多巴胺对血管平滑肌细胞钙激活钾通道的影响及其机制

1、多巴胺对血管平滑肌细胞钙激活钾通道的影响及其机制 摘要 目的：研究多巴胺对血管平滑肌细胞大电流、钙激活钾(BKca)通道的影响及其信息传递机制。方法：用膜片钳细胞贴附式技术，记录细胞孵育液内灌流多巴胺受 体激动剂、阻断剂以及第二信使及相关蛋白激酶拮抗剂对猪冠状动脉血管平滑肌细胞BKca通 道活动的影响。结果：多巴胺增加BKca通道活性(P001)；并可被DA-1 受体阻断剂SCH23390完全阻断，但不受2受体阻断剂普萘洛尔的影响。腺苷酸环化酶抑 制剂SQ22536可完全阻断多巴胺的作用；而cAMP拟似剂CTP-cAMP单独应用可增强BKCa 通道的活性。蛋白激酶A的拮抗剂 RP-8CTP-c

2、AMPs对多巴胺增强BKCa活性作用无影 响。而蛋白激酶G的拮抗剂KT5823完全阻断了多巴胺这一效应(P001)。结论：多巴胺作用于DA-1受体增强猪冠状动脉血管平滑肌的BKCa活性是通过升高cAMP激活PKG引 起的。关键词：多巴胺；血管平滑肌细胞;DA-1受体;钙激活钾通道中分类号：Q424；Q463文献标识码:A文 章编号:1000-6834(2000)01-0033-04THE ACTIVATION OF BKCa CHANNEL IN PORCINE CORONARY VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS INDUCED BY DOPAMINE AND ITS

3、SIGNAL TRANSDUCTIONHAN Gui-chun1, Richard E.White2ABSTRACTAim:To study the effects of dopamine on the large-conductance, calcium- and voltage- activated potassium (BKCa) channel in porcine coronary va scular smooth muscle cells and the mechanism of the signal transduction process. Methods:With patch

4、-clamp technique,in cell attached patches, the a ctivity of the BKCa channel in porcine coronary vascular smooth muscle cel ls were recorded,after pre-treating the cells with the agonists and antagonists of DA-1 receptor, 2-receptor,cAMP,PKA or PKG respectively.Results:Treating coronary myocytes wit

5、h dopamine enhanced channel activity(P0.0 1),which was completely prevented by pretreating the cells with SCH23390,but not by proprandol.The activity of BKCa channels induced by dopamine was blo cked by SQ22536,and application of CPT-cyclic AMP increased channel activity su bstantially. Exposure of

6、cells to RP-8CPT-cAMPs had no effect on dopamine-ind uced channel activity, in another set of cell-attached experiments the stimul atory effect of dopamine was reversed by subsequent addition of KT5823. Co nclusion: Activation of DA-1 receptors by dopamine causes stimulation of BKCa channel which is

7、 dependent upon cyclic AMP-induced activation of PKG and not PKA.KEY WORDS: dopamine; vascular smooth muscle c ell; calcium-activated potassium channel;DA-1 receptor近年来，多巴胺及其拟似剂作为有效的治疗充血性心力衰竭（CHF）药物己受到广泛 的关注1。小剂量的多巴胺刺激血管平滑肌上的DA-1受体，升高 cAMP水平，引 起血管舒张2,然而，继 cAMP以后的信息传递机制尚无人报道。血管平滑肌细胞 膜K+通道的开放及K外流，使细胞膜

8、复极化，从而关闭电位依赖性的Ca2+通道 降低血管平滑肌的紧张性。BKCa通道是血管平滑肌上4种类型钾通道中分布最密，起 主要作用的通道3。另有报道，多巴胺对牛肾上腺髓质嗜铬细胞BKCa通道 有激活作用4。我们设想多巴胺引起冠脉血管平滑肌的舒张是通过刺激BKC a通道开放引起的。本研究采用膜片钳技术观察多巴胺对猪冠状血管平滑肌BKCa活 性的影响及其信息传递机制。1材料和方法11细胞分离与以往的细胞分离方法基本相同3。新鲜猪心由屠宰厂取得。在无菌条件下，分 离左前降支冠状动脉,放入Kreb-Henseleit缓冲液中。在显微镜下去掉内外膜，保留平滑肌层，将其剪碎成12 mm3的组织块，0001

9、木瓜蛋白酶消化30 min，吸管吹打，使细胞 游离。1 000 r/min离心，去除上清液，加入细胞孵育液，成分是(mmol/L):KCl l40，MgCl 10，CaCl201,HEPES 20和葡萄糖 30(pH74)。制成细胞悬液，保存在4，实验 在68 h内进行。12单通道记录实验采用细胞贴附式膜片，电极液成分为(mmol/L)：NaCl 140,KCl 5，CaCl2 1，MgC l2 2,HEPES 10(pH74)。实验时将拉制成的尖端阻抗为25 M的玻璃微电极尖端与细 胞膜表面形成高阻抗封接，阻抗大于10 G。单通道电流信号经膜片钳放大器(Axopatch 2 00- A Pa

10、tch-Clamp amplifler)放大后，通过AD、DA转换器(axon instrument)输入计算机 ，电流信号的采集和分析采用pClamp 6.01软件进行处理。以开放概率(Npo2结果21多巴胺对BKCa通道活性的影响膜电位为+40 mV多巴胺浓度分别为1mol/L，3mol/L，10mol/L时15 min 内，BKCca通道开放概率P0由00020002分别增加到00580008(n =4 )，027012(n=5)及05500087(n=10)(P001)。开放概率明显增 加，而且具有剂量依赖性(1)。 Fig.1 Dopamine stimulates BK Ca ch

11、annel activity in myocytes from coronary arteries (A) Continuous 2-second traces from the same cell-attached patch (+40 mV) bef ore and 15 minutes after application of 10 mol/L dopamine. Dotted line indic ates channel closed state, and upward deflections are channel opening. (B) Effec t of various c

12、oncentrations of dopamine on BKCa channel activity(Np 0) recorded from cell-attached patches (+40 mV,n=4-10). Channel activity (Np0) was calculated for a 100 msec test pulse to +40 mV, and plotted as a vertical bar on the activity histogram22多巴胺能受体拮抗剂对多巴胺激活BKCa通道作用 的影响普萘洛尔预处理细胞，没有阻抑多巴胺对BKCa通道的激活作用。用

13、5mol/L 普萘洛尔孵育血管平滑肌细胞30 min后，再加入10 mol/L多巴胺，仍然使BKCa通 道开放概率从00050004增加到06170151(n=5， P001)，而用10 mol/L SCH23390孵育血管平滑肌细胞30 min后。再加入10mol/L 多巴胺，却没有观察到 有BKCa通道被激活(n=5， 2)，表明SCH23390可完全阻断多巴胺的激活BK Ca通道的作用。2.3cAMP对多巴胺激活BKCa通道作用的影响SQ22536(100 mol/L)预处理细胞可完全阻断多巴胺激活BKCa通道的作用(n=5 )。另取细胞悬液，灌流100 mol/L CPT-cAMP则可

14、增加BKCa通道的P0从0008 0007到0192003(n=5， P001，3)。24蛋白激酶抑制剂对多巴胺激活BKCa活性的影响无论是在灌流多巴胺之前或之后，50mol/L RP-8CPT-cAMP处理细胞不能阻抑10 mol/L多巴胺激活BKca通道的作用，BKCa通道开放概率由灌流多巴胺前的 0001 0001增加到04560158(n=10,P001)。相反如用KT5823则可完全 反转多巴胺的效应，灌流10mol/L多巴胺BKCa通道开放概率由00010001增 加到03180132，加入300mol/L KT5823后，BKCa通道开放概率降低到0.02 10012(n=9，P

15、001)。 5mol/L普萘洛尔存在于孵育液中的条件下观察到 的结果如4所示。 Fig.2 Stimulatory effect of dop amine on channel involves DA-1 dopamine receptors, but not adrenoceptorsPeriod of drug exposure indicated by the horizontal lines above the histograms. Breaks in the time axis are periods when BKCa channel activity was not re co

16、rded. (A) Time course of BKCa channel activity recorded from a cell-att ached patch(+40 mV). Pretreating coronary myocytes with 5 mol/L propranolol fo r 30 minutes. (B) Pretreating myocytes with 10 mol/L SCH23390 Fig.3 Cyclic AMP mediates dopamine stimulation of BK Ca channel activity (Np0) (A) BKCa

17、 channel activity in the pres ence of 100 mol/L SQ22536. Subsequent administration of 10 mol/L dopamine ha d no effect on channel activity. In order to confirm the presence of channels, t he patch was excised into the inside-out configuration to raise Ca2+ at the cytoplasmic surface of the membrane

18、to 0.1 mmol/L. (B)Time course of BK Ca channel activity recorded from a cell-attached patch(+40 mV) before and 25 minutes after the addition of 100 mol/L CTP-cyclic AMP Fig.4 Effect of dopamine on channels involves PKG,but not PKA3讨论多巴胺用于治疗CHF的原因之一是它能舒张冠状动脉、肾动脉和其它血管床5，但有关其细胞分子机制尚不清楚。本研究结果表明，多巴胺通过增加平

19、滑肌细胞内cAMP水平 、激活PKG、增加BKCa通道活性，引起冠状动脉血管平滑肌舒张。由于BKCa通 道电导大，表达密度高，对血管平滑肌细胞静息膜电位水平和维持起决定作用，它能通过负 反馈复极化作用而降低膜的去极化和由此产生的血管收缩。体外实验中观察到选择性BK Ca通道拮抗剂Iberiotoxin可以诱导冠状动脉环强烈收缩3，可见BKCa对 血管平滑肌紧张性具有重要的调节作用，因此是血管舒张剂的理想靶位点之。尽管彻底阐明 多巴胺能和肾上腺素能信息传递系统对成功地治疗充血性慢性心衰非常重要，多巴胺舒张冠 状动脉血管的细胞或分子机制仍未阐明。本实验观察到的多巴胺增加BKCa活性，并具 有量效关

20、系，证明多巴胺舒张血管平滑肌的机制是激活细胞BKCa通道，引起K+外流 增加，从而减少Ca2+的内流而实现的。提示BKCa通道在多巴胺舒张动脉血管平 滑肌效应中起关键作用。我们进一步观察到普萘洛尔预处理不能阻抑多巴胺激活BKCa 通道，而DA-1受体阻断剂SCH23390却可完全阻断这一效应，证明多巴胺是通过DA-1受体起 作用的。DA-1受体是G-蛋白偶联受体，它的激活可使细胞内cAMP水平升高6。 本研究用腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536预处理冠状动脉血管平滑肌细胞，可完全阻断多巴胺 激活BKCa通道的效应。cAMP的拟似剂CPT-cAMP可以模拟多巴胺的效应，结果证实了 多巴胺是通过cA

21、MP起作用。其机制我们推测可能通过PKA实现的，然而PKA拮抗剂RP-8CPT- cAMPS没有阻抑多巴胺激活BKCa的作用，而PKG拮抗剂KT5823却完全阻断了这一效应。 这表明多巴胺是通过cAMP激活PKG而不是PKA增加BKCa通道活性的，其他研究者也曾报 道过类似的“交叉激活”现象：cAMP依赖性舒张剂对缺乏PKG的血管平滑肌无效，但如外加 纯化的PKG则可重现cAMP的舒血管效应7。这些发现表明，PKA和PKG的活性部位有 一定的同源性，然而PKG对BKCa通道的激活作用的具体机制尚需进一步研究。作者简介：韩桂春（1962-），女（内蒙古），副教授，博士生，从 事心血管和肾脏生理研

22、究韩桂春(大连医科大学生理教研室，大连116027)Richard EWhite(Wright State Universi ty School of Medicine，Dayton，Ohio 45435，US.A)参考文献1 Frishman W H, Hotchkiss H, Bront N Y.Selective and nonselective dopa mine receptor agonists: An innovative approach to cardiovascular disease treatme ntJ. Am Heart J,1996,132:861-870.2 S

23、ibtey D R, Monsma J. Molecular biology of dopamine receptorsJ. Tren ds in Pharmacological Science, 1992,13:61-69.3 White R E, Darlcow D J, Lang L F. Estrogen relaxes coronary arteries by op ening BKCa channels through a cGMP-dependent mechanismJ. Cir Res, 1995,77:936-942.4 Twitchell W A, Rane S G. Nucleotide-indep