非清髓异基因外周血造血干细胞移植后嵌合体分析

1、非清髓异基因外周血造血干细胞移植后嵌合体分析 08-03-10 11:33:00 编辑：studa20 作者：陈宝安，熊辉霞，丁家华，苏恩本，赵刚，王骏，高冲，孙耘玉，程坚 【摘要】 本研究旨在探讨非清髓异基因外周血造血干细胞移植(NAPBSCT)后造血嵌合体的临床意义。采用FBC(氟达拉宾+白消安+环磷酰胺)阿糖胞苷（Ara-C）预处理方案，对28例血液病患者进行NAPBSCT，采集供者和受者术前外周血及术后不同时间段的序列血样，用STR-PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染色和凝胶成像分析技术半定量方法计算供体细胞嵌合率。 结果显示：移植后1月，28例患者中1例移植失败，22例形成完全供者造

2、血嵌合体(CC)，5例形成混合造血嵌合体(MC)；移植后7天时供者细胞即占优势（74.71%），较中性粒细胞（ANC）和血小板（Plt）的平均恢复时间均明显提前；CC组的aGVHD发生率高于MC组（P0.05），两组cGVHD发生率无显著差异（P0.05）；1例MC患者发生早期移植排斥；CC组和MC组复发率无显著差异（P0.05），1例在CC状态下复发。3例MC患者经早期临床干预治疗获得CC和完全缓解。结论：造血嵌合体的动态定量检测对判断早期植入，预测移植物排斥、复发和GVHD，以及指导临床干预治疗具有重要意义。 【关键词】 非清髓造血干细胞移植Analysis of Hematopoieti

3、c Chimerism after Non-myeloablative Allogeneic Peripheral Blood Stem Cell TansplantationAbstract The aim of this study was to analyze the hematopoietic chimerism after non-myeloablative allogeneic peripheral blood stem cell transplantation(NAPBSCT).28 patients received NAPBSCT were evaluated.The con

4、ditioning regimen included FBC (fludarabine，busulphan，cyclophosphamide) Ara-C.Peripheral blood was collected before and after transplantation in different periods.Semi-quantitative assessment of hematopoietic chimerism was performed by short tandem repeat-polymerase chain reaction(STR-PCR)，polyacryl

5、amide gel electrophoresis (PAGE)and silver staining，and analyzed by Image Analysis System.The results showed that on day 30 after transplantation，one patient failed to engraft，but 22 cases formed complete chimerism(CC) and 5 cases were of mixed chimerism.On day 7 after transplantation，the average pe

6、rcentage of donor cells was 74.71%. The time of dominance of the donor-specific allelic pattern preceded the recovery time of neutrophils and platelets.The incidence of aGVHD in group CC was significantly higher than that in group MC(P0.05).There was no significant difference in the incidence of cGV

7、HD and disease relapse between group CC and group MC（P0.05）.One patient relapsed in CC status without a transitional stage of MC.One patient with MC rejected grafts in early stage.3 patients with MC transferred to CC and got complete remission after early implementation of therapy.It is concluded th

8、at sequential and quantitative detection of chimerism may be of great value to evaluate engraftment and to predict graft rejection，disease relapse and GVHD.Furthermore，it may provide a basis for early intervention treatment in the related complications.Key words non-myeloablative stem cell transplan

9、tation; non-myeloablative allogeneic peripheral blood stem cell transplantation; CTR-PCR; hematopoietic chimerism非清髓异基因造血干细胞移植（NASCT）时由于减量的放、化疗预处理加上强效的免疫抑制，在移植后多形成供、受体细胞不同比例的混合嵌合体（MC）1，2，并呈动态变化。造血嵌合体的动态定量检测对判断早期植入、移植物排斥和白血病复发、掌握GVHD的发生规律、实施临床干预治疗、减少移植相关并发症、提高疗效都具有重要意义。我们采用STR-PCR结合凝胶电泳成像分析技术对28例接受NA

10、SCT治疗的患者进行了嵌合体的动态监测，并对其临床意义进行了分析。材料和方法病例及供者2003年1月至2005年3月在我院血液科接受非清髓异基因外周血造血干细胞移植的患者28例，男19例，女9例，年龄15-58岁，中位年龄37岁。其中慢性粒细胞白血病（CML）19例，慢性淋巴细胞白血病(CLL) 1例，急性非淋巴细胞白血病(AML) 3例，骨髓增生异常综合征(MDS) 4例，非霍奇金淋巴瘤(NHL) 1例。供者28人，其中同胞供者24人，无血缘关系供者2人，HLA配型均为全相合；单倍相合亲缘供者2例，均DR位点不合。供、受者性别相合18例，性别不合10例。ABO血型相合21例，血型不合7例。供

11、、受者具体情况见附表。方法非清髓性预处理采用FBC预处理方案，即氟达拉宾 （Flud）30 mg/m2，于移植前7-2天静脉点滴；白消安（BU）4 mg/（kgd），移植前6-5天，口服；环磷酰胺( CY)350 mg/（m2d），移植前3-2天静脉点滴，急性白血病和疾病进展期患者加用阿糖胞苷（Ara-C）。外周血干细胞的动员和回输所有供者用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员外周血干细胞，5 g/（kgd）皮下注射，共5天，第5，6天用CS-3000 Plus血细胞分离机(Baxter公司)分离外周血干细胞2次，每次循环血量10 L左右。所有患者均接受未去T细胞移植物，输注单个核细

12、胞数（MNC）平均为6.3108/ kg，CD34+细胞数平均为4.8106/kg。GVHD的防治采用环孢菌素A（CsA）联合骁悉(MMF)方案，即CsA 3 mg/（kgd），移植前1天开始给予，持续24小时静脉滴注，正常进食后改为口服，维持血药浓度在200-400 ng/L，至100天停药。MMF 1.0 /d，分2次口服，从移植后1-27天应用。无关供者移植的病例加用短程甲氨蝶呤（MTX），即移植后第1天为15 mg/m2，第3，6，11天为10 mg/m2，静脉滴注。嵌合体检测术前采集供者和受者外周血2 ml，术后7、14、21和30天采集患者外周血，此后根据患者随访时间采集外周血，每

13、月1次或每3月1次。移植后早期每次采血5 ml，此后每次2 ml，ACD抗凝，于采血后24小时内用红细胞裂解液裂解红细胞，提取白细胞，Chelex-100法快速提取基因组DNA。按文献选择D5S818、D13S317、D3S1358、D8S1179、D7S820、D16S539、FGA、vWA 8个STR位点进行PCR扩增3，4，经非变性非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色法鉴定PCR扩增产物，最后用UVP凝胶成像分析仪进行扫描成像分析，选择各自的嵌合体计算公式5，以供、受者特异性等位基因带的峰面积比值计算嵌合率，结果取所有I类和类位点的平均值6。嵌合体界定 供体细胞（DC）95%为完全嵌合体

14、（CC），5%DC95%为混合嵌合体（MC）7。Table.Clinical characteristics of patients and donors（略）统计学处理题应用SAS 8.0统计软件进行分析，采用Fisher精确概率法计算P值。结果造血嵌合体的形成和演变以移植后1月为界判定造血细胞嵌合体，28例患者中1例MDS-RA的患者移植失败未检测到嵌合体，自体造血亦未恢复而死于严重感染。余27例患者均形成不同比例的造血嵌合体，其中22例形成CC（81.48%），5例形成MC（18.52%）。随访1.5-27月，平均11个月，22例CC患者中3例随后出现DC下降和受者成分的增加，并相继出现白血病复发；1例在CC状态下复发，18例保持稳定CC。5例MC患者中，1例CLL患者早期出现移植排斥，经2次供者淋巴细胞输注（DLI）后逐渐达到CC；2例早期复发，其中1例死亡，1例经二次标准移植后获得CC；1例首先出现细胞遗传学复发，DC进一步下降，迅速转变为完全受者型造血，临床血液学复发；另1例MC患者移植1个月后三系细胞进行性下降，脾肿大，骨髓增生明显活跃，诊断脾功能亢进，STR-PCR检查持续MC，移植后4个月时行脾切除治疗，8个月时转为CC。造血嵌合体与造血恢复