，而对肝素影响较小，故组织内的肝素的提取都 采用钠盐的碱性热水或沸水浸提。这样的提取物内仍存在可溶性肝素一蛋白质复合物。2.

10、4.2分解目前一般用两类方法来去除肝素一一蛋白复合物中的蛋白质。酶解一般是在提 取时加人一定量的蛋白水解酶。已用过的酶有胰蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等。在 提取条件下蛋白水解酶并不能使蛋白彻底水解。由于水解后仍会存在有蛋白质，且加入的酶本 身也是蛋白质，所以要靠调节pH值并加热除去。若在酸性条件下加热，会使肝素丧失部分活性。盐解一般是用碱性食盐水提取，与热变性和凝结剂（明矶、硫酸铝等变性措施结合除去蛋白质。不用凝结剂也可。酶解工艺和盐解工艺相比，成本和酶源都不及盐解低且方便易得。243分级分离用上述方法得到的产物含有其它粘多糖，也含有未除尽的蛋白质和核酸类 物质。目前多用阴离子交换剂或

11、长链季馁盐进行分级分离，然后再经乙醇沉淀和氧化剂氧化等 步骤进一步精制。所用的阴离子交换剂一般多用D 一 254或仆一 714树脂、1229X9大孔树脂及其它类似的树脂进行离子交换。D 一 254树脂交换能力较强，但机械强度较差。不过一般还都是使用D 一 254树脂。2.5提取肝素钠的工艺流程2.5.1酶解一离子交换工艺流程（子交!厳赚捕韩韻一jfM軽附期pH«.44n：pH7【讪ittt r» 他棉F*”网?也ftK#Mb)Atttt1Z汎劇乙ff【乙wnctt) 乙 _* ptUOIIOXpH6JL解.种沉稷】VftM 乙耳亠中 一一桔严细无水乙"内乙 瓯.丁

12、； 0CK* Wti5左子立換工花酒程仙IHL車*IM炉丹，52.6提取肝素钠所使用的设备和器具（I陶缸500升4个（盐解、交换各用2个;（2陶缸200升ro个（沉淀及存放用；（3蒸汽锅炉（0.1勺1 台（提供加热蒸汽用；（4电动搅拌器100转/分钟1台佼换、吸附用；（5塑料盆30升5个（漂洗及 存放用；（6塑料提桶巧升5个（漂洗及存放用;（7尼龙筛布60目、80目、100目各I米（过滤用;（8 酒精比重计。一 1002支恻乙醇浓度用；（9波美比重计o 352支（测盐水浓度用;（10温度计0 100C 3支（测液体温度用；（n乙醇分硫器1台（回收乙醇用;（12离子交换柱。巧。、。200各1台（

13、洗脱用;（13量筒、量杯looml、I0（0ml各2个（测比重及容量用;（14真空泵30升/分钟I台（抽滤 用；（巧抽滤瓶5 一 10升2个啪滤用;（16布氏漏斗。巧0 中2002个（抽滤用;（17胶管、胶塞适 量（抽滤用；（18干燥箱1台仟燥用;（19压滤器1台（盐解用;（20保温搪瓷桶30 一 50升1个（洗脱 用;（2I医用输液卡4个（洗脱用。以上是要求比较正规一些的提取肝素钠的设备器具配备情况。若资金有限，也可因陋就简，节约资金。比如蒸汽锅炉、压滤机、离子交换柱、真空泵等价值 较高的设备都可以先用土法代替。当然设备规范一些对提取肝素钠的各个环节及质量、收率都 较为有利。2.7原料规格及

14、大致生产消耗t据有关资料统计，按生产1亿单位肝素 计算，需消耗新鲜不腐败（这一点很重要的肠粘膜2.4 一 3.6吨;D 254树脂I 一 ZKg;95%工业乙醇IO（Kg左右;30%工业级盐酸50纯左 右;30%工业级液碱looKg左右;8 一 10、I 一 14pH试纸适量;精盐 40（Kg左右；丙酮2 一 4Kg。在实际生产中有些操作者技术熟练，工艺 掌握得好，能充分利用原材料，这样消耗就会低一些，否则就会高一 些。另外即使是小批量生产，每批也得投人 200根以上的猪小肠粘膜 作为原料，太少生产起来就不合算了。O第三章膜分离与沉淀结合法提前取肝素钠肝素钠是一种广泛存在于哺乳动物组织中的黏多

15、糖，具有抗凝血作用，被广泛用于手术和脑血栓、心肌梗死等的治疗。目前，肝素钠主 要是从猪、羊小肠黏膜和牛肺、腌肠衣盐水等中提取。其提取方法不 下于30种，国内最常用的规模化生产的方法是盐解或酶解 -离子交换- 乙醇沉淀法。我们采用盐解-离子交换-沉淀-膜分离技术（膜分离与沉 淀结合法）从猪小肠黏膜中提取肝素钠。1实验部分 1.1试药与试剂猪小肠黏膜（兰州军区屠宰厂），7530型紫外可见分光光度计（惠 普上海分析仪器有限公司），聚丙烯腈（PAN膜3分子量（Mr） 3 0004 000，订做,D204树脂（浙江永红树脂厂），波美计（浙江玻 璃仪器厂），肝素钠标准品（中国药品生物制品检定所，20 mg

16、, 240u/mg,批号：9512-200105），牛血清白蛋白（中国药品生物制品检定 所，批号：40619 200213），氢氧化钠、氯化钠、乙醇等均为化学 纯，肝素钠效价测定及蛋白质含量测定用试药与试剂均为分析纯。1.2测定方法采用猪血浆法4，按中国药典（2005年版二部附录刈D）肝素钠 生物检定法，测定肝素钠效价；按福林酚测定法 5，以牛分针断头影 响实验。2.3规范药物配制，提高有效利用率通过实践摸索出适合各个不同机能 实验的最低药物浓度；在满足机能实验需求的情况下尽可能地自行配 制实验用药；采用实验班集中用药原则，减少分散到组造成的浪费； 对不宜保存、保质期短、易失效的药品，应充分预

17、计用药量，采取少 配、勤配的原则，如肾上腺素、链霉素、肝素等。机能实验准备时要 规范药物配制流程，控制机能实验过程中的不必要浪费。近年来，在 开班人数明显增加的情况下，机能实验用药的采购量和使用量基本保 持不变。2.4立足本职岗位，多渠道节支降耗机能实验涉及的仪器设备和实验耗材品种繁多，门类齐全。指导学生进行正确的机能实验操作，规范使用仪器设备，如电子天平、换能器等，可在一定程度上降低仪器设备的损耗率，提高完好率；同时加强仪器设备的日常维护保养，及时清除兔毛、鼠 毛等污物，均可较大程度地延长仪器设备的使用寿命。对酒精棉球、 纱布、干棉球、手术缝线等常用耗材实行按组按需发放，对实验结果 打印用纸

18、实行按生按需发放，可以从源头上起到节支降耗的作用。2条件的选择2.1滤膜的选择肝素Mr为12 000 士 6 000 ;对商品肝素的研究提示至少有 2种分子个体，Mr为3 00037 5006。根据文献7，选用Mr为1 0002 000(PAN 1、3 000 4 000 (PAN 2、5 000 6 000 (PAN3 以上的分离膜，对猪小肠黏膜中的肝素钠进行截留，结果见表1。ft 牢Fl Me酬縈催闻蘇肝厳常的敢怕庵4“协IVRH*o(D鶴3J3Z3J1101J116.41 APANi244IM14时I57JFA%50A2233J112.1?IS3.2186.4*1 fj表1表明，用Mr为

19、3 0004 000的聚丙烯腈膜从猪小肠黏膜中提取肝素钠效果较好。因此，选用 Mr为3 0004 000的聚丙烯腈膜作为分离猪小肠黏膜中肝素钠的滤膜。2.2沉淀剂用量的选择选用12种蛋白沉淀剂（Db W与肝素钠提取液（TQ比例，即DGW:TQ= 1.0:10.0 1.0:120.0，结果见图I irt.l*日I IX：鼻討TQ屮flf"沉錠曲规的S&縮图1表明，当DG W:TQ= 1.0:10.01.0:80.0时，蛋白沉淀率不变（约4.5 mg/100 ml ;当为1.0:90.0时，蛋白沉淀率开始下降（约3.5mg/100 ml;当为1.0 : 1101.0:120时，蛋

20、白沉淀率降至最低（约0.25 mg/100 ml。这与文献7报道相一致。所以DOW与 TQ的比例应以 1.0:50.0 1.0:80.0 为宜。3工艺过程3.1吸附量取猪小肠黏膜500 kg,置反应锅中，加水稀释至比重计或波美计的一定浓度（用0.81.0 mol/L标准氯化钠溶液校正），用 30%氢氧化钠溶液调节pH值至9.09.5，加热至沸，保持1015 min,缓慢降温至35 C45 C,同时滤液虹吸至反应池中，加入6% D204树脂，保温搅拌吸附810 h。3.2洗涤与洗脱吸附完毕后，静置30 min,过滤，收集树脂，并用自来水将树脂漂洗干净，沥干，加入1.2 mol/L氯化钠洗涤2 h

21、，沥干后，加入4 mol/L氯 化钠1倍量，搅拌洗脱5 h，沥干后再洗脱2次，每次加入4 mol/L氯 化钠溶液量减半，洗脱时间分别为2 h、1h。合并全部洗脱液。3.3分离将洗脱液在不断搅拌的情况下用截留Mr3 0004 000的聚丙烯腈膜进行分离，滤速保持在3040 ml/min,并使膜上部分占总体积的15%左右时，停止抽滤3.4除蛋白质取膜上截留部分，按Db W:TQ= 1.0:50.01.0:80.0的比例加入DC-Vy充分搅拌20 min，室温下静置5 h,滤除沉淀。3.5沉淀按比例在滤液中加入1.5倍95%乙醇，充分搅拌后，静置过夜，虹吸 上层醇液，沉淀分别用95%乙醇、丙酮脱水2

22、次，真空干燥，得肝素 钠精品。3.6 3种方法比较（见表2）晨2 J科力注的谄穆枳料豈辰帆"悴軌£桥咁啟II ftMlll/H 製(U(U1SOD1J5SJW1» 362JT.M H2111140IS.06131 242AH.JI Jj1KU 02J23M15.012 w.ll Zf侍虜怯122SJ84214和14：2TOO2 JOyM1&.43H3.B32J6.J5 打Jmi.q2JJ163142 91237 Sb 丹人博-羸r勺撰一乙辭加能诜1woLSJQ227.0117.50那删1MJ2 方254.0IB4127.6317.22Kjs .th hi他J17 9 J26.9317SML65.M H表2表明，膜分离与沉淀结合法比盐解-离子交换-乙醇沉淀法节约乙醇85%左右，效价提高61.84 u/mg ;比膜分离法效价提高15.93u/mg。3.7活力回收试验（见表3）/I 3 IH翥軸I叫攻认鬱H也IfNi料|得屮昭黑L«I.DD17-29 S4审 167.91 h袖23Jf.141,114 ii/rai；.88 fj表3肝素钠回收试验15.0