对温度敏感的各类TRP离子通道在气道高反应性中的作用

1、对温度敏感的各类TRP离子通道在气道高反应性中的作用临床八年 0500003 刘葛君 摘要 建立研究细支气管感受器功能的实验模型，在此模型上分析气道感受器的特性，对冷、热以及各种试剂的反应性。同时制作哮喘动物模型，观察相同冷、热刺激以及试剂对哮喘动物模型的影响。以此初步了解在气道感受器上表达的TSTRPs通道与气道高反应性的潜在关系。关键词 哮喘、气道高反应、TSTRPs通道Abstract In order to explore the potential relationship between TS-TRPs and airway hyper responsiveness. We est

2、ablish a rat model of asthma through nebulization of ovalbumin. Small bronchiole receptors were recorded in an isolated lung preparation and the responses to different thermal and chemical stimuli were examined.At last bronchiole receptors can be activated by agonists of TS-TRPs and temperature. A h

3、igher responsiveness to the above stimulations was observed in asthmatic animals compared to the controls. Conclusions: TRPV1, TRPA1 and TRPM8 are localized to the afferent never endings of airway. Functional TRPV1 and TRPM8 are upregulated in asthmatic animals, which may account for the hyper respo

4、nsiveness.一、前言哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。这种慢性炎症导致气道高反应性增加，通常出现广泛多变的可逆性气流受限，并引起反复的喘气、气息、胸闷或咳嗽等症状1，2。气道高反应是哮喘的重要特性，表现为气道对各种刺激因子出现过强或过早的收缩反应3。包括呼吸道感受器功能异常，局部或中枢神经反射引起异常气道反应如平滑肌收缩、粘液分泌、组织充血等。同时气道平滑肌对刺激的反应异常，细胞内钙超载、收缩力增强和舒张能力减弱，甚至出现平滑肌数目增加（气道重构）4。TSTRPs通道：TRP通道是一类对钙离子通透的非选择性阳离子通道。在感觉神

5、经末梢及其胞体上高表达。TSTRPs通道主要包括TRPA1（17、cinnamaldehyde肉桂醛、acrolein丙烯醛、mustard oil芥子油）、TRPM8（8-28、menthol薄荷醇）、TRPV4（27）、TRPV3（33、camphor樟脑）、TRPV1（43、capsaicin辣椒素、protons质子）、TRPV2（52）。这些通道都对冷或热，以及化学刺激敏感。本研究的目的是建立研究细支气管感受器功能的实验模型，探讨TS-TRPs的激活对气道感受器的影响，初步阐明TS-TRPs在气道高反应性中的作用。二、材料与方法1建立动物哮喘模型选用成年雄性SD大鼠，在其腹股沟皮下和

6、腹腔注射卵清白蛋白和氢氧化铝,2周后雾化吸入1%的卵清白蛋白 ,每天一次,一次半小时,持续12周。2制作研究细小支气管感受器功能的实验模型用本巴比妥注入小鼠腹腔，使之麻醉后固定于鼠板，快速从胸骨柄处解剖至小鼠下颚，取出心与肺组织，立即投入盛有通过氧气的生理盐水的小烧杯，并快速取下左叶肺，在显微镜下置于通换氧气的Krebs液中，先固定，后打薄，使神经纤维末梢得以充分暴露。接着在支气管下寻找到伴随气管的神经纤维，将其用尖镊子分离成细丝，吸入电极。3在离体气道组织考察TS-TRPS在感受器功能中的作用先用机械刺激的方式，找到实验加药所需要的感受野。接着在此感受野用细针推注冰水以及60热水，进行冷热性

7、敏感实验，观察和记录刺激结果。之后用相同的方法注射化学刺激物，种类以及剂量如下：辣椒素（0.1uM,1uM,3uM,10uM）、CA (0.25mM,1mM)、Menthol (0.25mM,1mM)、Acrolein（0.1uM,1uM,3uM,10uM）、异氟烷，同样记录刺激结果、时相、保存图象。三、结果1哮喘模型雾化过程中，大鼠活动度减少、全身搔痒、呼 吸急促，出现点头呼吸，随着雾化吸入的天数增加，出现咳嗽，唇爪轻度紫绀。并且进行组织切片，组织切片显示雄性SD大鼠哮喘模型建立成功。第一幅图为正常支气管切片对照。哮喘组显示小气道痉挛，管壁明显水肿，周围炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞

8、为主。 支气管肺组织切片HE染色。A-C为模型组大鼠雾化吸入OVA一周后肺脏病理切片D为正常对照。（放大倍数A，×100； B，×400；C，×400； D，×40）2热刺激在60热水的刺激下，感受野神经纤维放电明显 给予60°C热刺激，神经纤维放电频率升高3冷刺激在8的冷刺激下，神经以抑制现象为主给予8°C冷刺激，神经可产生抑制4辣椒素cap随着浓度的增加，感受野神经纤维放电也越明显随着辣椒素剂量增大，神经纤维放电逐步增加5肉桂醛在肉桂醛刺激下，兼有神经兴奋与抑制现象出现肉桂醛刺激下，兼有神经兴奋与抑制现象出现6哮喘模型动物与正常动

9、物的比较 7正常大鼠对异氟烷的反应四、讨论支气管哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。这种慢性炎症导致气道高反应性增加，通常出现广泛多变的可逆性气流受限，并引起反复的喘气、气息、胸闷或咳嗽等症状。咳嗽反射作为哮喘中一个典型的症状，在慢性气道炎症中被加强了。A类纤维上的快适应机械感受器的激活可启动咳嗽反射，许多研究发现虽然快适应机械感受器不能被一些化学物质激活，C类纤维上的伤害感受器的激活也不能直接启动这个反射，但却可以降低咳嗽反射的阈值，使C类纤维的激活致敏咳嗽反射5。这个作用在后来的研究中发现是通过中枢机制实现的6。这使得C类纤维的伤害

10、性感受器的功能或表达增强可以通过中枢机制影响A类纤维，从而使哮喘表现出过多的咳嗽症状。在实验中，由于细支气管感受器可被辣椒素、肉桂醛和薄荷醇激活表明有功能性TRPV1、TRPA1、TRPM8的表达。在哮喘动物的细支气管的感受器对辣椒素和薄荷醇反应性明显增高，提示TRPV1和TRPM8的表达增多或功能增强，使得感受器敏感性升高，传入信号增多，并通过中枢反射导致了气道反应的增强，成为气道高反应性的一个可能的机制7。在对感受野进行冷热刺激后可，传入神经放电频率可有明显增加。冷刺激不仅能兴奋感受器，使放电频率增加，同时还可使放电频率降低，使神经抑制。热刺激主要以兴奋神经为主，放电频率有显著的增加。将正

11、常组与哮喘组放电频率峰值进行统计和比较发现哮喘组对冷热刺激的反应性要显著大于正常组。辣椒素（capsaicin）可特异性激活TRPV1，本实验中我们用三个浓度梯度的辣椒素对感受野进行刺激，发现三个剂量的辣椒素均能兴奋感受器。在对正常组和哮喘组的比较中发现哮喘组对三个剂量的辣椒素的反应性均要高于正常组。薄荷醇（menthol）可特异性激活TRPM8，对正常组和哮喘组的比较中发现哮喘组的频率峰值虽与正常组相比没有统计意义（薄荷醇剂量为300 M时放电频率峰值为911Hz，剂量为1mM时放电频率峰值处于1519Hz），但有趣地是对薄荷醇反应的肺组织比例哮喘组要显著大于正常组。在薄荷醇剂量为300 M

12、时，正常组的反应率为22.4%，哮喘组为64.4%。当剂量上升至1mM时正常组反应比例为64.3%，而哮喘组则为100%。肉桂醛（cinnamaldehyde）可特异性激活TRPA1，在实验中我们发现它很少可以使感受器兴奋，但有趣的是它与冷刺激类似，在多数情况下可以抑制感受器，使放电频率减低。在哮喘组和正常组之间并没有明显的区别。丙烯醛（acrolein）是汽车尾气重要成分，可特异激活TRPA1。汽车尾气作为大气污染之一也是诱发哮喘的重要因素。但在实验中我们较少观察到神经被兴奋，在少数反应的纤维中，剂量效应亦不明显。不同的TS-TRPs亚型的激活可引起感受器的活动发生改变，TRPV1 、TRP

13、V3和TRPM8的激活都引起感受器发生兴奋,而冷刺激、CA和acrolein除了使感受器发生兴奋外，也可引起抑制。CA、acrolein在实验中反应比例较少，在对这两种药物产生反应的感受野中，抑制占多数，兴奋占少数。提示TRPA1可能在感受器上表达较少，而通过TRPA1传向中枢的信号以抑制为主，这些抑制信号可能在生理上有特殊的意义8。在哮喘动物的细支气管的感受器上， TRPV1和TRPM8的“功能性表达”增多，导致感受器对刺激因素的敏感性增高。神经源性的炎症反应被认为在哮喘中起到重要的作用9,10,11。神经末梢的感受器兴奋可直接通过局部神经因子的释放来起作用。例如TRPV1，当他被激活后，通

14、过局部动作电位的逆行传导使得神经末梢释放神经激肽（NK）或由于TRPV1开放引起的末梢钙内流直接导致此肽类物质的出胞。后者与相应的受体结合导致气道平滑肌的舒张或收缩，粘液分泌，发生气道高反应性。12,13,14,15 。正常肺组织对异氟烷的反应在浓度为1.5%更为敏感，提示更高剂量的异氟烷可能会引起组织的对高剂量异氟烷的防御机制，使反应性降低16。由于是离体实验，故该防御机制可能存在于肺组织本身。 参考文献1Keiji Tabuchi , Makoto Suzuki , Atsuko Mizuno, Akira Hara.Hearing impairment in TRPV4 knockout

15、 mice.Neuroscience Letters 382 (2005) 3043082David D McKemy.How cold is it? TRPM8 and TRPA1 in the molecular logic of cold sensation.Molecular Pain,Published 22 April 2005.3Gordon Reid.ThermoTRP channels and cold sensing:what are they really up to?invited review,Received: 8 April 2005 / Accepted: 8

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18、 sensory receptors regulating cough.Cough,Published: 04 August 2005.8Thomas A. White, Ailing Xue, Eduardo N. Chini, Michael Thompson, Gary C. Sieck, and Mark E. Wylam. Role of Transient Receptor Potential C3 in TNF-Enhanced Calcium Influx in Human Airway Myocytes. AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY CEL

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