生化实验报告1

1、生物化学实验报告姓 名： 张雪 学 号： 1120011012 专业年级： 2012级临床医学八年制 组 别： 第二实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称(Title of Experimetn)氨基酸的薄层分析实验日期(Date of Experiment)2014-04-17实验地点(Lab No.)第二实验室合作者(Partner)胡云腾指导老师(Instructor)王妮莎总分(Total Score)XX教师签名(Signature)李某某批改日期(Date)2013-06-03【实验报告第一部分（预习报告内容）：实验原理、实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）

2、、实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】Ø 实验原理：层析技术是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的的一种技术，在现代分子生物学中广泛应用。进行层析时有固相层析（以气体为流动相的层析法）和液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学领域里常用的方法）两种，本次氨基酸的分离与鉴别所用的薄层分析法是液相分析的一种，薄层层析法一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同

3、氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）。茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原，此产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。Ø 实验材料：

4、吸附剂：硅胶粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠 氨基酸的异丙醇溶液: 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）分析样品：氨基酸混合液层析板、尺子、铅笔、烧杯、量筒、喷雾器、吹风机、毛细管、层析缸、药匙、烘烤箱1、位置：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距1cm。2、用毛细管分别吸取氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。3、加样后原点扩散直径不超过2mm。4、待点样点干后再重复点一次。用热风吹干或在85下烘干，即可显出各层斑点。将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出

5、薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线。1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然晾干。 4、活化 70烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。点样层析显色制板Ø 实验步骤：注意事项：玻璃板要洗干净，擦干； 重复点样时，必须等第一点样品干后再点第二点； 点样样品量要适中，斑点直径一般为0.2cm；样点不能浸入到溶液中； 制好的层析板要防止被污染，不能用手接触。【实验报告第二部分（实验记录）：主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点

6、中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；原始实验数据。评分（满分20分）：XX】Ø 实验条件：用10ml量筒量取8ml0.5%的羧甲基纤维素钠注入小烧杯中，用托盘天平量取3g硅胶，慢慢倒入小烧杯中，倒的时候要防止硅胶粉末飞溅所以一定要慢慢倒；用药匙轻轻搅拌，直到成为没有块状物的糊状，迅速将糊状物平铺在玻璃板上，为防止糊状物干掉所以应迅速；用药匙尽量将糊状物铺平，如果不平整将导致固相支持物薄厚不一，影响氨基酸前进速度，用手轻摇玻璃板使糊状物成为表面平整均一的膜；晾干尽量不用风吹，因为如果风吹得不均匀将导致

7、硅胶涂层干的速度不一样表面产生斑痕；放到烘箱里活化至涂层完全变干，大概需要30分钟左右；用铅笔在距玻璃板底边2cm处画一条线，注意要轻，不能让笔尖彻底划破涂层；用毛细管在涂层画线的地方点样，样点要有一定距离，大概1cm，样点直径不超过2mm，防止样点交叉或拖尾；将薄层板点样一端浸入展层-显色剂，要防止将样点接触展层-显色剂，以免氨基酸溶解在其中；当展层剂蔓延至超过玻璃板中线后，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界限；将薄板重新放入烘箱再次烘干，至薄板上显出各层斑点。实验现象：薄板上出现5处粉紫色的椭圆形斑点。 溶剂前沿 55cm 5.4cm 3cm 3cm 2.3cm 1.1cm 1.1cm Ala

8、 Arg Gly 混合液原始实验数据：样品斑点-原点溶剂前缘-原点Ala3cm5.5cmArg1.1cm5.5cmGly2.3cm5.4cm混合点11.1cm5.5cm混合点23cm5.5cm【实验报告第三部分（结果与讨论）：结果（定量实验包括计算）：应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果；讨论：不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。结论：简单扼要，说明本次实验所获得的结果。（包括思考题）。评分（满分45分）：XX】Ø 实验结果：样品AlaArgGly混合点1混合点2Rf值0.5450.2000.4260.2000

9、.545Ø 讨论：Rf值和被测物质极性、展开剂极性有关，也和固相吸附剂的吸附能力、洗脱剂的洗脱能力有关。相同条件下Rf值相同，说明两种物质成分相同。察发现混合氨基酸溶液形成的两个斑点与Ala和Arg溶液形成的斑点前进的距离一致，且计算求得Rf值相同，所以混合氨基酸中可能含有Ala，Arg两种氨基酸。Ø 结论：混合氨基酸中可能含有Ala，Arg两种氨基酸。硅胶的吸附力与含水量的问题硅胶吸附剂是粉末状多孔固体，其起到吸附作用的基团是硅醇基上的羟基(吸附中心)，这些羟基所处的形态不同，其吸附能力也不同。为了增强硅胶的吸附力，应该增加吸附剂的活泼型结构单元。因此，如果将硅胶煅烧使其完全脱水，则硅胶的硅羟基完全被破坏而减甚至没有吸附能力;如果硅胶中加入大量的水分，附力也将减小，这是因为硅羟基与水形成了太多的氢键从而降低了其活泼型比例。吸附实验中吸附剂的选择根据薄层层析用的吸附剂如氧化铝和硅胶颗粒大小一般以通过200目左右筛孔为宜，如