腺病毒的一些常见问题及解答----整理自丁香园

1、汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！1 .目前,对于基因治疗的载体选择,很难有一个统一的结论,文章也很多,我将在如下给出.本人认为,无论选择哪种载体,关键在于此载体在局部的表达效率.无论是采用INVIVO或者EXVIVO的方法,由于我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因,并且使其具有一定的作用.而对于载体的副作用,目前较为公认的就是病毒载体转染效率高,但副作用大；质粒载体毒性小,但转染效率比拟低.同时,对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体,pEGFPpDsRedpEYFP和pECFP等：这些载体如果用于细胞水平的检测,也许会更加的方便、直观,但是,如果用于体内的

2、基因治疗,那就不是一个理想的载体了.而传统的表达载体如INVITROGEN司的pCDN曦体系歹U,会更好一些.同时,为了获得更加高效的表达,一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体,以增加外源基因的分泌表达.正如一个疾病的治疗一样,治疗的方法越多,就证实还没有一个最有效地治疗手段.基因治疗的载体也是同样,很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点.以上是本人的一点愚见,还请各位同道指正.2.转染过小鼠肝癌细胞H22,请赐教：用什么方法可以到达最正确效果,脂质体、电转还是重组病毒如果用脂质体,哪家的最好H22细胞为悬浮细胞,用病毒逆转录病毒和腺病毒最为理想,一是转染效率高,二是不用筛选直接

3、用于实验.但逆转录病毒的转染效率并不能到达100%且影响因素多,而腺病毒感染效率高,几乎可达100%但只能短期表达710天,随着细胞传代,外源基因会逐渐丧失.当然,H22也可用脂质体进行转染,筛选应在96孔板上进行,由于培养液少、细胞相对静止,两周后可见细胞克隆生长,在倒置显微镜下用吸管吸取克隆,进行扩大培养.3.重组腺病毒作基因治疗,由于不是很了解,用AdEasy系统可以吗具体的实验步骤是来自什么地方主要细胞及试剂的来源.BIOgene公司有整个系统,从质粒到细胞都有,我AdEasy的根本原理请参阅文献19984.以腺病毒为载体做肿瘤细胞的基因转染,查文献,病毒滴度测定用噬斑法,但所用细胞不

4、统一,是否有统一规定就用肿瘤细胞来测行吗只有能反式提供E1的细胞才能用来测腺病毒滴度,一般用HEK293细胞,用肿瘤细胞肯定不能形成噬斑.1腺病毒E1区有转化细胞水平,出于平安性的考虑,也是为了增加载体的包装容量,现在通行的腺病毒载体是E1区缺失的.2由于E1区是复制必需区,所以需要包装细月系反式提供E1蛋白,这种细胞系最常见的就是293系列和911细胞.3病毒感染性滴度的测定方法有几种.一般是通过噬斑记数来测定的,所以需要能够支持病变的细胞基质.如果你的病毒带有荧光或颜色标记,可以用一般的细胞系进行滴度测定,前提是病毒可以感染这种细胞.5 .腺病毒主要通过CAR介导感染细胞,感染效率不仅和M

5、OI有关,而且与靶细胞外表的CA裱达量相关,例如对于单核细胞,由于CA裱达量很低,无论MOI有多高,感染率都很低；但对于其他多种细胞类型,腺病毒介导的基因转染效率都很高.而对于脂质体介导的转染来说,脂质体和基因载体的用量都有一定的限制,超量使用对细胞的毒性很明显.我个人认为这两种方法的可比性不强,而且后者在大多数情况下转染效率低于前者.“腺病毒的转染效率主要取决于靶细胞外表的CAR表达水平和感染时所选定的MOI的含义是什么外壳蛋白未经过改造的腺病毒载体对细胞的有效感染需要细胞膜上表达有两个必要的受体,即负责腺病毒与细胞粘附接触的柯萨奇腺病毒受体CAR和负责将腺病毒内化的整合素型受体aV03、a

6、V05或aW01.上述所说应该是5型Ad属于A组腺病毒.对于B组腺病毒如Ad35,其细胞受体是CD46在人的所有体细胞外表都有该受体.所以35型腺病毒可以感染几乎所有的人的体细胞.AGTC司新近推出的Ad5F35载体是将Ad5的Fiber改造成Ad35的Fiber.因此,将会对许多研究者开展干细胞、Da田胞或其它Ad5难以转导的细胞的基因转移研究有很大帮助.MOI是病毒浓度的单位.1个MOI定义为参加到细胞中的病毒颗粒数,即理论上一个细胞中转入一个病毒颗粒.6 .腺病毒的保存方法是什么温度应是-20、70、80c要不要加保护液,例如甘油什么的做体外实验要不要纯化腺病毒越低保存时间越久.要不要加

7、保护液,例如甘油什么的可以不要.做体外实验要不要纯化腺病毒根据需要一般如果在10e10以上可以不用.80C,10%找由保存即可.腺病毒没有那么娇,关键看何时要用,4度冰箱可放置13月,20度可保存12年,止匕外,体外的滴度要求不高,无需纯化,但滴度还是要测的.而体内一定要纯化至高滴度,一般是在超滤下完成.每次超滤要损失80%,工作量很大哦.8.用脂质体转染293需7-10天,在这期间要从板分到瓶,可不可以用胰酶消化用脂质体转染293细胞是只需要一天时间,一般是先将生长状态较好的细胞约5070%专入一新瓶,约1224小时,用100ulHBS+10ul脂质体,混合,最好用聚丙已烯管,另外一管用10

8、0ulHBS+10ulDNA混合,然后两者作用10-15分钟,用来转染293,293先用无血清DMEMt洗二次,预防细胞悬浮,参加2ml左右无血清培养基,再缓慢参加上面的混合液,12小时左右,换含10加清的DMEM一般几天后,培养基消耗尽后应换液,也可以从板分到瓶,或是从小瓶分入大瓶,但绝对不可以用胰酶消化.9.转染后收病毒时,只取293细胞弃上清进行冻融还是连培养上清和细胞一起要呢我的实验是等细胞出现50溢右CPE后,一般要传至2-3代才能成功,上清液我通过PCR等实验后,发现并没有病毒释放,所以还是直接1000g,5min,离心,参加1ml左右PBS分入eppendorf,再进行冻融,34

9、次后,离心,再转染新的293,10.转染48小时后分板时,由于没用酶,简直吹不下来,吹下来的也成团的厉害,怎么处理直接不在25CM漪中,过上7天左右,当中换液,分板的话不能用酶,293细胞应该比拟好吹的,如在75CM2中那么相对难吹.收病毒的时候都是细胞有CPE好多上浮,随便吹就可以.11 .腺病毒质粒含GFP并专染293后有少量荧光出现,再感染扩增后看得到293有病毒感染的变化,但是没观察到荧光,是本身转染失败了,还是仅GFP丧失呢会不会有病毒产生却没GFP呢可能是应用了AdEasy腺病毒系统,即是第一代非增殖腺病毒系统之一.这一类腺病毒通常是E1缺失伴有E3缺失,它在293中增殖需要293

10、中E1区的功能,同时它可能与293中E1区发生同源重组,从而产生野生型腺病毒.由于野生型腺病毒在293的增殖水平通常大于AdEasy腺病毒系统,因此随着病毒传代次数增加,其野生型腺病毒越来越多,需要带有目的基因的AdEasy腺病毒越来越少,就可能出现上述情况.检查是否出现野生型腺病毒,可用E1内设一对引物,如阳性,即出现野生型腺病毒.亦可以将病毒接MOI=1感染Hela细胞,如出现病变,即出现野生型腺病毒.E1缺失的腺病毒在不表达E1的Hela细胞上是不扩增的,而野生型腺病毒可以扩增,从而产生病毒病变斑.我想选moi=1的目的是预防E1缺失的腺病毒滴度过高,产生细胞病变,影响观察.当然不一定为

11、1,低一点好些.12.1.构建目的基因的腺病毒AdEasy-1用PacI酶切后,转染293细胞,293细胞的融合度是多少时合适70-80%13 .为什么转染后需要孵育7-10天才能行病毒增殖需要时间14 .如果不到7天293细胞就出现了CPE怎么办可以挑克隆坚决15 .如何测定病毒滴度哪种方法更好些TCID50法或空斑法16 .如何计算需要扩增病毒的量产量大概是1E4PFU/CELL17.一个重组腺病毒载体,用293细胞扩增,但参加病毒好几天后,细胞还在长,也没有观察到CPE勺出现,最有可能是什么原因细胞应为HEK293请确认不是293T;是重组病毒还是重组病毒载体前者可以直接扩增,后者因系统

12、不同需要共转染或转染HEK293获得重组病毒；在细胞密度较大的情况下,CPE出现要晚一些；病毒滴度,这要问提供者；18 .何为AdEasy是一种利用细菌进行重组的腺病毒系统,相对于早期在293细胞中重组的腺病毒系统而言,它具有操作简单,重组成功率较高、 重组时间较短而被人们广泛应用.但随着对该系统的广泛应用,该系统存在着明显缺陷,首先应用该系统获得重组腺病毒通常病毒滴度较低,我们曾经应用该系统重组了十多个腺病毒,随一个腺病毒滴度较高外,其它腺病毒滴度在2-10 x10E8/75cm2瓶子,明显低于其它腺病毒系统重组系统.其次该系统采用humanCMVpomoter,使其目的基因的表达量特别是动

13、物体内明显低于Micobix公司及新基因网站中的采用mouseCMVpomoter.再次,该系统相对Micobix公司、新基因网站的Cre-Loxp及Clontech的Adeno-X的腺病重组系统而言,操作过于复杂,重组成功率低、重组时间较长.当然AdEasy还有一些优势,如它可同时携带EGFP以便于检测.AdEasy的缺点并不在于其复杂,实际上对于一般的分子生物学实验室而言,经过改良的AdEasy重组方法的技术难度为0.如楼上所说,AdEasy病毒滴度常常上不去而腺病毒载体的主要优点之一就是易于制备高滴度病毒,这主要是由于其利用的是细菌内重组,远不如细胞内重组严格,导致腺病毒的基因组序列常会

14、发生一些突变,从而影响病毒的复制功能.因此,我更倾向于在包装细胞系内利用位点特异性重组如Cre-Loxp等方法获得重组腺病毒.19 .目前关于适宜载体的选择,是决定基因治疗是否有效的关键因素之一.一般来说,载体的选择主要从以下方面考虑：转移目的基因所要表达时间的长短,靶细胞的分裂期,靶细胞的类型,转移目的基因的大小,载体是否引起机体的免疫反响以及是否具有毒副作用,载体是否可以屡次导入体内,构建载体的难易程度,载体转移系统的有效性和可行性,载体的平安性和目的基因的可调节性基因治疗的载体分为非病毒载体和病毒载体.非病毒载体主要包括裸质粒、基因枪、阳离子脂质体-DNA复合物,DNA配体复合物等方法.

15、但更常用的是病毒载体,常用的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒和腺相关病毒,其中逆转录病毒介导的基因转移具有高效、能整合及拷贝数恒定等优点,但只能感染分裂复制的细胞,因而对高度分化而不分裂的细胞就难以实施基因转移,同时在辅助细胞中有可能同源重组成野生型病毒,引起细胞恶性转化.另外,逆转录病毒介导的基因转移多属于exvivo方式,需将靶细胞从体内取出,进行基因修饰,然后移植到体内,技术要求高,操作复杂.腺病毒具有高滴度、高感染性等优点,但腺病毒不能将外源基因整合到细胞染色体,它所介导的基因只能在细胞内暂时表达,腺病毒的基因组比拟大,在转移外源基因的同时也表达大量病毒蛋白,机体很可能识别这些

16、病毒蛋白质,并将受感染的细胞杀灭,所以,腺病毒不能使外源基因在体内长期有效表达.腺相关病毒载体具有具有转染效率高、表达稳定、表达持续时间长等优点成为目前基因治疗领域中倍受瞩目的载体之一.但是腺相关病毒载体具有基因表达明显的“滞后性“,对于要求目的基因转移后就产生即刻效果来说,还存在一定的问题.所以,寻找一种适宜的载体用于基因治疗,是非常关键的.欢送大家都基因治疗的载体做一讨论.能否寻找一种能够整合到基因组,表达持续稳定,感染分裂期和非分裂期细胞,而且引起机体的免疫反响小,转染后介导目的基因即刻、持续稳定表达.质粒也是很好的载体,尽管它的转染率较低但没有病毒载体的毒副反响.AAV理论上是比拟好的

17、载体,但最近研究发现它同样存在抗原性和炎性反响,同时有研究发现它能诱导肿瘤发生20 .腺病毒最大的缺点就是引起机体的免疫反响比拟强,所以导致了目的基因不能长期表达.目前腺相关病毒载体是比拟好的一种载体,引起机体的免疫反响稍微,而且可以转染分裂期和非分裂期细胞,可以整合到染色体基因组中,但是目的基因表达有明显的滞后性,而且包装容量有限,目的基因的大小不能超过.21.请问在制备腺病毒的过程中为什么要用琼脂糖覆盖细胞有些外文的实验手册中并未提到此问题.不做此步骤行不行对琼脂糖有没有特殊要求1在实验中预防交叉感染,在观察空斑时比拟方便.不盖胶,染色会使细胞脱落,病毒丧失,当然了也不能单克隆化.2可以不

18、做,但有一定的条件,比方采用在细菌内重组的pAd-easy系统或者Microbix的AdMaxKitD系统等.一定要使用低熔点琼脂糖,否那么凝固太快,而且挑斑时也不方便.操作要轻柔.LMA买来后要做一下盖顶预实验,预防对细胞有毒性.最好买优质的,1克能用很屡次了.1配置1%勺低熔点琼脂糖,高压消毒备用；2配置2X高糖DMEMI养液,含10喇血清或新生牛血清；3转染后6-8小时,更换完全培养液,12小时或overnight后进行盖顶.(1)将1%LMA热至80度,2XDME丽热至37度；(2)取快速等量混匀,待温度适中时即不烫手时以每孔2ml参加六孔板,注意一定要贴壁加,预防将细胞吹起；(3)置

19、4度10分钟使之凝固后,放回培养箱.4定期观察,必要时可在胶上再次盖顶或加培养液,注意不能破坏第一次的盖顶胶22.什么是MOItest在培养的细胞中参加不同体积或(不同稀木!倍数)的病毒上清,三天后观测CPE的发生,如果所有细胞发生CPE,即MOI为1020.当然这些是从文献中获知,且MOI也只是一个估计值,具体准确的计算方法如何对于转染了含GFP的腺病毒是否可以通过计算转染率获得MOI另外在做这一步实验时,对于细胞的集合程度是否有要求MOI指numberofviruspercell,所以要对病毒滴度做准确测定.测滴度,有三种方法：空斑形成实验、终点稀释实验和OD260前两种测的是有感染水平的

20、病毒颗粒,而OD26混用物理方法测定病毒颗粒浓度,测定前须对病毒粗提液进行纯化,结果包含无感染水平的病毒.对于不同的细胞,相同的MOI到达的转染率不同,主要是细胞外表CAR!达水平不同所致.23 .在过去两年中,研究去除对腺病毒本身的受体科萨奇腺病毒受体的靶向而转而靶向某和细胞或组织特异性受体的靶向腺病毒体取得了明显进展目标是.1使腺病毒特异性感染目的靶器官,用最低剂量获得最大疗效,2通过减低腺病毒载体同网状内皮系统作用,最大限度减少降低天然免疫反响.3潜在阻止中和抗体对腺病毒载体的中和作用.靶向腺病毒另一作用是使靶向腺病毒能有效转染某些腺病毒受体科萨奇腺病毒受体低表达的细胞株.去除针对腺病毒

21、本身受体科萨奇腺病毒受体的靶向的最直接的方法是用带有其他种属外壳的人血清型假型病毒载体或直接应用非人类血清型的腺病毒载体.这种方法能预防体内已经存在的腺病毒中和抗体来中和腺病毒载体.其他靶向方法可分为两类,一类是通过基因改造尤其是改造纤毛蛋白和纤毛蛋白结来改造病毒外壳.另一类靶向方法是通过一个既能结合腺病毒载体又能结合特异性受体的双功能中间物体来介导.腺病毒载体的基因改造重新靶向包括通过突变或删除科萨奇腺病毒受体-结合序列来去除腺病毒正常的结合水平,插入外源序列至纤毛蛋白结合环中来重新靶向载体至所选择的细胞株中.这种方法可行性已经在识别位于三个分岔的科萨奇腺病毒结合点旁保守区域得到了证实.但纤

22、维蛋白结合点如此复杂,以至于改造可能使纤维蛋白体不能三聚化而导致不稳定,从而使改造载体无功能.因此,一种改良的方法是全部删除病毒纤维蛋白结局部,用一个使无纤维蛋白三聚化和特异性结合靶细胞的双功能基因替代它.这些方法已广泛实验,包括在内皮细胞、平滑肌细胞、大脑毛细床、分泌滑液细胞、肿瘤细胞内呈现出有效的转导率3个数量级提升.靶向整合素精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽位点基因改造腺病毒载体I期临床试验正在治疗卵巢癌、复发性口腔癌.去除腺病毒载体天然亲和力需要包装开展细胞株,纤维蛋白结改造限于大约30个氨基酸.尽管有这些局限性和额外复杂性,这种单组分腺病毒载体比由载体、 靶向配体以及载体结合配体的双组分

23、腺病毒载体在产量和临床应用方面有直接的优势.两组分腺病毒载体的优势在于可靶向多种受体,不需要对载体进行基因改造.两组分载体最常见的方法是应用是双特异性功能抗体,双特异性功能抗体一方面针对纤维蛋白,另一方面针对细胞受体,如在肿瘤细胞表达的受体,或肿瘤血管生成区域上调的细胞外表抗原受体.这种方法通常被用来提供某一假定靶向配体存在的证据.除了上述病毒颗粒靶向方法外,应用组织特异性启动子可使基因在特异性组织中转录.这种方法不能阻止载体同网状内皮系统相互作用,但它在肌肉组织或肝脏特异性表达带来了意想不到的好处,没有检测到针对外源转基因的抗体反响,这些转基因表达延长.在腺病毒载体靶向领域,仅仅有一局部研究

24、最近发表,显然,这些努力将会促进这领域开展.体内全面评价载体改造非常重要,例如,最近Smith等报告仅仅突变在纤维蛋白结合点科萨奇腺病毒受体结合位点来重新靶向诱导是不够的.这些研究者突变了5型腺病毒纤维蛋白科萨奇腺病毒受体结合位点仅仅发现在小鼠肝脏内转染率增加了.这种结果可能非依赖于科萨奇腺病毒受体而是与硫化葡聚糖肝磷脂途径有关,这可能对现在接受的细胞进入途径提出疑问24.要从细胞中用RT-PCRT增出某基因,然后将其转入腺病毒载体,构建携带此基因的重组腺病毒载体.在使用软件设计引物时,怎样才能使扩增出来的全长能接到腺病毒上如何构建携带外源基因的重组腺病毒载体1.首先在GENEBANK查到你要做的东东的序列2.根据查出的全长序列