mTOR抑制剂的筛选方法

1、mTO柳制剂的筛选方法【摘要】雷帕霉素靶蛋白（mTOR足是丝氨酸/苏氨酸激酶分子靶位。mTOR 是细胞生长增生的中心调控者，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。人体多种月中瘤细胞中可见 mTOR®路的失调。近年来，有关mTOR卬制剂的 专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的 mTOR卬制剂已经成为抗月中瘤 药物研发的重大课题。本文就mTOR勺结构功能、信号转导通路及mTOR卬制剂 的筛选方法进行简单的介绍。【关键词】雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素靶蛋白抑制剂药物筛选TOR（target of rapamycin,雷帕霉素靶蛋白）是一类进化上非常保 守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种

2、生物细胞中。1994年，Brown等证实并克隆了哺乳动物TO尊因，其产物只有 一种蛋白，即 mTOR（mammalian target of rapamycin 哺乳动物雷帕 霉素靶蛋白）。mTORSP13磔白激酶类家族，是P13K/PKB言号通路 下游的一个效应蛋白，其底物主要控制与细胞生长和增殖密切相关的蛋白质的合成。mTOR空制细胞内mRNA勺翻译，参与膜蛋白转 运，蛋白质降解，蛋白激酶 C言号转导和核糖体合成等一系列生理病 理过程。1. mTOR勺分子结构mTO电子结构复杂，由2 549个氨基酸残基组成，分子中有数 个各自独立而保守的结构域，类似于酵母中 TOR勺结构。mToR子 的氨

3、基端存在20个串联重复序列，每一个重复序列包含2个分别由40个氨基酸残基组成的口螺旋，每个螺旋都有一个亲水基团和一个疏 水基团。这种重复结构介导蛋白质之间的相互作用，并有利于mTOR定位于浆膜。mTO电子竣基端的中部是蛋白激酶域，结构和 P13微酶的催化 域相似。蛋白激酶域的上游是FRES,为FKBPl”雷帕霉素复合物与 mTOFRf互作用的区域，该区发生突变后可以完全阻止雷帕霉素对 mTOR勺抑制彳用。FRB下游大约500个氨基酸残基处为FATM,作用 可能是与mTO电子末端的FATCH形成一个空间结构，从而暴露 mTO电子的催化域。FAT（M和NRD®位于mTO电子竣基末端，其

4、中NRDM在FATG口激酶催化域之间，是mTOR勺负性调节域，而FATC 域对mTOR勺活性有着至关重要的作用，FATC吉构中任何一个氨基酸残基的缺失都能使mTORl失催化能力。由于mTO陶含的几个相对独立的结构域都能够和其他蛋白质发 生作用，因而其能结合不同的蛋白质。实际 mTORF在两种复合物形 式，这两种复合物的结构在细胞中都是相对保守的。mTOR成的两种不同复合物mTORC和mTORC2已知的 mTOR寸肿瘤细胞生长、分化和代谢的作用均由 mTORC完成， mTORC2t雷帕霉素不敏感。91矶OR的结构示意图FRES,这个区域为免疫抑制剂FK506吉合蛋白与雷帕霉素的结 合位点，是雷帕

5、霉素与mTOR1互作用的区域。所以这个区域突变后 可完全阻止雷帕霉素对mTOR勺抑制彳用，FREE之后为激酶区，作 用是使丝氨酸苏氨酸发生磷酸化。最后的 FATCIFA襦末端区。FAT 和FAT(E可调节mTOR!酶的活性。2. mTOR的信号转导通路mTO阿通过P13KZAK硫径或AMPK径来发挥作用。目前研究 较多的是P13K/AK硫径。该途径在肿瘤中常被过度激活，使细胞周 期调节失控，引起细胞转化和肿瘤进展。正常情况下，生长因子诱导 mTOR勺活化是通过激活P13皎现 的。P13阿磷酸化肌糖环3-羟基的磷酸肌醇。细胞膜3-磷酸磷脂 (P13Ps)|Akt的PH区域连接，导致Akt转位至浆

6、膜，从而与磷酸肌醇 依赖性激酶1(PDKl须触。PDK循责Akt的磷酸化，从而激活Akt。激活 的Akt可磷酸化结节性硬化复合体2(TSC2并减弱后者对mTOR勺抑制 作用。Akt和P13K&功能上属于原癌基因，受到抑癌基因 PTEN勺负性 调节。PTENI使肌糖环3-羟基的磷酸肌醇磷酸化，在胚胎发育、细 胞迁移、凋亡和有效终止P13KT导的信号转导方面起着关键性的作用。PTEN8变在人类实体肿瘤非常常见。活化的P13K4于细胞膜，可彳S化磷脂酰肌醇 P球专变为磷脂酰肌 醇P3,后者募集并激活AKT PTENI以下调PtdlinsP3的浓度。从而抑 制P13KZAK琥径。AKTt mT

7、OR勺激活主要通过以下两种方式：一 种是磷酸化mTORS直接激活它；另一种是磷酸化并抑制 TSCVTSC2 二聚体。TSCX TSC2bmTORft重要的上游信号分子。RhebM mTOR 激活蛋白，TSC1/TSC21聚体通过抑制Rhebffi止mTOR勺活化。Growth Caqt4r+isnergy-i-nuiri«nt弼同=一1R*c«ptaf of QF图2 mTOR信号转导通路F'ipine| 2 Signaling network of e'PQR由于P13K/Akt/mTOR1路分子发生突变或者上游信号通路分 子激活，肿瘤细胞内P13/Akt

8、/mTOR!路可被激活，从而使细胞增 殖失控、凋亡抗拒以及引起细胞的代谢改变。mTORg过上述两种途径被活化后可将信号传递给下游通路，通过两种途径调节下游核糖体和mRNA吉合，一是使抑制mRNA羽译的 4；BP1磷酸化失活，二是使促进 mRNA现译的S6K微酸化而激活， 从而启动核糖体蛋白的翻译。两条途径的最终效应都是促进mRNA羽译，从而直接或间接调控翻译起始阶段、微丝形成、膜转运、蛋白 降解、蛋白激酶C（PKC!路、核蛋白体合成、tRNA合成及转录等。4EBP蛋白质酗译 及细胞生长3. mTOR卬制齐ImTOR卬制剂雷帕霉素及其衍生物能结合FKBP（FKS06合蛋白）, 抑制mTOR阻止P

9、70S6侨D4EB腰酸化。同时也间接抑制了其它相关 蛋白转录和翻译，具有抗菌、免疫抑制和抗肿瘤作用。mTOR抑制剂是具有抗排斥、抗增殖、抗肿瘤及延长哺乳动物寿命等作用的多功能药物。第一个 mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin,现称西罗莫司，Sirolimus）及其后来通过化学半合成 获得的西罗莫司衍生物已作为免疫抑制剂用于器官移植的抗排斥反 应、作为雷帕霉素涂层支架治疗冠状动脉支架植入后的再狭窄、作 为治疗肾癌等癌症的mTOR靶向抗癌药物。目前又发现雷帕霉素能够治疗老年性痴呆症，也是第一个被报 道能够延长哺乳动物生命的药物。雷帕霉素及其衍生物临床上的新 适应症逐步被开发，它们在治疗罕见病

10、、疑难病症方面可能发挥更 大的作用。近年来，有关mTOR卬制剂的专利申请不断增加，设计、合成、 筛选结构新颖的mTOR卬制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。4. mTOR卬制剂的筛选方法（1）酶联免疫吸附法（ELISAELISA勺原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记 的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定 时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原 或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合 物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通 过反应而结合在固相载体上。此时固相

11、上的酶量与标本中受检物 质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为 有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据 呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接 地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。-r抗体吸附于我体表面，洗一 海l* C2）加待测抗1 庾，抗原特异性结合抗体，洗涤门）加馥标记抗 嗫1体，结合抗原.星|洗澡（4）加底物产生 颜色反应底物水解量=抗原 存在量图3-3辿诧抗原的双抗体央心法原理mTOR勺Ser244携酸化是上游信号AKT敖酶和下游p70S6a酶 反馈作用的结果，通过检测 mTORSer244携酸化程度可以检测 mT

12、O布活性。我们找了 Abcam司 的 mTOR pSer2448 in vitro ELISA齐1J盒，这 个试剂盒是专为在细胞和组织裂解液精确测量 mTOR勺活性。具体如下：采用mTO嗡定的抗体包被微孔板，制成固相载 体，样品吸入孔中，样品中存在的mTO瞰固定化的抗体结合到孔 中。洗涤后，在微孔中加入检测抗体。洗去未结合的检测抗体，将酶标抗体加入孔中。各孔再次洗涤，将 TMB底物溶液加入到孔中，TMB被催化转化成蓝色，蓝色的深浅与磷酸化的Ser2448勺数量呈正相关。加入盐酸停止反应，颜色从蓝色变到黄色，用酶标仪在450nm波长下测定光密度值（OD直），可计算样品浓度。受检抗原：mTOR p

13、hospho Ser2448检测抗体：anti-mTOR phospho Ser2448 detector antibody酶标 : HRP-conjugated label specific for the detector antibody底物： TMB检测：最后加入盐酸停止反应，用酶标仪在 450nm处测定OD值。分析：OD直越小，mTORSer244携酸化程度越低，抑制剂作用越强。（ 2）荧光共振能量转移（FRET）荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近（710nm）时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻

14、近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRE焦一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。蛋白质磷酸化是细胞信号转导过程中的重要标志，研究其中的酶活性是研究信号通路的一个重要方面。利用放射性以及免疫化学发光等方法检测酶活性，都需要破碎细胞，用细胞提取物测定酶活性，无法做到活细胞内定时、定量、定位的观测酶活性变化，而利用FRETf法就可以很好的解决这个问题。利用FRE球理设计了一种新的探针（一种融合蛋白）：新探针包含一

15、个对已知蛋白激酶特异性的底物结构域，一个与磷酸化底物结构域相结合的磷酸化识别结构域。这个探针蛋白的两端分别是供体、受体荧光分子，利用FRET（理工作。当底物结构域被磷酸化后，分子内部就会发生磷酸化识别结构域与其结合而引起的内部折叠，两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量迁移。实验用到的供体是Thr46 （钺标记的anti-phospho-4EBP1）,受 体是绿色荧光标记的4EBP1是mTORF游信号通路的蛋白，有活性 的mTO谶磷酸化4EBP1,使之与供体结合。如果mTOR舌性受到抑 制，供体受体距离不能达到荧光能量转移的要求，则在515nm处与485nm处的信号比值增大。抑制剂的活性越大，比值越

16、大。（3）均相时间分辨荧光（HTRF我们找到的是HTRF ADP Transcreen斯齐1J盒。HTRF Transcreener AD测定是竞争性免疫测定。 mTOR是一种 激酶，在反应时会使 ATP转化为ADR ATP转化的ADP与d2标 记ADP竞争性地与错标记的ADP单克隆抗体结合。当错标记的ADP单克隆抗体与有标记的ADP相结合后，他们 便能发射荧光；当抗体与没有标记的细胞内ADP结合后，没有荧光产生。所以，通过检测荧光值的变化，便可量化细胞内的 ADR该测定法包括两个步骤：一个酶促步骤及随后的通用检测步 骤。首先在激酶作用下，ATP专化成ADP;错标记的抗体与加入的标 记的AD唯

17、发生能量转移，与反应中转化的 AD眩有能量转移，检测 不到荧光。所以荧光强度会随着反应转化的 ADF®增加而减小。 mTOR卬制剂活性越大，反应转化的ADP1少，荧光强度越强，通过 作图计算IC50,可以比较不同抑制剂的活性。荧光检测还可以采用以下几种方法。 ADP Hunte试齐I盒我们也可以直接检测激酶反应产生的 ADP勺量。ADP Hunter是一种高通量筛选激酶抑制剂的试剂盒。它的优点是 更加简便和灵敏。此测定法直接检测磷酸化反应而产生的 AD吩子，采用非放射 性，非基于抗体的方法。激酶反应将 ATP专化为ADP,通过偶联酶反 应系统从AD吐成过氧化氢。在有过氧化氢酶（HRP

18、P存在时，过氧 化氢与ADHP（HRFS色底物）结合显色，用荧光酶标仪在最大激发 波长和最大发射波长分别为530纳米和590纳米处检测荧光强度。 ADP-G虏测定激酶活性的一种常用方法，检测也是激酶反应产生的ADP勺量。在激酶反应后，把残留的未反应的 ATP 用酶降解，反应产生的ADP&酶作用下转化成ATP,最后在荧 光素酶作用下检测荧光。不同浓度的 AD哈量可做出的标准 图，将最后的实验结果与标准图对照，可得出结论。在最下 面的一条曲线表明磷酸化程度最弱，抑制剂的活性越强。iSttp2:Kinase Detection Reagent)Light、心 网叩 1A&P-Glor

19、« R蛇gM)4Q ftTPase reactionATP jmvwt; MP rffniinm<j *h*r kiniM i滴亡had 所12沏力 tfftlhVbMATPSI ADP-Glo Kinase Assavli'BSLabChip EZ Reader MSA assays这个方法跟之前的原理都略有不同，虽然最后也是检测 荧光强度，但是它是把处理过的样品用荧光后标记吸入管 中，根据不同带荷质比迁移率不同，荧光底物和荧光底物标 记的检测物最后到达检测窗口的时间也不同，最后就能得到 一幅关于时间与荧光强度的关系图。跟高效液相的过程有点 类似，只不过高效液相是根据

20、组分的极性不同，检测器是紫 外。而这个方法是根据荷质比，检测方法是荧光。在试验中 用到的样品可以是抑制剂处理过的mTORF游靶蛋白，靶蛋 白磷酸化程度越弱，则荧光信号越弱，抑制剂活性越强。I iMJtrrfimKin f rale=lluorccent 产pllde substrate (more pu©视部E'lrClra & jmlData eoilMled as v&, tjre(4)时间分辨荧光技术(TRH时间分辨荧光技术的原理是用三价稀土离子及其螯合物作为示 踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗 体、激素、核酸探针等物质。当免疫

21、反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 (特异性强、荧光光谱的Stokes移、寿命长)，用时间分辨荧光 分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的 浓度，达到定量分析的目的。ku 集粤合衡野席粤合期韶沪顿记猫膜内般成示踪剂一般是具有独特荧光特性的稀土金属一镯系元素，镯系 元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：(E (Eu)、彩(Sm 镐(Dy)、得(Te)镯系元素荧光特点：(1)荧光寿命极长镯系元素螯合物(60900 us)铺：714us>普通荧光免疫中荧光团：1100us样本中蛋白质荧光：110us,易猝灭。(2

22、) Stokesfi移大(大约 290nm)箱：发射光613nm、激发光340nm,荧光素的Stokesfi移为28nm(3)荧光特异性强(发射光谱带很窄：615士 5nm(4)解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍所以镯系元素有两个优点，stocks位移，也就是激发光和发射光 距离很大，很容易分辨激发光和发射光，而排除激发光的干扰。第二 个优点是镯系元素的荧光不仅强度高，而且半衰期也很长，通过时 间分辨，极大地降低了自发荧光背景，实现了高信噪比。故我们在时间分辨荧光检测中一般会采用 DELFI械（解离增强镯系元素荧光免疫检测）。这一技术使用镧系螯合物标记的试剂，通过洗涤来分离出未被结合的试

23、剂，从而检测体系中被标记的某种化合物或生物分子。在加入样品后经过洗脱，phospho-p70S6Kt体留在板上，再加 入错标记的Eu-anti-phospho-p70S6K抗体经过洗脱，加入增强剂， Eu3+A复合物上解离下来，自由Eu3璀增强剂作用下在紫外光的激 发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。实验用处理过的mTOR与p70S6K-起培养一段时间，之后加入错标价的磷酸化p70S6K%体，在荧光下检测信号强度。信号强度越低表示磷酸化程度越低，mTOR舌性越小，小分子抑制剂活性越大。DELFIAtt点包括：DELFI脸用于各种标记分子的结合检测：从小肽段至蛋白大分子；高灵敏度-信噪比可达

24、20 000:1；大的动态范围-动态范围超过3 logs;检测过程不涉及酶-无时间依赖性；试剂用 量更少；价格不菲的抗体所需更少；无需像 ELIS国防羊添加实验终止 液；可同时检测多种待测物；减少了测量过程中的样品干扰；信号稳定超过24小时, 提高了试验重复性。（ 4） AlphascreenAlphascreen的作用原理：在AlphascreenlR统中主要含有两种核 心物质，一为 Donor Bead,另一为 Acceptor Bead,当 Donor Bea附带 有的A分子与Acceptor Bea的带有的B分子产生相互作用时，可以 680nm镭射光去激发Donor Beadg面所带有

25、的光敏感物质，使其催化 周遭的氧分子形成活化态。此时活化态的氧分子可以与邻近的Acceptor Bea/生化学冷光化反应，并进一步藉由能量转换激发Acceptor Bea的带有的荧光物质产生520-620nm的荧光信号。当分子 不存在特异的相互作用时，活化态的氧无法扩散到Acceptor Bead，则不会有信号的产生。EiTiisionStl<jlnWlrvOlltvdDonorAlphaScreenSureFire检测试剂J盒可用于mTOR通路的研究，由 下图可见相关产品很多，方便用于mTOR卬制剂的筛选。产品p 4eBP 1 (ThrTO) A-S-ay Khap 4EBP 1 (T

26、hr37/Thr46)kltaAJpTi a S ere SurFire® is a ufiique plflitform far rmiPaBBirlne 出nHcfjpn口u， pro1«ins in c«Hh髭 w®l( 2The. cQmbination of Perkin&lmer*s higiiiy HEnitiv好 pravf?n AlphfiScrifn lechnolloigy h-e 4= d m b i n ation of Perk inHIm ef' s highly sensitive, proven AIph

27、iaScreeng匚hn 口 I口卬¥ witH TGR. £E ioSci9ocs多内容 with TGR BioScioncs%1 .如内Rp-ElFdE (S&r2O9) As»y KHsp-m T OR (3*r2d4J As-5iy KiliAJpha3creenS> Surof ireV1 kits are u sed In conjurudgn wilh AlphaSiccoen Proto in A. Kits whicbi includeAlphaScr 3ui itE> as a UiniqiLitf ptatferm fo

28、r msa&uirlng onefoy onous prateinsi in cell lysates.日H well 用举内管p-pU SJGK ( Thrj y ) As-say Kits p-p/CJ :SGk ( F hr3By > Assay Krts.Tini tunmhirir itlcn» of PbhkioFImnii Ji=iy1 ilyproven- A1 phnS<r«nluchrw lagy wltt i TGR Bki 号kjncoi/一 更 要内咨AljinSr-r nor>fi> SurnFiKi Is，n i

29、inh|Lin plfttfonn icr m9HBuring ncfog4noLjgi protulnt; irv coll Wuluu, nu wcjII.用尸索 内容p(j70 S6K (Tlu 121 /Sui *124) Auudy Kilt.p S6RP (Sur235/Sut236) Ai>iiay MltuAlpha Ser een<S5 SureF ir-eK> is a unique pliHrfainm far mefusurinq endonenous protein& in111V导mt日与，as well .内存与同类型的检测方法 TR-FRET EF(C口F林目比，AlphaScreeril勺优势在于蛋白和多肽都可作为磷酸化底物