膜片钳技术原理与日常维护

1、五 说教学过程 膜片钳技术的原理与日常维护膜片钳技术的原理与日常维护 主讲人：沈佩同主讲人：沈佩同 北京马普科学仪器有限公司北京马普科学仪器有限公司五 说教学过程 第一部分：膜片钳基础及原理第一部分：膜片钳基础及原理第二部分：膜片钳实验系统组成第二部分：膜片钳实验系统组成第三部分：膜片钳实验操作指南第三部分：膜片钳实验操作指南第四部分：膜片钳的应用第四部分：膜片钳的应用细胞膜的结构和离子通道：细胞膜的结构和离子通道：细胞膜由脂质双分子层和蛋白质组成，蛋白质又包括整合蛋白和表面蛋白。第一部分：膜片钳基础及原理第一部分：膜片钳基础及原理 离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个膜结构，是细胞内部与部

2、外联系的桥梁和细胞离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个膜结构，是细胞内部与部外联系的桥梁和细胞内外物质交换的孔道，当通道开放时，细胞内外的一些无机离子如内外物质交换的孔道，当通道开放时，细胞内外的一些无机离子如Na,k Ca Na,k Ca 等带电离子可经通等带电离子可经通道顺浓度梯度或电位梯度进行跨膜扩散，从而形成这些带电离子在膜内外的不同分布态势，这道顺浓度梯度或电位梯度进行跨膜扩散，从而形成这些带电离子在膜内外的不同分布态势，这种态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础。这些无机离子通种态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础。这些无机离

3、子通过离子通道的进出所产生的电活动是生命活动的基础，只有在此基础上才可能有腺体分泌、肌过离子通道的进出所产生的电活动是生命活动的基础，只有在此基础上才可能有腺体分泌、肌肉收缩、基因表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构和功能障碍决定了许多疾病的发生和肉收缩、基因表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构和功能障碍决定了许多疾病的发生和发展。因此，了解离子通道的结构、功能以及结构与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些发展。因此，了解离子通道的结构、功能以及结构与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些疾病的病理生理机制、发现特异性治疗药物或措施等均具有十分重要的理论和实际意义疾病的病理生理机制、发现特异

4、性治疗药物或措施等均具有十分重要的理论和实际意义. .如何研究离子通道如何研究离子通道对离子通道的研究主要从结构、功能以及结构与功能的关系三方对离子通道的研究主要从结构、功能以及结构与功能的关系三方面进行研究面进行研究1.1.结构研究：结构研究：分子生物学方法确定蛋白质序列；分子生物学方法确定蛋白质序列；X X光绕射方法光绕射方法确定其三维立体结构。确定其三维立体结构。2. 2. 功能研究：功能研究：电生理测定通过离子通道的电流或测量细胞膜电生理测定通过离子通道的电流或测量细胞膜电流或膜电位的变化，反映离子通道个体或群体的分子活动。电流或膜电位的变化，反映离子通道个体或群体的分子活动。3.3.

5、结构和功能相结合：结构和功能相结合：利用基因突变技术在一级结构的特定利用基因突变技术在一级结构的特定部位删除、添加或改变残基的序列，然后检测突变后的功能改变部位删除、添加或改变残基的序列，然后检测突变后的功能改变。离子通道功能观察的两种技术离子通道功能观察的两种技术对离子通道功能的研究，主要采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能，目前有如下两种技术电压钳(Voltage clamp)技术膜片钳(patch clamp)技术电压钳技术电压钳技术(Voltage Clamp)(Voltage Clamp)：电压钳技术，是20世纪初由Cole发明， Hodgkin和Huxley完善，其设计的主要

6、目的是为了证明动作电位的产生机制，即动作电位的峰电位是由于膜对钠的通透性发生了一过性的增大过程。但当时没有直接测定膜通透性的方法，于是就用膜对某种离子的电导来代表该种离子的通透性，膜电导测定的依据是电学中的欧姆定律，如膜的Na电导GNa与电化学驱动力（Em-ENa)和膜电流INa的关系GNa= INa/ （Em-ENa).因此可通过测量膜电流，再利用欧姆定律来计算膜电导，但是，利用膜电流来计算膜电导时，记录膜电流期间的膜电位必须保持不变，否则膜电流的变化就不能代表膜电导的变化。这一条件是利用电压钳技术实现的。下张幻灯中的右边两张图是Hodgkin和Huxley在半个世纪以前利用电压钳记录的抢乌

7、贼的动作电位和动作电位过程中的膜电流的变化图，他们的实验首次证明参与动作电位的离子流由Na, k ,漏（Cl）三种成分组成。并对这些离子流进行了定量分析。这一技术对阐明动作电位的本质和离子通道的的研究做出了极大的贡献。coleK+电流Na+电流电压钳的原理：电压钳的原理：用两根尖端直径用两根尖端直径0.5um0.5um的电极插入细的电极插入细胞内，一根电极用作记录电极以记录跨膜电位，用另胞内，一根电极用作记录电极以记录跨膜电位，用另一根电极作为电流注入电极，以固定膜电位。从而实一根电极作为电流注入电极，以固定膜电位。从而实现固定膜电位的同时记录膜电流。电位记录电极引导现固定膜电位的同时记录膜电

8、流。电位记录电极引导的膜电位（的膜电位（VmVm）输入电压钳放大器的负输入端，而人）输入电压钳放大器的负输入端，而人为控制的指令电位（为控制的指令电位（VcVc）输入正输入端，放大器的正）输入正输入端，放大器的正负输入端子等电位，向正输入端子施加指令电位（负输入端子等电位，向正输入端子施加指令电位（VcVc）时，经过短路负端子可使膜片等电位，即时，经过短路负端子可使膜片等电位，即Vm=Vc,Vm=Vc,从而从而达到电位钳制的目的，并可维持一定的时间。达到电位钳制的目的，并可维持一定的时间。VcVc的不的不同变化将导致同变化将导致VmVm的变化，从而引起细胞膜上电压依赖的变化，从而引起细胞膜上电

9、压依赖性离子通道的开放，通道开放引起的离子流反过来又性离子通道的开放，通道开放引起的离子流反过来又引起引起VmVm的变化，致使的变化，致使VmVc, VcVmVc, Vc与与VmVm的任何差值都会的任何差值都会导致放大器有电压输出，将相反极性的电流注入细胞，导致放大器有电压输出，将相反极性的电流注入细胞，以使以使Vc=VmVc=Vm，注入电流的大小与跨膜离子流相等，但，注入电流的大小与跨膜离子流相等，但方向相反。因而注入的电流被认为是标本兴奋时的跨方向相反。因而注入的电流被认为是标本兴奋时的跨膜电流值（通道电流）。膜电流值（通道电流）。指令电位指令电位（Vc)+ +_ _Vo电位记录电极电位记

10、录电极（Vm)电流注入电极电流注入电极(I)电压钳的缺点：电压钳的缺点：电压钳技术目前主要用于巨大细胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用。但也有其致命的弱点：1、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性；2、不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的通道，而且背景噪音大，往往掩盖了单一通道的电流。 3、对体积小的细胞(如哺乳类中枢神经元，直径在1030m之间)进行电压钳实验，技术上有更大的困难。由于电极需插入细胞，不得不将微电极的尖端做得很细，如此细的尖端致使电极阻抗很大，常常

11、是608OM或120150M（取决于不同的充灌液）。这样大的电极阻抗不利于作细胞内电流钳或电压钳记录时在短时间（0.1s）内向细胞内注入电流，达到钳制膜电压或膜电流之目的。再者，在小细胞上插入的两根电极可产生电容而降低测量电压电极的反应能力.NeherSakmannHodgkinHuxley19631963年诺贝尔奖，提出离年诺贝尔奖，提出离子通道概念子通道概念19911991年诺贝尔奖，提出膜年诺贝尔奖，提出膜片钳技术片钳技术探头探头计算机计算机模数转换模数转换膜片钳放大器膜片钳放大器样品池样品池单细胞单细胞膜片钳（膜片钳（Patch Clamp)Patch Clamp)的基本原理的基本原理

12、利用尖端直径0.5-1um的玻璃电极吸附到细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端和细胞膜形成紧密封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（patch）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定膜电位(clamp)，然后对电极尖端下面积仅为几平方微米的细胞膜片上一个或几个离子通道的电流进行记录。从而将电生理学技术提高到记录和研究单个蛋白质的分子水平.膜片钳与电压钳的区别膜片钳与电压钳的区别膜片钳膜片钳 电压钳电压钳相同点相同点都是通过钳制膜电位而记录离子通道电流都是通过钳制膜电位而记录离子通道电流不同点不同点钳制方法不同钳制方法不同高阻封接高阻封接细胞内插入电极细胞内插入电极所用电极不同所用电极不同低阻

13、抗电极低阻抗电极2-15M2-15M高阻抗电极高阻抗电极10-100M10-100M钳制面积不同钳制面积不同小片膜小片膜整个或大块细胞膜整个或大块细胞膜记录的通道数不同记录的通道数不同一个或几个一个或几个所有通道所有通道根据实验要求，可组建不同的实验系统。但也有一些共同的基本组成部件，其中包括电子学部件:放大器；计算机接口，数据采集、分析系统。光学部件和光电接口：显微镜；监视器等。机械系统:防震台等。辅助系统：电极拉制器；切片机；孵育槽；灌流系统等 第二部分第二部分: :膜片钳实验系统组成膜片钳实验系统组成Heka EPC10 单细胞膜片钳系统Heka EPC10 脑片膜片钳系统Axon 20

14、0B 单细胞膜片钳系统Axon 200B 脑片膜片钳系统Axon 700B 脑片膜片钳系统脑片膜片钳系统EPC10 doubleEPC 10 plus国内正规代理商：北京先仪谱科技有限公司Add:北京市海淀区善缘街1号立方庭1-921室 Website: Tel汉东乐科技有限公司地址：武汉市江汉区常青路284号航天花园301-1-3B室网站： 电话Axon 200BAxon 700B国内正规代理商北京马普科学仪器有限公司地址：北京市朝阳区立汤路218号明天生活馆C1546网站：电话：18901292166E-m

15、ail: 细胞贴附式细胞贴附式全细胞记录式全细胞记录式外面向外式外面向外式内面向外式内面向外式单通道电流单通道电流膜电位或膜电流膜电位或膜电流膜片钳的几种记录模式极其形成：各种记录模式的形成过程各种记录模式的形成过程第三部分：膜片钳实验操作指南第三部分：膜片钳实验操作指南膜片钳实验的基本过程：膜片钳实验的基本过程：1 1、液体配制：主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保、液体配制：主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持两个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。所有液体在使用前必须过滤。持两个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。所有液体在使用前必须过滤。2.2.标本制备标本制备3.3

16、.记录记录4 4、资料分析：、资料分析：（1 1）一般电学性质：通过）一般电学性质：通过I-VI-V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。（过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。（2 2）动）动力学：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与力学：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型（簇状猝发（关闭类型（簇状猝发（BurstBurst）样开放与闪动样短暂关闭（）样开放与闪动样短暂关闭（flickeringflickering），）

17、，化学门控性通道的开、关速率常数等。（化学门控性通道的开、关速率常数等。（3 3）通过对全细胞激活曲线或失活）通过对全细胞激活曲线或失活曲线的分析，可得到半数激活或失活电压曲线的分析，可得到半数激活或失活电压VhVh及斜率因子及斜率因子K K。（。（4 4）药理学：）药理学：阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响。阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响。 （5 5）综合分析得到）综合分析得到最后结论。最后结论。 10M10Ma膜片钳使用的标本膜片钳使用的标本 1. 1.单细胞：单细胞：急性分散细胞和培养细胞2.2.脑片或组织块。脑片或组织块。3.3.整体动物。整体动物。要求：要求：

18、膜片钳80%的时间在于制备细胞。细胞表面要干净,不能有胶质细胞等蛋白质物质。细胞状态良好，表面光滑，无麻斑，无肿胀或皱缩。脑片单细胞电流信号电流信号单通道电流单通道电流全细胞电流全细胞电流突触电流突触电流电压信号电压信号阈电位阈电位静息电位静息电位动作电位动作电位膜片钳记录的信息膜片钳记录的信息电压钳模式电压钳模式电流钳模式电流钳模式1. 1.单通道电流单通道电流1.1.典型的单通道电流呈一种振幅相同而典型的单通道电流呈一种振幅相同而持续时间不等的脉冲样变化。有两个电持续时间不等的脉冲样变化。有两个电导水平，即导水平，即0 0和和1 1，分别对应通道的关闭，分别对应通道的关闭和开放状态。和开放

19、状态。2.2.有的矩形脉冲簇状发放时，通道电流有的矩形脉冲簇状发放时，通道电流不在同一水平，可以明显观察到不同数不在同一水平，可以明显观察到不同数目离子通道所形成的电流台阶，从而可目离子通道所形成的电流台阶，从而可推断出被测膜片的通道数目。推断出被测膜片的通道数目。3.3.有的通道可记录到圆滑型和方波形两有的通道可记录到圆滑型和方波形两种形式。种形式。4.4.有些通道开放活动是持续开放，中间有些通道开放活动是持续开放，中间被闪动样的关闭所中断，形成被闪动样的关闭所中断，形成burstburst开放。开放。有些通道开放活动是簇状开放与短期平有些通道开放活动是簇状开放与短期平静交替出现，形成簇状发放串（静交替出现，形成簇状发放串（Cluster)Cluster)2. 2. 全细胞电流全细胞电流全细胞电流是一些形状各异的电流曲线全细胞电流是一些形状各异的电流曲线IAcurrents2nA20msNa+ currentsIKcurrentsVh=-80mV40mV-60mV3.Glu受体电流受体电流2s1nA500ms1nA250ms400pA5.mEPSC4.sEPSC突触电流突触电流6.6.神经元动作电位神经元动作电位 第四部分：膜片钳的应用 膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且直接或间接为临床医学研究服务， 目前膜片钳技术