辛伐他丁减少Connexin43表达和兔粥样硬化斑块形成

1、辛伐他丁减少Connexin43表达和兔粥样硬化斑块形成作者：李建军，林宏，李柱一，李宏增【关键词】动脉粥样硬化Simvastat in reduces Connexin43 exp ressi on and in hibits rabbit atherosclerotic lesi on formati on【Abstract 】 AIM: To dem on strate that simvastati n can in flue neeatherosclerotic p laque formati on and stability by decreas ing the exp ressi

2、 on of gap jun ctio n p rotein connexin43 (Cx43) in atherosclerotic lesi ons. METHODS:The role of Cx43 in atheroge nesis was exam ined by ap harmacological app roach. The rabbit model of atheroge nesis was established by a highcholesterol diet. The expression of connexin 43 and macro phages in vivo

3、was determ ined by immun ohistochemistry and the expression of connexin 43 in cultured smooth muscle cells was determined with Western blot. The quantity of connexin43 expression was analyzed with puter images. RESULTS: We observed that HMGCoA reductase in hibitors, or “statins ” , lipidlowering dru

4、gs well known for their pleiotropic an tiatheroge nic effects, reduced Cx43 exp ressi on in p rimary huma n vascular cells in vitro. Atheroma of rabbits orally treated with simvastat in contained fewer in flammatory cells and exhibited thicker fibrous caps tha n con trols, which was associated with

5、reduced Cx43 expression in lesions of statintreatedrabbits. CONCLUSION: These datain dicate the critical role of Cx43mediated gap jun cti onal muni cati on in atherosclerotic p laque formatio n. Reduced Cx43mediated in tercellular muni cati on leads to cha nges in atheroge nesis. These findings show

6、 that Cx43mediated in tercellular muni cati on can be used as a new poten tial thera peutic target in atheroge nesis.【Keywords】 atherosclerosis; simvastatin; Connexin43【摘要】 目的：证明辛伐他丁可以通过减少缝隙连接蛋白 43 (Connexin43, Cx43)的表达影响粥样斑块的形成及稳定性.方法：高脂饲料喂养建立粥样硬化 模型，治疗组给予辛伐他丁口服，活体内的Cx43和巨嗜细胞检测使用免疫组织化学方法，培养平滑肌细胞的Cx

7、43检测使用免疫印记方法，Cx43的半定量使用 计算机图像处理.结果：药物干预的培养细胞和模型治疗组中Cx43的表达均明显减少，斑块的组成中，炎症细胞减少50%，胶原纤维平滑肌细胞含量增加.结 论：Cx43介导的细胞间通讯在粥样硬化形成中起重要作用，同时辛伐他丁减少 Cx43的表达可以增加斑块的稳定性，Cx43成为动脉粥样硬化治疗中一个新的治 疗靶点.【关键词】 动脉粥样硬化；辛伐他丁；连接蛋白 430引言动脉粥样硬化主要是一种免疫炎症性疾病， 它的病理过程是多因素参与的. 包括富含脂质的巨嗜细胞和T淋巴细胞在血管内皮下积聚(脂质条纹).由多层 的泡沫细胞和增生的平滑肌细胞组成，并伴随有细胞外

8、基质的沉积(粥样斑块). 在粥样斑块形成过程中的决定性因素是循环中的血液细胞和动脉壁内的细胞之 间相互协调的作用1, 2.缝隙连接是由许多相关的蛋白家族组成的，叫做Conn ex ins (Cxs) 3.在人体中大约有20多种的Cxs, Cx43是分布最广泛的.Cxs是机能蛋白，半衰期 是15 h左右，在生理和病理条件下提供了细胞间相互影响的一种方式4.细胞间通道的代表缝隙连接在多细胞有机体中通过直接的交换离子和小分子物质 提供了一种简单的同步反应的方式 5，缝隙连接在慢性的生理过程如细胞的生 长发育中起到重要作用.已经证明在粥样硬化形成中Cx43的表达增加，Cx43在 粥样硬化的发病过程中起

9、着重要作用.我们用实验证明，辛伐他丁可以通过减少 Cx43的表达影响粥样斑块形成.1材料和方法材料兔粥样硬化模型的建立：3 mo龄健康新西兰兔20只,购自第四军医大学实 验动物中心，体质量23 kg，适应性喂养1 wk后记录血脂，随机分成两组， 每组10只，第一组给予高胆固醇饮食（每100 g饲料含有1 g胆固醇、15 g蛋 黄粉，5 g猪油，其余为兔基础饲料、及 4 mg/（kg? d）淀粉.第二组除给予高胆 固醇饮食外，给予辛伐他丁（湖北丝宝药业）4 mg/（kg ? d）.两组均单笼饲养， 自由饮水.12 wk取血，复测血脂.方法在深麻醉状态下（戊巴比妥钠 25 mg/kg，Sigma公

10、司）40 g/L多聚甲醛灌 注，取兔主动脉，进行形态学和免疫学分析.血浆总胆固醇（T。、三酰甘油（TG 和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC的水平分别采用酶法在日立7170A型生化分析仪 上进行测定.组织形态学观察及定量分析主动脉被分成两部分，主动脉根部及弓部包埋剂包埋，冰冻切片.粥样硬化程度的评估采用采用计算机图像分析系统，计算6个相距50卩m的切片层面的脂质沉积面积（苏丹W染色）占整个血管横截面的 比例的平均数.胸腹段的血管沿着腹中线纵行剖开，苏丹W染色，计算病变面积占总胸腹动脉总面 积的百分比.人血管平滑肌细胞培养采用本院普外科静脉曲张患者手术后切除的大隐静 脉，分离培养平滑肌细胞，胎牛血清、

11、DME培养基由Gibco公司提供，原代培养采用组织贴块法，培养液为 200 g/L胎牛血清加DME培养基.待细胞生长融 合出现峰与谷结构后，用含g/L胰蛋白酶消化液消化、传代培养.第三代细胞 用抗a act in肌动蛋白抗体免疫组化法进行鉴定.于96孔板内接种每孔5000个细胞，加入终浓度为10, 2,和卩mol/L的辛伐他丁和500卩mol/L甲瓦龙酸 酯（Sigma）和10卩mol/L辛伐他丁，继续培养48 h，培养液为200 g/L胎牛 血清加DME培养基.免疫组化染色主动脉10卩m冰冻连续切片，分别加入：抗Cx43一抗1 ：200稀释（武汉博士德公司），二抗及DAB显色采用博士德公司即

12、用型 SABC试剂盒SA1022和 DAB显色试剂盒AR1022.操作按照说明书；鼠抗兔CD14 mAb二抗及DAB显色采用博士德公AR1025操作按照说明书.（标记单核巨嗜细胞）1 : 500稀释（VMRD,InC司即用型SABC式剂盒SA1021和DAB显色试剂盒SDSPAGE蛋白质转移等操免疫蛋白印记细胞的制备、蛋白定量、电泳（作过程按照文献6进行.膜片与兔抗Cx43多抗1 : 200稀释（武汉博士德公 司）或与兔抗肌动蛋白多抗1 : 200（武汉博士德公司）反应，使用博士德 Western Blotting 检测试剂盒EK1002具体操作步骤按照说明书进行，经 X线片曝光、 显影和定影

13、，显现特异的蛋白信号，利用计算机计算不同区带的信号强弱.结果 的定量化采用Cx43/肌动蛋白信号强弱的百分比.统计学处理： 数据采用x±s表示，主要统计指标均进行正态性检验，两 组间的均数比较用两样本t检验，组内不同时间均数比较采用配对t检验.多组 数据组间比较进行方差分析及 LSDt检验.所有统计工作采用SPSS统计软件进 行分析（P）.2结果2. 1各组兔的基本情况辛伐他丁治疗组较对照组12 wk后TC, LDLC分别低%和（ PV）. TG在实验过程中无显著变化（Tab 1）.表1对照组和辛伐他丁治疗组 兔血脂变化（略）2. 2对粥样斑块损伤面积的影响肉眼观对照组的降主动脉内膜

14、粗糙，有黄 白色脂样物质突出管腔，呈弥漫性，远端病变逐渐减轻.辛伐他丁组粥样硬化病 变较对照组减轻.对两组降主动脉内膜面苏丹W染色，斑块被染成红色.利用计 算机图像分析系统计算斑块面积占总面积的百分比.对照组为（±）%辛伐他丁组为（±） %治疗组较对照组斑块面积减少了 38%,两组间有显著差异（PV）.2. 3斑块组成成分的对比我们对比了能够反映斑块稳定性的一些指标，例如炎 症细胞，血管平滑肌细胞，间质胶原和脂质核心大小等.对于标本冰冻切片进行 Van Gieson氏苦味酸酸性复红染色法染色，粉红色为胶原纤维，黄色为平滑肌 细胞，紫黑色为细胞核.辛伐他丁治疗组拥有明显的纤维

15、帽， 其中还混有平滑肌 细胞.拥有较小的脂质核心其中胶原纤维含量明显增加，平滑肌细胞向粥样斑块核心迁移，形成条索状.对照组纤维帽不明显，脂质核心占整个斑块体积的比例 较大，斑块中含有的平滑肌细胞和胶原纤维明显少于治疗组.平滑肌细胞没有向斑块中迁移(Fig 1A,B),然而单核巨嗜细胞的数量少于对照组，分别为(133 ± 19) 和(207 ± 21)个/mm2(Pv). Cx43的表达在治疗组中明显减少(Fig 1C, D) . Cx43 的减少同时伴有纤维帽及中层的胶原纤维含量和平滑肌细胞的增加，免疫炎症细胞的减少.2.4他丁类药物对体外血管平滑肌细胞的Cx43表达的影响

16、利用免疫印记技术证明(Fig 2),在体外培养的血管平滑肌细胞在辛伐他丁的作用下，减少了 Cx43的表达，而且这种减少是剂量依赖性的，由图可见随着辛伐他丁剂量的减 少，对于Cx43的表达的减少作用是逐渐减弱的，且用甲瓦龙酸酯可以阻断辛伐 他丁减少Cx43表达的作用.看来本试验中的Cx43的减少确实是由于他丁类药物 的作用引起的.各浓度辛伐他丁组分别与0卩mol/L组比较均有明显差异(PV), 甲瓦龙酸酯组与10卩mol/L组相比有明显的差异性(P< Fig 2 ).3讨论他丁类药物可以降低人类的血浆胆固醇和粥样硬化相关的发病率和死亡率 许多的体外试验已经证明他丁类药物对于血管细胞的多重作

17、用可以改变粥样硬 化的形成和稳定斑块.这种作用并不是通过降低胆固醇而实现的7.我们可以观察到辛伐他丁通过减少 Cx43的表达显著的影响了粥样硬化斑块 的形成范围及组成.其中一个重要的机制可能是减少了白细胞向斑块的渗透.虽然外周血内的白细胞计数在两组中是相同的，但是，在斑块中对照组的炎症细胞是治疗组的两倍，这提示，内皮细胞和粒细胞间的细胞间通讯可能促进了粒细 胞的外渗.Cx43的高表达区与面对血流湍流的粥样硬化易发区域相一致 8.此 外，内皮细胞的Cx43的表达已经在粥样斑块的肩部被检测到，同时既往的研究 中证明斑块可以扰乱血流，促进粒细胞的黏附和迁移，而多数发生在斑块的肩部9.治疗组的粥样斑块

18、组成明显的与对照组不同.脂质核心是斑块的主要的脂 质储存所，他丁类治疗组拥有较小的脂质核心和较少的巨嗜细胞.此外，斑块中包含有更多的平滑肌细胞，同时平滑肌细胞的产物间质胶原纤维也增加.虽然脂 质核心和巨嗜细胞，胶原是人类粥样硬化损伤的特征性改变，但平滑肌细胞的含 量与前三者含量相比，对于斑块的稳定性起着更重要的作用10.因此减少Cx43的表达对于稳定斑块比单纯减小斑块的大小更有意义.随着药物Cx43的作用Cx43的表达.免疫蛋白印记证实，辛伐他丁减少Cx43的表达是剂量依赖性的 浓度的减低，对于Cx43的抑制作用也减弱.然而他丁类的这种减少 可以被甲瓦龙酸酯所阻断.因此可以证明他丁类药物确实可

19、以减少 同时也减少了细胞间的通讯11.明显影响了我们通过利用动物模型和细胞培养两条途径减少Cx43的表达，粥样硬化的形成及组成，提供了缝隙连接在粥样斑块形成中起重要作用的新证据 缝隙连接是识别细胞生长和分化所必须的重要分子结构，在粥样硬化相关细胞间 的信号发生改变.然而现在通过减少Cx43介导的细胞间通讯，究竟如何改变了 粥样硬化的形成还不清楚.最近的研究进展表明，Cx43可以组织特异性的敲除12，可能帮助我们确定哪一种细胞型的 Cx43对于粥样硬化是特异的.无论其 机制是什么，我们的试验证明了 Cx43介导的细胞间的通讯是一个潜在的粥样硬 化治疗靶点.【参考文献】1 Ross R. Athe

20、rosclerosis: An inflammatory diseaseJ . N Engl J Med , 1999; 340(2): 115-126.2Lusis AJ. Atherosclerosis J:. Nature , 20XX; 407(6801): 233-241.3 Goode no ugh DA, Goliger JA, P aul DL. Connexins, connexons, andJ . Annu Rev Biochem , 1996; 65: 475-502.in tercellular muni cati on4 Willecke K, diversity

21、of connexin 20XX; 383(5): 725-737.Eiberger J, Dege nJ, et al. Structural and functional genes in the mouseand humangenomeJ . Biol Chem5 Kumar N, Gilula NB. The gap junction munication channel J.Cell , 1996; 84: 381-388.6药立波.医学分子生物学实验技术M .北京:人民卫生出版社,20XX:44-52.7 Takemoto M, Liao JK. PIeiotropic effects of 3hydroxy3methylglutarylcoenzymeAreductase inhibitorsThromb Vasc Biol , 20XX; 21(11): 1712-1719.J . Arterioscler8 Gabriels JE, P aul DL. Co nn ex in 43 isof disturbed flow in rat aortic endothelium buthighlyconnexin37 and connexin40localized to si