生物选修3知识总结

1、 实验1 大肠杆菌的培养和分离 一、大肠杆菌 细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。（由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。） 大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置 微生物生命活动过程中需要

2、的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： 1称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 2溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒

3、搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 5倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。 倒过来放置的目的是防

4、止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。 三、灭菌和消毒 1无菌技术：对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 2消毒方法：日常生活经常用到的是煮沸消毒法；对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法（貌似光明牛奶用的就是巴氏消毒法）；对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；

5、实验操作者的双手使用酒精进行消毒。 3灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。 4.消毒与灭菌的区别：消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。5 注意事项：实验中用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。灭菌后，通常在6080烘箱中除去灭菌时的水分；物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的

6、是有利于锅内温度升高，随后关闭排气阀继续加热，加热结束切断热源后，要使温度自然降低，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防止容器中的液体暴沸；在用任何器皿转接时，瓶塞和封口膜只能夹在手上，不许放在台面上，接种时要在酒精灯火焰旁操作（这次的1B貌似也涉及了，很重要哦）；培养基一定不能沾在三角瓶口、试管管口和培养皿壁上，否则容易污染；接种时要胆大心细，动作快捷，这是减少污染的关键；接种后，培养皿必须倒放（盖在下方）在恒温培养箱中，如正放则水蒸气在盖上凝成水滴，滴到接种后的培养基表面，水流扩散会使菌落扩散，就很难形成单菌落了。 6 四、细菌的分离 1划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿

7、平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养1020h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。（有些类似于用毛笔写字，写着写着墨汁会变少变淡，只不过接种环的“毛”硬了些，“墨汁”更有“活力”些哈）其操作步骤是：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 35条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，

8、通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置（防止污染，倒平板那儿有解释的。）于恒温箱培养。 取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。 2涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到105 107

9、之间，然后取0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。 划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点,都可采用。 实验 2 分离以尿素为唯一氮源的微生物 1.本实验的内容是从土壤中分离出能利用尿素的细菌。（所以要用到选择培养基。利用这些细菌能将尿素降解作为其生长氮源这一特性，即尿素和水在脲酶的作用下能转化成氨气和二氧化碳，氨气是它们要利用的物质。因而，对于这些微生

10、物来说，以尿素为唯一氮源的培养基就是选择培养基了解释起来好麻烦）2培养基对微生物的选择作用：选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。    一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的，例如，利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物；利用以蛋白质作为唯一氮源的选择培养基，可以分离产胞外蛋白酶的微生物；缺乏氮

11、源的选择培养基可用来分离自生固氮微生物。另一类选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物，例如，在培养基中加人数滴10酚可以抑制细菌和霉菌的生长，从而由混杂的微生物群体中分离出放线菌；在培养基中加入青霉素、四环素或链霉素，可以抑制细菌和放线菌生长，而将酵母菌和霉菌分离出来；在培养基中加入75NaCl，可将耐高浓度NaCl的金黄色葡萄球菌分离出来。 实验 4 果汁中的果胶和果胶酶（这个实验特别简单，也没什么要记的）1. 果汁的制作原理：果胶酶水解果胶 2. 果胶酶的影响因素：温度，酸碱度等实验 6 阿尔法淀粉酶的固定化及淀

12、粉水解作用的检测 一、酶和固定化酶1酶：酶是生物体内催化各种反应的催化剂。酶作为催化剂与一般的催化剂有共同特点：用量少而催化效率高；不改变化学反应的平衡点，酶本身在反应前后也不发生变化；可降低反应的活化能。酶作为生物催化剂的特性有：催化效率高；有高度的专一性；易失活等。通常情况下酶都是在水溶液中催化底物反应，因此酶在反应系统中是与底物、产物混在一起的，反应结束后，即使仍有较高活力，也很难再回收利用。另外，在水溶液中起作用的酶也给产物进一步分离纯化带来了一定困难。2固定化酶：固定化酶又称固相酶、水不溶性酶，它是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。&

13、#160;固定化酶与游离酶相比不但稳定性好，而且与底物和产物容易分离，且易于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于自动化生产。因此，固定化酶在工业、医学和生化分析等方面的应用发展较快。直接使用酶和固定化酶催化的优缺点比较类型优点不足直接使用酶催化效率高，低耗能、低污染等。对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。使用固定化酶酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的。二、固定化酶的制作原

14、理酶固定化方法由酶的性质和载体特性所决定，主要包括：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。（如果选生物的话，要记住！）1吸附法：有物理吸附法和离子交换法两种。物理吸附法是将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上，但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，对蛋白质有高度吸附能力的有机硅胶、活性碳和石英砂等。离子交换法是利用蛋白质的两性性质，使其带有电荷的基团与离子交换剂形成离子键，而被交换结合至交换剂上。2共价偶联法（载体偶联法）：酶蛋白的一些基团，包括羧基末端、氨基末端等，在温和的条件下能与载体共价结合，从而被固定。但结合的部位必须不是酶的活性中心，也不是维持其空间结构的必需基团。这种结合稳定性好，酶

15、不易脱落，可使用较长时间。3交联法：是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法，交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。4包埋法：是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊 三、淀粉水解产物的检测三、淀粉水解产物的检测淀粉糊精麦芽糖葡萄糖淀粉酶淀粉酶 糖化淀粉酶淀粉酶只将淀粉水解为糊精。淀粉溶液加入KII2指示剂溶液时显现蓝色，而转变成糊精后显现红色。如果将吸附淀粉酶的石英砂装柱，使淀粉溶液通过柱时，柱的流出液在加入KII2指示剂时可看到溶液呈现暗红色。如何证明洗涤固定化淀粉酶柱的流出液

16、中没有淀粉酶?可在试管中加入1ml可溶性淀粉溶液，再加入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住试管增加温度，几分钟后加12滴KII2指示剂，如仍显蓝色，即流出液中没有淀粉酶了。用固定在石英砂上的淀粉酶柱再作用于淀粉溶液，使其自柱中流出，作用的结果才能表明是淀粉酶的固相酶作用的结果。耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途?在实际生产中，总希望反应的时间愈短愈好，这就要提高反应温度。通常生产上淀粉酶是一次性使用的，加温虽在短时间内会使酶变性失活，但没有关系，只要使淀粉在短时间内水解即可。寻找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下使淀粉水解快，而且酶不会因高温而在短时间内变性。在发酵生产中使用的往往是植物淀粉，如青霉

17、素发酵、丙酮一丁醇发酵、乙醇发酵（生产啤酒）等都要水解淀粉。所以耐高温淀粉酶用途广泛。 实验 8 果酒与果醋的制作 顺带捎上实验 10 的前半部分一 、与传统发酵有关的几类微生物的比较（制腐乳已经不要求了，与毛酶、腐乳有关的了解一下就好）酵母菌醋酸菌毛霉乳酸菌生活方式异养兼性厌氧异养需氧异养需氧异养厌氧适宜温度20左右30351518室温主要用途酿酒、发酵酿醋制作腐乳制作酸奶、泡菜2、 果酒、果醋、腐乳及泡菜的制作原理及过程果酒和果醋的制作腐乳的制作泡菜的制作主要菌种果酒：酵母菌 果醋：醋酸菌毛霉等乳酸菌原理1、 原理：酵母菌无氧呼吸2、 果醋：醋酸菌有氧呼吸（1） 当氧气、糖源都充足时，糖醋

18、酸（2） 当缺少糖源时，乙醇乙醛醋酸毛霉等微生物能产生蛋白酶和脂肪酶，作用如下：（1）蛋白质在蛋白酶的作用下，被水解为肽、氨基酸（2）脂肪在脂肪酶的作用下，被水解为甘油+脂肪酸乳酸菌发酵产生乳酸实验流程挑选葡萄冲洗榨汁 酒精发酵果酒 醋酸发酵果醋让豆腐上长出毛霉 加盐腌制加卤汤瓶密封腌制原料加工 加盐修整、洗涤、 盐水冷却晾晒，切分成 条状或片状 泡菜盐水 加调味料装坛发酵成品注意的问题1、材料的选择与处理2、防止发酵液被污染3、控制好发酵的条件1、控制好材料的用量2、防止杂菌污染1、泡菜坛的选择2、腌制的条件 实验 10 亚硝酸盐的测定（后半部分）一、 亚硝酸盐：泡菜含较多亚硝酸盐，有致癌作

19、用，危害身体健康，所以不宜多吃。 亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，亚硝酸钠为白色至淡黄色粉末或颗粒状，味微咸，易溶于水。常用于食品加工业中的发色剂和防腐剂，在腌制肉制品、泡菜及变质的蔬菜含量较高。它会使血液中正常携氧的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白。食入0.30.5克的亚硝酸盐即可引起中毒甚至死亡。二、亚硝酸盐的测定：1、测定亚硝酸盐含量的原理在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，再与N-1萘基乙二胺偶联，形成玫瑰红溶液。将经过反应显色后的待测样品与标准液比色，即可计算出样品中的亚硝酸盐含量。2、材料泡菜、氯化铵缓冲液、硫酸锌溶液、氢氧化钠溶液、对氨基苯磺酸溶液、 N-1萘基乙二胺溶液、亚硝酸钠标准溶液 3、测定 取10ml样