贴壁细胞药物摄取实验

1、贴壁细胞药物摄取实验 贴壁细胞的药物摄取试验应用更为广泛，通过试验可以了解转运体对药物的摄取动力学特征，预测药物在体内的汲取、分布、排泄等过程。贴壁细胞来源广泛可以是培养的新奇组织细胞（如肝细胞）、肿瘤细胞（如应用广泛的caco-2细胞）、转染特定转运体的转染细胞等。近年来随着分子生物学的进展，特殊是转染细胞如oatl-, oat3-hek293细胞、oatpibi-, oatpib3-hek293细胞、oatp2bl-cho细胞、oatpl-xenopus oocyte细胞、pept1-hela细胞等，已经成为药物转运讨论和新药开发的重要工具。 【材料】 1贴壁细胞若干。 2取试剂、非必须、

2、培养基（dmem培养粉或rpmi 1640,m 199等）,0.4锥虫蓝、待测药物溶液、24孔板、krebs-henseleit液（118mm nac1,23.8mm nahc03,4.8mm kcl，1.omm kh2p04，1.2mm mgs04，12.5mm hepes，5.0mm glucose，and 1.5mm cac12，调整ph 7.4) ,triton-x-100,bca试剂盒。 3仪器及试剂净化工作台、倒置显微镜、酶标仪、co2培养箱、高压灭菌仪、恒温水浴振荡培养箱、高速冷冻离心机、高效液相色谱-质谱联用仪。 【办法】 1细胞复苏与培养将装有细胞的冷冻管从液氮罐中取出，快速

3、放入37水浴中，迅速摇摆，直至冻存管中冻存液彻低溶化后取出，以上操作在1分钟之内完成。消毒瓶盖后打开，吸出细胞液置于含有培养液的具塞离心管中，混合后低速离心，除去上清液，重复洗两次。接种于培养瓶中，在37 5% co2相对湿度90的细胞培养箱中培养。 2接种培养待细胞密度达到培养瓶面积的70%80时用0.25%-0.02% edta混合消化液消化数分钟，再加入适量培养液，用吸管轻轻吹打细胞成单细胞悬液，调节细胞浓度接种于无菌24孔板中（1x105孔），继续培养35天，待密度达到孔面积70%80可举行药物摄取试验。 3用移液器将24孔板中培养液吸取整洁，用预孵至37的krebs-henselei

4、t液轻柔的清洗2遍，将细胞表面的培养液清洗整洁。 4用移液器将krebs-henseleit液（37）加入24孔板中（1毫升孔)置于恒温水浴振荡培养箱中平衡10分钟。 5用移液器将平衡液吸尽，加入1 ml含待测药物krebs-henseleit液（预孵至37）开头摄取试验。 6达到预设的时光点用移液器吸尽药液，同时加入1 ml冷的krebs-henseleit液（0）终止摄取反应。 7用移液器吸尽冷的krebs-henseleit液，用冷的krebs-henseleit液轻柔的清洗2遍以洗净细胞表面吸附的待测药物。 8用移液器加入0.3 ml/孔的0.1% triton x-100,37振荡裂

5、解1.5小时。 9取适量细胞裂解液按bca试剂盒操作解释测定蛋白浓度，剩余裂解液放于-20保存；测定时经沉淀蛋白等处理后用lc-ms定量测定。 【结果与分析】 确定药物的线性摄取时光，作药物摄取量随时光变幻曲线，从而确定线性摄取时光；按照确定的线性摄取时光，分离在37和4下举行药物浓度依靠性摄取试验，作药物摄取量随药物浓度变幻曲线；由eadie-hofstee方程以特异性摄取初速度（）对初速度与药物浓度比值（/s）计算km, vmax，表征待测药物摄取的动力学特征。 【注重事项】 1有些细胞在低代时简单贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚拢成团，且贴壁不牢，即使消化后也不简单吹打成单细胞悬液，因此最好在购入时先大量冻存。 2用于药物摄取试验的细胞应处于对数生长久，此期细胞数随时光变幻成倍增长，活力最佳，最适合举行试验讨论。 3有些细胞不简单贴壁或贴壁不牢，