湖北省枫杨种质资源的收集及遗传多样性分析

1、华中农业大学硕士学位论文湖北省枫杨种质资源的收集及遗传多样性分析姓名:黎曙光申请学位级别:硕士专业:园林植物与观赏园艺指导教师:沈宝仙20070601 3.2遗传多样性分析结果提取植物基因组DNA一般以幼嫩的新鲜组织为材料,因为其细胞壁比较容易破解,而且与成熟的组织相比,从幼嫩的组织中提取的DNA含有多糖等杂质少。枫杨含多酚类物质多,容易褐化,在参考张虎平等(2003核桃基因标记的DNA提取方法的的基础上,本实验加大了PvP(从2%和增加到5%_和巯基乙醇的量(从2%增加到3%,结果褐化程度明显降低,磨样后的液体颜色从黑色变为绿色,静置lO 分钟后,颜色没有发现变化。比较SDS和CTAB两种不

2、同的方法提取了枫杨叶片中的基因组DNA,结果表明两种方法都能提取,但是CTAB提取的DNA检测带拖带少,效果更好(图3-1。图3.1CTAB法和SDS法提取的DNAFi￥一1DNA of CTAB and SDS extraetion。(左边为CTAB法提取的DNA以扩增的带型清晰无拖尾,条带数目在3条以上且有多态性为标准,从75条弓物中共筛选出的5条合适的引物用于所有样品的扩增,各引物的序列见表2。表3-2ISSR引物Table3-2ISSR PrimersISSRlISSIt2ISSIU注:R=A/G,(AGsYC(AG8YT队O8YA、=c江.1SSR4ISSR519(OA8RG (OA

3、sRT图2为引物筛选的图片,中间为Marker,1-11为初筛选出来的11条引物,两边是两个不同地方的DNA扩增图片,第2、4、8、9、10引物为复筛选出来的引物。 图2ISSR引物筛选Fi92Selection oflSSR primers经过实验比较,得出优化的PCR反应体系为:20llL的反应体系中,20ng/uL 的DNA模板1.0uL:10umoFuL的ISSR引物0.8uL:2mmol/L的dNTPsl uL:1U Taq酶;25mmoFL的M92+1.2uL:10X buffer2uL:双蒸水14.0uL。优化的反应程序为:94预变性3rain,然后进行36个循环:94变性40s

4、,55C 退火35s,72延伸90s,循环结束后72延伸5rain。经过统计,5条引物共检测到45条带,每个引物检测到的条带数介于5-13之间,平均每个引物检测到的条带数为9条;多态性条带43条,多态性百分率为95.6%,平均每个引物检测到的多态性条带数8.6条。表3.3ISSR引物扩增结果Thbk3-3Amplified results of珏;S日艮primers引物扩增条带数目多态性条带数目多态性带谱百分比primers Number of Number of Percentage of丝型堡盟!璺坐壁竖型!塑璺坐!型里坐坠唑ISSRl88100%ISSR25480%ISSR313131

5、00%ISSR47685.6%ISSR51212100%Total454395.6% 图3-3引物ISSR3扩增的ISSR图谱Fi93-3ISSR3amplification patterns by primer ISSRI(/A左至右From left to right:Marker ZXl ZX4-15,Marker对6个县市的样本,用筛选出的多态性强的5条引物和优化的反应程序作ISSR 扩增,得到多态性条带数5.13条不等,共计43条多态性带,遗传多样性分析表明,枫杨居群拥有较高水平的遗传多样性:物种水平遗传多样性相对较高,群体多态位点百分比(P达到95.6%,观测等位基因(Ao为1.9

6、500,有效等位基因(AE为1.5392,Neis遗传多样性度(IE为0.3254,Shannons多态信息指数(I为0.4943。各参考指数武汉地区的多态百分率,观测等位基因最高。钟祥地区的有效等位基因、Neis基因多样性和信息指数最高。武汉地区的多态性百分率为91.11%,观测等位基因(Ao为1.9111。有效等位基因(AE为1.3330,Neis基因多样性为0.2264, Shannons信息指数为0.3681。钟祥地区的多态性百分率为88.89%,观测等位基因(AD21 图3-5扦插成活图片Fi935Photo ofCutting survival 图3-6扦插生根图片Fi93-6Photo ofthe root ofCutting survival据枫杨的成活率的方差分析可知,成活率的高低与生根齐j和切口的关系并不明显。由此看出,我们在扦插时,采用的生根剂和切口形式对于提高枫杨的成活率并不显著。这可能与枫杨这个乡土树种的抗性高的特性相关;在试验田中,又有良好的水分条件,枫杨特别适合此生长环境。但是用低浓度生根剂处理的枫杨枝条扦插的成活率比无处理的要高,所以在生产实践中,生根剂对于提高枫杨的成活率存在的作用不容忽视,可以通过实验选出合适的生根剂和合适的浓度来提高扦插成活率。另外,斜口对于提高成活率的效果好于