生物技术导论

1、贵州大学2013-2014学年第二学期考试试卷生物技术导论学院： 专业： 年级（班级）： 学号： 姓名： 注意事项：1. 请考生按要求在试卷装订线内填写姓名、学号和年级专业。2. 请仔细阅读题目的要求，在规定的位置填写答案。3. 不要在试卷上乱写乱画，不要在装订线内填写无关的内容。4. 满分100分。得 分统分人 第一章 基因工程基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产

2、新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。学习目的 教学重点 1. 懂得基因工程的基本原理和操作过程; 1.基因工程的基本概念。2. 了解基因工程的发展动态。 2.基因工程的主要内容和步骤3了解基因工程的基本概念和发展历史 基因工程一、基因的含义基因概念的发展经历了3个水平： 1）染色体水平上的基因概念 2）代谢水平上的基因概念3）DNA分子水平的基因概念染色体水平上的基因概念1909年，“gene”一词首次由丹麦生物学家 约翰逊（W. Johansen）提出，用来代替Mendel的“遗传因子”。 基因最初的含义中不包含特殊的物质基础，纯粹作为一个抽象的名词使用。1925年

3、，美国遗传学家摩尔根（T. H. Morgan） 研究果蝇性状与染色体之间的关系，创立了基因学说： 基因在染色体上呈直线排列； 基因是遗传物质的基本单位和突变单位； 基因是控制性状的功能单位， 它能产生对立的表现型； 基因是染色体上的一个特定区段。 代谢水平上的基因概念美国G. W. Beadle和 E. L. Tatum （比德尔） （塔特姆）用X射线诱导的真菌突变导致特定营养缺陷，根据遗传分析和大量研究 ，他们认为基因发生突变，就可能导致酶活性的丧失。 1941年提出“一个基因一个酶”的假设。DNA分子水平的基因概念1944年，艾维瑞（O. T. Avery）和其同事将有毒型肺炎双球菌DN

4、A与无毒型肺炎双球菌一起培养，结果使无毒型肺炎双球菌转变为有毒型肺炎双球菌。其原因，就是有毒型肺炎双球菌DNA进入无毒型肺炎双球菌中，引起其遗传性状改变。 证明DNA就是遗传物质，这样就勾勒出基因概念的轮廓 染色体上的一段DNA，它可以编码一个酶的信息。1953年，沃森（J. Walson）和克里克（F. Crick）提出了DNA双螺旋结构模型，真正从分子水平揭示了基因的结构。1957年，美国分子生物学家本泽（S. Benzer）以T4噬菌体的r突变型为材料，用顺反互补测试法进行了经典的基因精细结构分析，发现基因可被分为更小的单位.提出： “一个基因一条多肽链”的概念，同时把遗传的功能单位称为

5、“顺反子”(cistron)，作为基因的同义词，这实际上就是一个基因。二：基因工程的含义在自然力量以及人的干预下，通过基因重组、基因突变、基因转移等途径，推动生物界的进化，不断使物种趋向完善，出现了今天各具特色的种类繁多的物种，（耐高温、耐寒、耐旱、耐盐等）种种生物的特殊性状成为今天定向改造生物、创造新物种的丰富遗传资源。 （基因操作、遗传工程、DNA重组技术）按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，创造出符合人们需求的生物新类型或基因产物，或者利用这种技术对人类疾病进行基因治疗等。 基因工程最突出的优点 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，

6、可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆菌中表达，细菌的基因可以转移到动植物中表达。美国科学家成功地将一种细菌细胞内的DNA转植到另一种近种细菌的细胞内，并使后者具有了类似前者的活性功能。标志着人类向人造生命的目标迈出了重要的一步。 发表于2007年6月28日科学。三、基因工程的理论依据 不同基因具有相同的物质基础 基因（gene）: 具有一定遗传效应的DNA片段。 所有生物的DNA组成和基本结构都是一样的,因此，不同生物的基因原则上是可以重组互换的DNA 是由4种脱氧核苷酸（A、T、C、G） 按照一定顺序聚合而成

7、的大分子。 遗传密码是通用的 mRNA一系列的三联密码子同氨基酸之间的对应关系， 除极少数外，在所有生物中都是相同的。 少数不通用例子 密码子 通常 例外 生物UGA终止编码 色氨酸编码 人、牛、酵母线粒体， 支原体基因组 半胱氨酸编码 一些纤毛虫核基因组AGR精氨酸编码 终止编码 大部分动物线粒体， 脊椎动物线粒体AGA精氨酸编码 丝氨酸编码 果蝇线粒体AUA异亮氨酸编码 蛋氨酸编码 一些动物和酵母线粒体UAA终止编码 谷氨酰胺编码 草履虫、 一些纤毛虫核基因组UAG终止编码 谷氨酸编码 草履虫核细胞核基因组GUG缬氨酸编码 丝氨酸编码 假丝酵母核基因组AAA赖氨酸编码 天冬氨酸编码 一些动

8、物的线粒体， 果蝇线粒体CUG亮氨酸编码 终止编码 圆柱念珠菌基因组CUN亮氨酸编码 苏氨酸编码 酵母线粒体多肽与基因之间存在对应关系现在普遍认为: 1种多肽就有1种相对应的基因。因此，基因的转移或重组 可以根据其表达产物多肽的性质来考察。 基因是可以切割的基因直线排列在DNA分子上。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列，可从DNA分子上一个一个完整地切割下来。即使是重叠排列的基因，也可以把其中需要的基因切割下来，但是破坏了其他基因。 基因的剪刀 - 限制性内切酶（限制酶）一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。1种限制酶通常识别1种特定的核苷酸序列， 并在特定的切割点

9、上将DNA分子切断,目前已发现的限制性内切酶有200多种。 EcoR V - 平末端 EcoR - 粘性末端5 基因是可以转移的 自然界中生物体内有的基因是可以在染色体上移动的，甚至可以在不同的染色体上跳跃，插入到靶DNA分子中。 基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代 经重组的基因一般来说是能遗传的， 单一显性因子 可以获得稳定的转基因生物 -自交纯合， 符合孟德尔分离规律。四 基因工程的主要内容和步骤 一、获取目的基因 二、目的基因与载体结合 三、目的基因的导入 四、转基因生物的筛选与鉴定获取目的基因基因：具有完整遗传信息的DNA片段。（启动子、编码区和终止子）目的基因在基因工程设计和操作

10、中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因称为目的基因。目的基因一般是结构基因，也就是能转录和翻译出多肽（蛋白质）的基因。目的基因获取方法：1. 酶切分离法直接分离目的基因质粒和病毒等DNA分子小，编码的基因较少，已测序的DNA分子，已克隆在载体中的目的基因，2. 利用PCR扩增目的基因 如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列，可以通过合成1对与模板DNA互补的引物，可利用PCR扩增目的基因。用适当的限制性内切酶酶切，可获得目的基因。3. 化学合成目的基因 根据某基因测定的核苷酸序列，或者根据蛋白质氨基酸序列推导的核苷酸序列，DNA合成仪自动地将游离脱氧核苷酸合成相应的基因。

11、 方法：1）磷酸二酯法将2个分别在5-或3-末端带有适当保护基团的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸。 具5保护的单核苷酸，便能够通过它的3-OH 同另一个具有3保护的单核苷酸的5-P之间定向地形成一个二酯键，从而使它们缩合成两端均被保护的2核苷酸分子。实验中使用的各种不同的保护基团，有些可以通过酸处理移去，有些则可以用碱处理移去。一端脱保护的二核苷酸分子，如带5保护的二核苷酸分子，又能够同另一个带3-保护的单核苷酸分子进行第二次缩合反应，形成一个3核甘酸分子。这样从缩合反应开始，到保护基团的消除，再进行新一轮缩合反应。如此反复进行多次，直到获得所需长度的寡聚脱氧核苷酸

12、为止。 2）亚磷酸三酯法 将所要合成的寡聚核苷酸链的3-末端先以3-OH与一个不溶性载体（多孔玻璃珠）连接，然后依次从3-5的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的。 3）寡核苷酸连接法 化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150200bp，而绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因。 T4 DNA连接酶、 或以单链DNA作为模板，由大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段催化合成。4. 通过构建基因组文库或cDNA基因文库 分离目的基因 基因组文库 把某种生物基因组的全部遗传信息（DNA）通过克隆载体贮存在一种受体菌克隆子群体之

13、中，这个群体即为这种生物的基因组文库。cDNA文库某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种 cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为cDNA文库，cDNA文库较高等的生物在特定发育阶段或特定器官表达的基因有所不同（基因的时空表达），所以用特定发育阶段或特定器官的材料构建的cDNA文库通常是部分 cDNA文库。cDNA文库的一个克隆子包含一个基因的全部编码序列，不含内含子、转录启动子和终止子的核苷酸序列，所以使用从cDNA文库中获得的目的基因时，在其两侧必须组装上转录启动子和终止子等元件。 从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因根据目的基因已知的

14、核苷酸序列制备核酸探针，对基因组文库或cDNA文库的一系列克隆子的DNA分子进行杂交，能杂交的克隆子就含有目的基因（阳性克隆子）。最直接的方法目的基因与载体结合1）能在宿主细胞内复制并稳定的保存能携带外源DNA片段（基因）进入受体细胞，或能停留在细胞质中进行自我复制；或能整合到染色体、线粒体和叶绿体DNA中，随这些 DNA同步复制。 2）具有多个限制酶切位点（多克隆位点）在克隆载体合适的位置必须含有允许外源DNA片段组入的克隆位点，并且这样的克隆位点应尽可能的多，便于多种类型末端的DNA片段的克隆。3）具有某些供选择转化子的标记基因如：氨苄青霉素抗性基因(apr或ampr)、氯霉素抗性基因(c

15、mr)、 卡那霉素抗性基因(kmr或kanr)、链霉素抗性基因(smr)、 四环素抗性基因(tcr或tetr)等， 蓝白筛选(-半乳糖苷酶基因)， 报告基因：gus (-葡萄糖苷酸酶 )、 gfp (绿色荧光蛋白基因)等。 4）克隆载体必须是安全的 不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。 目的基因与载体结合首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏

16、性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子（也叫重组质粒）。 目的基因导入受体细胞重组DNA分子只有进入适宜的受体细胞后 才能进行大量的扩增和有效的表达。原核生物细胞和真核生物细胞可作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。选择受体细胞1）便于重组DNA分子的导入；2）便于筛选克隆子；3）重组DNA分子在受体细胞内能稳定维持；4）对遗传密码的应用上无明显偏倚性；5）遗传稳定，易于扩大培养或发酵。导入扩增大肠杆菌感受态细胞的制备(实验重点)1）接种单菌落于3ml LB液体培养基中，

17、 37振荡培养12h左右（过夜）；2）将该菌悬液以1：100转接于100ml LB液体培养基中， 37振荡扩大培养至OD600值0.4-0.6；3）取培养液1.5ml转入 Eppendorf 管中，在冰上冷却10min， 4，5000rmin，离心5min 。（从这一步开始，所有操作均在冰上进行）4） 去上清培养液，用500µl 冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；4，5000rmin离心5min；5）去上清，加入200µl冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞， 冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；6）制备好的感受态细胞悬液可

18、直接用于转化实验， 也可加入占总体积14甘油，液氮速冻后， 置于-70下，可保存半年至一年。转化大肠杆菌（热激法）1）取1管大肠杆菌感受态细胞（200µl）， 加入1ng 含目的基因载体混匀；2）冰浴30-40 min；3）42 水浴热激90s；4）冰浴1-2min；5）加入800µl LB液体培养基（不含抗生素）， 37缓慢振荡（200rpm） 45-60min -恢复培养；6）取100µl LB固体培养基（含100µl/ml氨苄青霉素）涂布平板，37培养8h。改造A） 农杆菌转化法在自然条件下，农杆菌能感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位（受伤处

19、的细胞会分泌大量酚类化合物，从而使农杆菌移向这些细胞），并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌含有Ti质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生转基因植株。农杆菌介导法起初只用于双子叶植物，近年来用于一些单子叶植物（尤其是水稻）。 4、 农杆菌介导的水稻转化方法，包括下列步骤：1） 愈伤的诱导2） 继代和预培养3） 农杆菌的准备与悬浮4）

20、 共培养（共培养基：N6，脯氨酸0.4-0.8g/l，水解酪蛋白0.4-0.8g/l，麦芽糖30-35g/l， 2,4-D 1.5-2.0mg/l， pH5.5-5.7，组织培养胶 2.8-3.0g/l。 用前加100-200µM 乙酰丁香酮；）5）农杆菌的去除与过渡培养6）选择培养7）预分化与分化再生8）生根与移栽B）基因枪法由美国John C Santord 等于1983年研究成功，1987年，Vlein 首先报道了应用此技术将TMV（烟草花叶病毒）RNA吸附到钨粒表面，轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒RNA能进行复制。基因枪法 ：微弹轰击转化法利用高速运行的金属颗粒轰击细胞，将

21、包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随金属颗粒进入细胞的转化方法。现在，该技术已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、 菜豆、 洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等 多种作物上成功。 C）电激法 电穿孔转化法 利用高压电脉冲作用，使细胞膜上产生可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效导人。电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，1µg DNA可以得到10910l0个转化子。主要用于微生物细胞和动植物悬浮细胞，或原生质体的基因转化。 D）花粉管通道转化法此方法只用于植物（如拟南芥）。植物授粉过程中，将外源 DNA涂在柱头上，使DNA沿花粉管通

22、道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。此方法技术简单，易于掌握，能避免体细胞变异等优点，具有一定的应用前景。 总结基因操作的基本步骤4、 目的基因的检测1. 利用报告基因进行筛选 1）目前最常用的抗生素抗性基因是新霉素磷酸转移酶基因（NPTII），使用该基因转化植物，可以赋予转化细胞抗卡那霉素、庆大霉素、G418（一种氨基糖苷类抗生素）及新霉素的能力，因此被广泛应用于植物遗传转化中。潮霉素磷酸转移酶基因（aphIV）, 对潮霉素具有抗性；氯霉素乙酰转移酶基因（CAT），使氯霉素丧失抗菌素活性。 2）除草剂抗性基因 bar基因, 编码膦化麦黄酮乙酰转移酶（

23、PAT），GUS染色使PPT（膦化麦黄铜）的自由氨基乙酰化而对PPT解毒，抗除草剂草丁膦和双丙氨膦。3）显色或发光报告基因常用的报告基因是-葡萄糖苷酶（GUS）基因GUS基因，编码-葡萄糖苷酸酶，在适宜条件下可将5-溴-4-氯-3-吲哚-D葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）水解生成蓝色物质。将被测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温，若组织、细胞、原生质体发生了gus基因转化，表达出GUS， 重组质粒的蓝白斑筛选具有GUS活性的部位呈现蓝色。绿色荧光蛋白检测GFP产生绿色荧光蛋白，在395nm和490nm的波长下发出独特的绿色荧光。细菌克隆子 蓝白斑筛选野生型大肠杆菌产生-半乳糖苷酶将X-gal（5-溴

24、-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，使菌落呈蓝色， 而转化子破化了此酶，菌斑显示白色，固体培养基中加入x-gal（5-溴4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）和 IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷 - 激活-半乳糖苷酶的启动子） 。PCR的扩增步骤一个典型的扩增循环包括3个环节。预变性：一般在94，5min，使模板热变性，由双链转变为单链。循环扩增：又分为变性、退火和延伸三个阶段，一般循环进行25-35次： 变性：一般在94，30s至1min，使模板（上一个循环的扩增产物）转变为单链。 退火：一般在50-65保温30s至1min，使引物与目的DNA区段完成碱

25、基互补配对，以引导随后的DNA合成和链延伸。 延伸：一般在72，保温30s至数min，让Taq酶在其最适活性下完成目的片段的新链合成，其时间长短由扩增目的片段的长度而定，常规Taq酶按每1kb/1分钟计算。 1 2 3 4 5最后延伸：一般在上述循环完成后还需在72保温3-10分种，其目的是继续完成从前未合成到头的DNA链的合成。 PCR analysis of transgenic lettuce plants 1. DL 2000 marker（ladder）;2. non-transgenic lettuce as a negative control; （阴性对照）3,4. trans

26、genic lettuce;5. sCT gene as a positive control; （阳性对照）四、基因工程的应用基因工程技术已经在医学、工农业和环境保护等各个领域得到了广泛的应用。（1） 、基因工程与医药卫生生产基因药品基因诊断与基因治疗1. 基因工程药品的生产 基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因分离，经过一系列基因操作， 干扰素分子结构最后将该基因转入可以大量生产的受体细胞中去，（细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞）在受体细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病的蛋白质，即基因疫苗或药物。 1） 重组

27、乙肝疫苗2） 基因工程胰岛素3） 基因工程药品 干扰素4） 基因工程人干扰素-2b（安达芬）5） 基因工程药品 - 生长激素6） 其它基因工程药物2. 基因诊断和治疗也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。探针制备：放射性同位素（如32P）、地高新、荧光分子等标记的DNA分子； 原理：利用DNA分子杂交原理。2、 基因工程与农牧业、食品工业运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。1. 转基因动物将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中，从而形成在体内表达外源基因的动物，称为转基因动物。转基因动物首先在小鼠获得成功。（1982年）基因转移方法据据外源基因导入的方法和对象的不同，主要有：显微注射法、反转录病毒法将外源基因DNA插入反转录病毒载体，通过辅助细胞包装成高感染度的病毒颗粒，感染胚胎。胚胎干细胞（embryonic stem cell）法、电脉冲法、精子载体导入法利用精子作为外源基因载体，借助受精作用把外源綦因导人受精卵，整合到受精卵的基因组中等。 转基因动物的应用转基因动物的应用1）生命现象的基础理论研究 发育生物学的研究 如，观察目的基因在胚胎不同发育阶段的特异性表达、关闭及调控机制， 了解调控顺序（如增强