(完整版)木质素酶活力的测定方法

1、1 前言草菇是一种著名的食用菌，营养丰富，味鲜美，深受人们的喜爱。草菇子实体含有 人体必需的8种氨基酸，占其他氨基酸总量得 38.2%,还含有14种维生素1,不愧为一 种比较理想的天然保健食品。草菇喜高温高湿，生长速度快，生长周期短，一糙只需25天左右，在广西每年4月至9月均可以种植，是一种很有发展前途的食用菌，生产和市 场前景广阔。栽培草菇的生物学效率比较低（鲜菇与栽培料的比值），用稻草栽培草菇的生物学效率大都在1015%fc右。过去研究认为草菇主要利用纤维素、 淀粉，不大利用半纤维素以及 木质素。因为草菇的半纤维素酶活性低，又缺乏降解木质素的酶类，但是农作物秸杆中 一般含有半纤维素1530

2、%木质素占1030%为此，本试验用透明圈法、氧化圈法观 测V展1、V展2、V展3、V V广、0六个菌株所产的胞外酶利用分解半纤维素，木质素的能 力，看是否能够从其中初步筛选出利用半纤维素、木质素较强的菌株来。探讨更合理地配制栽培料的途径对提高草菇的生物转化率有重要意义。2 实验原理半纤维素是由五个碳原子为主的木糖聚合的高分子化合物，经木聚糖酶降解利用之后，基质生成透明圈20木质素是以苯环为基本结构的复杂大分子的有机化合物，含碳60 66%在多酚氧化酶、过氧化酶降解后，能与愈创木酚进行反应生成棕红色或棕褐色轮 环3。亮兰试剂与蛋白质结合兰青色、在与过氧化酶作用则呈黄色透明圈4o通过相应的平板基质

3、培养，草菇菌丝分泌的酶类降解利用后，形成的透明圈迟早、直径大小、色泽 深度等初步判断是否存在半纤维素酶和木质素酶降解酶类及其活性。3材料与方法3.1 材料3.1.1 菌株V9购至广西大学微生物研究所，V广、V11购至广西农业科学院生物技术研究所，V展1、V展2、V展3采至广西现代农业展示中心经组织培养所得。3.1.2 试剂可溶性淀粉、亮兰溶液自配、半纤维素自已提制、愈创木酚为国产分析纯、木聚糖为进 口。3.2 试验方法3.2.1 试剂配制3.2.1.1 亮兰溶液配制25 ml亮兰溶于25ml浓度为90叱醇中，加入85%勺H3PO4最后定溶至500ml,灭 菌。3.2.1.2 愈创木酚试剂配制：

4、0.4ml愈创木酚药品，用100ml水酒精溶解。3.2.2 半纤维素提取3.2.2.1 稀酸高温提取法550g玉米芯装入500 ml三角瓶加入0.1%的硫酸0.5ml,加无菌水至500ml,60C下浸 泡12h,去渣取液一按原料干重加水至 500ml一浴煮10min（120 C高压）一冷却，加酒精， 用离心机离心分离一取沉淀物。3.2.2.2 浓碱液提取法6玉米芯切碎一烘干一粉碎一过 40目一取6个500ml三角瓶，每瓶装25g玉米芯粉一 每瓶加水300ml一置入高压锅126c煎40 min一过滤取渣一每瓶加入 10%NaOH30m移 入水浴锅内90c水温提取半纤维素2h一过滤取滤液，用1:1

5、HCL中和到PH6.07.0 一离 心1520min （3500r/min ） 一取沉淀粉加入95%L醇浸过液（或移入 40c温箱） 24h 后离心取沉淀物。3.3 平板培养基制作3.3.1 淀粉酶测定培养基4.0g可溶性淀粉、4.5g琼月旨、1.0g蛋白陈、1.3g NaH2PO4力口水220ml-调PH=6.5 一倒入12付培养皿，每皿15ml-0.1Mpa下灭菌30 min。3.3.2 亮兰培养基20g木薯根、20g木薯叶、4.5g琼脂、1.0gKH2PO4 2.0g葡萄糖，力口 220 ml水煮至 200 ml -0.1Mpa 下灭菌 40min.3.3.3 半纤维素培养基制备烘干的半

6、纤维素2.5,磨碎倒入烧杯中，加220ml水解，再加琼脂3.0,酵母膏0.6, 1.0gNa2HPO40.1gMgSO41.0gNH4NO煮至 200 ml倒 12付培养皿-0.1 MpaF灭菌 40 min。 3.3.4 木质素酶测定培养基制备20g木薯块根，20g木薯茎叶，加水220 ml煮至200 ml双层沙布过滤一加入1.0gKH2PO4糖2.0g ,酵母膏2.0g-PH=7.0,加入0.04%的愈创木酚2ml7 ,摇匀倒12 付平板一 0.1 Mpa下灭菌40 min。3.3.5 半纤维素测定培养基双层平板制备下层平板一水琼脂培养基：琼脂 2.5加水130 ml煮至120 ml,倒1

7、2付培养皿一灭 菌。上层平板一水解圈制作：配方同上述半纤维素培养基配方一样一装入300 ml的三角瓶灭菌一待下层培养基冷却后，用灭菌过的量筒均匀倒入12付培养皿中。3.3.6 对照实验培养基配制方法同上，但不加入可溶性淀粉，愈创木酚、半纤维素等试剂。3.4 接种、培养、观测方法3.4.1 接种开紫外线灯杀菌30 min一将培养好的斜面菌种转接到 PDA平板上，在28oC下培养3 5天，用无菌的打孔器将平板菌种制成1 cm,宽0.2 cm的菌种塞接到制备好的培养皿中心3.4.2 培养将接种后的培养皿放入培养室内，温度控制在 30c左右，由于此试验在盛夏进行， 因此上午打开门窗调温调气，下午关上门

8、降低温度，利用菌丝萌发，生长。3.4.3 观测方法每天定时记录菌丝的直径大小，透明圈出现的时间，直径大小，颜色深浅。4试验结果与分析不同的菌株接在不同的培养基质中，经培养 3天后，都能产生半透明圈或显色氧化 圈，表明草菇菌丝体能够分泌胞外半纤维素和木质素酶类。4.1 半纤维素培养基出现通明圈自提制的半纤维素颜色呈褐色。接种后第以大，双层平板培养基皿中的菌丝向四周生长，基质中开始显现透明圈，表明供试的六个菌株都分泌出半纤维素酶，能降解半纤维素。到第三天，透明圈很明显，结果见（图1）,其中反应的强度在不同菌株之间略有差异（见表1）以V展1、V展3和V9分泌的胞外纤维素酶活性最大，V广显示透明圈最迟

9、，第二天才出现，活性也较差。图1半纤维素黄色透明圈表1半纤维素基质反应结果菌株培养1天培养2天透明圈直径（cm）透明圈生长速度V展1+ + +6.50.80V展3+ +6.50.25V展2+ + +5.51.25V9+6.50.51V广+4.11.0V+6.00.51注：“+”表示形成透明圈直径的大小。“ +”表示最小，“+”中等，“+”最大。 透明圈生长速=（透明圈直径一菌块直径）/培养天数。以半纤维素为碳源的培养基，由于粗提的半纤维素色泽为褐色，经半纤维素酶降解利用 之后，变无色的半透明圈。说明草菇能分泌半纤维酶类，利用半纤维素作碳原。透明圈 生长速度最快的为V展3,其次为V展1、V9、V

10、i, V展2的透明圈生长速度最慢。4.2 木质素基质显现棕红色氧化圈7个草菇菌株，在含有愈创木酚的培养基里，均能产生棕红色的氧化圈轮环。 木质素 是一种复杂的高分子天然有机化合物，其中具有苯酚的结构，食用菌能分泌出多酚氧化 酶去分解及利用木质素，所以在菌丝体的周围出现棕红色氧化轮环7。如（图2）,培养3天的显色的结果列在（表2）图2木质素棕红色氧化圈表2愈创木酚氧化圈情况而菌丝直径（cm）氧化圈（cm）透明圈生长速度V97.05.50.50V广6.44.20.73V展i7.05.50.50V展26.54.80.56Vi6.55.00.50由表2可知，V9、V展i分泌的多酚氧化酶较强，氧化圈直径

11、达到 5.5cm。而透明圈 生长速度最慢的为V广，其余菌株透明圈生长速度中等。4.3 淀粉培养基中生成透明圈情况接种培养的第2天，不同菌株透明圈的大小列在表 3表3六个草菇菌株在淀粉基质中生成透明圈的情况表菌株V V9VlVlVV性明圈直径4.03.04.03.03.52.0从表3看出，V广、Vii、V展3的胞外淀粉酶活性较大，因而透明圈直径大。淀粉与碘反应呈蓝色，而淀粉经胞外淀粉酶分解大分子淀粉变为小分子的双糖、单糖后与碘试剂没有显色反应，从而判淀粉酶的存在及活力大小8。如图3中的半透明圈部分。图3胞外酶透明圈4.4 过氧化酶显色结果将菌种接在亮兰培养基培养基中心，培养24小时所有的菌株的菌

12、落均出现浅黄色的 氧化圈，培养3天透明圈较明显（见图4） o其中过氧化酶活性的强度在不同的菌株之间 存在差异，从见表4中可以看出，以V展3产过化氧酶的活性最强。图4 过氧化酶透明圈表4亮兰培养基中生成过氧化圈情况菌株菌丝直径（cm ）氧化圈直径（cm ）须色V92.8+浅V广4.5+浅Vi2.7+浅V展i3.1+浅V展25.5+-卜较浅V展34.4+-卜深注：“+”表小氧化圈直径（d ）大小。“ +”表小1Vd<2, “+”表小2Vd<3, “+” 表示 3Vd<5。亮兰溶液是一种灵敏度高、颜色稳定的显色剂。在培养基中加入此溶液，培养基呈 蓝色，而经过氧酶氧化分解之后变成黄色透明圈。5小结与讨论5.1 小结采用半纤维素平板、愈创木酚平板及亮兰平板对七个草菇菌株进行培养基显色试验，结果供试菌株能够产生降解半纤维素酶类及木质素降解酶类，但是酶的活性在不同的菌株之间有差别。本试验中取得酶类活性最高的是 V展1和V9两个菌株。透明圈法、愈创木酚法及亮兰法出现透明圈、氧化圈显色试验出现早晚、圈的直径大小、颜色深浅情况，能判断菌