肿瘤的多药耐药及耐药逆转剂研究

1、    肿瘤的多药耐药及耐药逆转剂研究        【关键词】恶性肿瘤；化学药物治疗；多药耐药；机制；耐药逆转剂中分类号：R73-36；R730.53文献标识码：A文章编号：1009-4571(2000)01-0073-04目前，尽管不断有新的化疗药物和化疗方案推出，但肿瘤细胞对多种化疗药物产生的多药耐药性(multidrug resistance, MDR)仍是化疗失败的主要原因。所谓MDR系指肿瘤对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他许多结构各异、作用机制不同的抗肿瘤药

2、物亦产生交叉耐药现象。MDR现象可以原发性和继发性两种形式出现。原发性(primary resistance)是肿瘤细胞固有的对化疗药物不敏感，故首次使用化疗药物就产生耐药；继发性(secondary resistance)则是初始对化疗药物敏感，但经过几个疗程化疗后，对化疗药物产生耐药。肿瘤细胞的MDR现象是肿瘤治疗中最常见和最棘手的问题，要提高恶性肿瘤化疗的有效性，就必须深入研究MDR的机制及寻求有效的逆转MDR的对策。1MDR的机理研究肿瘤的MDR现象产生的途径较多，有其复杂的分子学基础，目前，MDR的机理研究主要包括以下几个方面。1.1多药耐药基因及其编码的P-糖蛋白过度表达化疗药物问

3、世不久，临床上就发现了多药耐药现象，如对阿霉素耐药的肿瘤细胞能对多种从未使用过的化疗药物如长春碱类和表鬼臼毒素类产生耐药。1976年Juliano等1在耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现了一种分子量为170 kD的糖蛋白，被命名为P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)。P-gp在敏感细胞中通常检测不出，而在MDR细胞株中却有高水平表达。P-gp是一种分子量为170 kD的跨膜糖蛋白，由人类MDR基因家族中与耐药有关的MDR1基因编码2。人类MDR1基因定位于第7号染色体的q21.1带的330 kb中，编码4.55.0 kb mRNA，其编码的P-170糖蛋白(P-gp)由1 280个

4、氨基酸组成的2个完全相同的单体组成，其分子中有12个跨膜区和2个ATP结合位点3，嵌插在细胞的浆膜上，跨膜区作为膜通道有利于物质转运，而ATP结合位点与能量供应有关。故P-gp具有能量依赖的跨膜药物外输泵功能，可将细胞内底物包括多种抗肿瘤药物泵出胞外，使胞内药物积聚浓度下降，产生耐药，呈现典型MDR表型。几乎所有的人类肿瘤细胞均有不同程度的MDR1P-gp的表达，但是那些对化疗不敏感或疗效差的肿瘤往往有较高的MDR1基因表达4。某些天然性疏水性抗肿瘤药物较易被过度表达的P-gp泵出细胞外，其中包括目前临床上抗肿瘤药的主体蒽环类、天然植物碱类和表鬼臼毒类。新近的研究还显示5，人体正常组织器官也同

5、样有不同程度的MDR1基因表达，在具有分泌和排泄功能的器官组织如肾上腺、直肠、肝脏和肺脏中就有较高的MDR1基因表达，而在骨髓、淋巴细胞、食管等组织中低表达，推测其功能可能与细胞的物质转运和降低有害外源物质对细胞的损害有关。临床观察表明MDR1表达水平较高的正常组织器官所发生的肿瘤，其肿瘤组织中检测到的MDR1基因表达水平也较高，这些肿瘤在临床上往往对化疗不敏感或疗效差。这一现象提示MDR1基因的表达水平与肿瘤的原发性耐药有关。而体外耐药株的获得则常用以解释体内继发性耐药的机理。体外耐药株是通过逐渐增加某一抗肿瘤药物浓度的方法，通过药物选择作用在体外培养系中获得，但体内因素远较体外因素复杂，对

6、原发性、继发性耐药的机理均未确切阐明，P-gp介导的MDR的本质有待进一步的深入研究，为临床逆转P-gp介导的MDR提供坚实的理论基础。由P-gp介导的MDR习惯上称典型MDR，但应当指出，P-gp并不能解释所有的肿瘤耐药现象，一些非P-gp介导的MDR已获初步认识并越来越多地受到重视。1.2多药耐药相关蛋白介导的MDR近年的研究发现，在某些具有MDR现象的肿瘤中，无法检测到MDR1基因及其表达产物P-gp。在这些非P-gp MDR细胞的细胞膜上发现了一种分子量为190 kD的膜糖蛋白6，称为多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein; M

7、RP)。 MRP有其独立的基因编码，定位于染色体16p13.1上，编码6.5 kb mRNA、 MRP也位于细胞膜上，由1 531个氨基酸组成。MRP与P-gp有许多相似之处，MRP与P-gp在氨基酸序列上有14%同源性，同源序列集中于ATP结合区7，8；MRP与P-gp一样，也是一种能量依赖泵9，表达MRP的肿瘤细胞也具有药物的膜外排泵作用，从而呈现非P-gp MDR表型。编码MDR的基因在正常组织细胞中亦有低水平表达，但MRP和MDR1两者之间的表达无相关性10。1.3肺耐药相关蛋白介导的MDR1993年，Scheper等又发现一种新的与MDR有关的蛋白质，即肺耐药相关蛋白(lung re

8、sistance-related protein, LRP)，它是一种非糖蛋白，定位于第6号染色体短臂16p11.2，与MRP的基因位置十分接近11。LRP cDNA全长2.8 kb，编码一种由896个氨基酸组成，分子量约为110 kD的蛋白质。经测定LRP cDNA全序列发现其氨基酸序列有87.7%和褐鼠的穹窿体蛋白(major vault protein, MVP)具有同源性，故推测LRP就是人的MVP。MVP是穹窿体的主要组成部分。穹窿体大部分位于细胞质中，有5%与核膜相连，位于核孔附近，在细胞的生理过程中起关键作用，一方面参与细胞核与细胞质间物质交换的调控，另一方面可能与细胞质中的囊泡

9、运输有关12。故LRP可能通过两种机制引起MDR。第一，它可以使那些以细胞核为靶点的药物不能通过核孔进入细胞核，有些药物即使进入了核内也会很快被转运到胞质中；第二，可使细胞质中的药物进入运输囊泡，呈房室性分布，最终通过胞吐机制排到胞外12。LRP能够介导对顺铂、卡铂、烷化剂等一些P-gp不能介导的药物耐受，这些药物的一些共同特点是以DNA为靶点，这也暗示LRP可能主要通过核靶点屏蔽机制引起MDR13。LRP广泛分布于正常组织及肿瘤组织中13，但表达程度不一，在支气管上皮、肠道上皮、肾小管上皮等具有分泌或排泄功能的组织中表达水平高，其表达水平的差异可反应不同的肿瘤对化疗的敏感性不同及预后的差异。

10、1.4拓扑异构酶介导的MDRDNA拓扑异构酶(Topo)可调节DNA空间结构，参与DNA的重组、修复、转录、复制过程。按其性质分为DNA Topo-和DNA Topo-。前者介导一条DNA链断裂，后者可以同时切断双链DNA，并瞬间变构再连接起来。在真核细胞中Topo-的生理功能更为重要，在DNA复制、转录、有丝分裂、染色体分离、修复中起到关键作用14。近年来发现Topo-有两个亚型，根据其等电位点不同分为、同功酶。许多抗肿瘤药物以Topo为靶点，选择性抑制增殖期DNA复制细胞，集中杀伤肿瘤细胞，有很好的选择性，如DNA嵌入剂柔红霉素、阿霉素，非嵌入剂喜树碱、足叶乙甙都是通过抑制拓扑异构酶的活性

11、，干扰DNA的遗传代谢从而发挥抑制肿瘤细胞生长的药理作用15，16。而细胞内Topo的变化是产生耐药性不可忽视的因素。目前研究较多的是Topo-与MDR的关系。研究表明，Topo-介导的MDR表现为耐药细胞酶转录水平和活性降低，而且一些酶学特征也有所改变，如对ATP的依赖增加，Topo-可以更有效、更快地通过链过度而重新连接DNA链，使药物-酶-DNA复合物形成减少，药物失去效靶。同时，Topo-还可以参与特殊耐药基因的调控，合成出具有特殊排泵功能的膜蛋白，将药物泵出胞外，从而产生耐药。因此，Topo不但与其抑制剂耐药有关，同时与其他药物耐药也有关系15。其耐药机理的研究目前主要归纳为以下三个

12、方面：耐药细胞相关基因的改变；DNA-Topo活性和含量的改变；DNA-Topo调控因素的改变16。1.5谷胱甘肽-S-转移酶GST介导的MDR谷胱甘肽-S-转移酶GST是由GST超基因家族相应基因编码的一个与细胞解毒功能有关的多功能蛋白家族。GST通过酶催化反应或谷胱甘肽结合形式与亲脂性细胞毒药物结合，增加其水溶性，促进药物外排，从而降低抗肿瘤药物对肿瘤细胞的细胞毒作用。烷化剂及铂类药物均可通过这一途径解毒。GST有三种亚型：GST-、GST-、GST-，其中GST-在不少肿瘤中均有明显的基因扩增与表达水平增高17，是目前认为与肿瘤耐药关系最密切的一种GST。关于GST活性增高的机理尚无确切

13、解释，可能与细胞在药物压力下的适应性反应有关。1.6蛋白激酶C介导的MDR蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是一种钙离子、磷脂依赖，需二乙酰甘油(DAG)活化的激酶，是由一个超基因家族编码同源性很高的相关分子组成的一组酶，已发现7种不同形式的异构体，在细胞的跨膜信号和调节细胞生长分化中有广泛的作用。目前许多研究表明，PKC在MDR的发生发展中起重要作用。PKC可在转染细胞中稳定表达并呈现MDR表型。通过药物选择法获得的MDR细胞株常伴有PKC含量和活性增高，均表明PKC与MDR的相关性。有关PKC在MDR发生发展中的作用机制已有初步研究。通过参与蛋白磷酸化，PKC可以参与

14、调节P-gp磷酸化程序，提高P-gp生物活性。由于这方面的研究起步较晚，其机制还不清楚，但PKC家族在MDR发生发展中的作用是基本可以肯定的。综上所述，MDR是一高度异质性现象，除上述MDR介导机制外，一些其他机理研究如DNA损伤修复增强机制，氯离子通道改变机制等亦在研究之中，并且一个MDR细胞系可以存在一种或多种耐药机制，不同的MDR细胞系耐药机制可以不同，通过深入研究可能还会有新的发现。这对进一步从分子水平指导药物的选择和提高化疗的有效性，提高恶性肿瘤的生存率和延长无瘤生存期均有重要的临床意义。2多药耐药逆转剂研究在研究MDR机理的同时，如何克服MDR是目前国内外研究的重要课题。目前的主要

15、逆转手段是应用MDR逆转剂。继Tsuruo等18首次报道维拉帕米能逆转肿瘤细胞的耐药之后，利用体外培养的各种肿瘤MDR细胞株研究发现多种药物有逆转MDR的作用，这些物质包括以下几类：钙离子通道阻滞剂；钙调蛋白抑制剂；环孢菌素类；抗心律失常药(奎尼丁、胺碘达隆)；抗疟药；抗雌激素类(三苯氧胺及其衍生物)；蛋白激酶抑制剂；表面活性剂；中药逆转剂；P-gp单克隆抗体。虽然筛选出的逆转药物很多，但由于要在体内达到体外逆转试验有效浓度所需剂量过大，副作用明显，因而限制了它们的临床应用19。目前，倍受关注的逆转剂有以下几种。2.1维拉帕米维拉帕米 (Verapamail，VER)是最早发现具有逆转MDR的

16、逆转剂。研究表明VER逆转MDR的机理是抑制P-gp的药物外泵功能，从而增加细胞内化疗药物的浓度而逆转耐药20。但欲达体外研究效果所需VER的剂量，远远超过了机体所能承受的维拉帕米血药浓度，故体内效果远不及体外实验那样令人振奋。但体内所能承受的VER血药浓度尽管较低，也能产生逆转效果21，仍有临床应用前景，并已有用于白血病治疗的报道。目前发现一些VER的类似物有更强的逆转作用，如右旋VER是VER的旋光对应体，在体外已证明其与VER具有相似的耐药逆转活性和较低的心脏毒性，且右旋VER及其代谢物在血清中可以达到体外逆转MDR的浓度。Wilson等22对EPOCH(鬼臼乙叉甙、强地松、长春新碱、环

17、磷酰胺、阿霉素)化疗方案耐药的淋巴瘤病人加以右旋VER治疗，观察到右旋VER不仅没有增加EPOCH的药物毒性，而且在治疗的12例中，有1例完全缓解，6例部分缓解，5例好转。2.2环胞菌素A许多体外实验已证明环孢菌素A(CSA)逆转MDR的作用是VER的23倍，是一种有效的耐药逆转剂。初步临床研究表明；常规剂量为15 mg/(kg.d)，体内药物浓度能达到体外耐药逆转所需的水平23。近几年国内外研究证实，CSA可提高MDR细胞的细胞内药物浓度，在非毒性剂量浓度4 g/ml以下，能逆转k562/VCR细胞耐药24，且其作用远强于VER，是目前临床应用效果相对较好的一种非细胞毒性逆转药物。但CSA是

18、一种强的免疫抑制剂，可使本来免疫力低下的肿瘤病人抵抗力进一步降低，导致重度感染，且其严重的肾脏损害亦影响了临床的应用。目前，对其类似物PSC833-CSA等的研究表明，新合成的CSA衍生物显示出比CSA更强的逆转效果，且没有肾毒性、免疫抑制活性及血流动力学方面的副作用，显示出比CSA更好的应用前景。2.3其他类三苯氧胺(TAM)是雌激素非完全拮抗剂，通过抑制钙调蛋白调控MDR，作为MDR逆转剂已用于临床。奎尼丁是一种抗心律失常药，它作为一种逆转剂已进入了期临床试验。此外潘生丁及其衍生物BIBW22，某些生物制剂如粒单集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-亦有逆转MDR的作用。2.4中药逆转MD

19、R中药的药理作用广泛，副作用小，从中药中筛选MDR逆转剂有广阔前景。潘启超26研究了11种具有钙阻滞作用的中药单体，发现对长春新碱天然耐药的BCL-7402细胞株，大多数中药单体都有类似VER的体外细胞毒增效作用；其他还研究了属双苄基异喹啉(BBI)生物碱的中药单体，例粉防已碱、蝙蝠葛碱等具有较好的耐药逆转作用。结果提示从BBI生物碱中寻找逆转耐药作用强、特异性高而毒副作用小的药物是很有希望的。从中药方剂R1提取液的无细胞毒浓度可完全逆转MCFADR7的MDR26。中药R3(补骨脂抽提剂)可能通过抑制P-gp功能，增加ADM在MCFADR7耐药细胞中浓度而逆转MCFADR7的耐药性27。总之，

20、肿瘤的MDR现象是困扰临床治疗的一大难题，解决MDR的根本问题还在于全面深入研究和阐明MDR产生的机制，寻找产生MDR的本质，以寻求从根本逆转MDR的对策。我们相信随着MDR机理的深入研究，检测方法及逆转方法的不断改进，人类能够最终克服肿瘤的MDR现象，在肿瘤的防治方面出现突破性进展。作者单位：李秀荣（济南市山东中医药大学附属医院内科肿瘤血液病组250011）吕翠霞（济南市山东中医药大学基础学院250014）宋茂美（济南市山东中医药大学附属医院内科肿瘤血液病组250011）焦中华（济南市山东中医药大学附属医院内科肿瘤血液病组250011）参考文献：1JuLiano RL, Limg V. A

21、surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese bamster ovary cell mutans J.Bilchem Biophys Acta, 1976,455:152-156.2Callen DF,Baker E,Simmers RN，et al. Localization of the human multiple drug resistance gene,MDR1 to 7q21.1 J.Hum Gene, 1987,77(2):142-144.3Chen CJ, Chin JE, Ueda K,et al.I

22、nternal duplication and homology with bacterialtran-sport proteins in the mdr1 gene from multidrug resistant human Cells J. Cell,1986,47:381-383.4Glodstein LJ, Galski H, Fojo AT, et al. Expression of a multidrug resistance gene in human cansers J. J Natl Cancer Inst ,1987,81:116-118.5Pavelic ZP, Rei

23、sing J, Pavelic L, et al. Detection of Pglycoprotein with four monoclonal antibodies in normal and tumor tissuesJ. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1993,119:753-759.6Baarrand MA, Broxterman HJ, Wright KA, et al. Immunodetection of a 190 kD Protein non-P-glycoprotein-containing MDRcells derived from

24、small cell and non-small-cell Lung tumors J. Br J Cancer ,1992,65:21-25.7Cole SPC, Bhardwa JG, Gerlach JH, et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line J. Science, 1992,258:1650-1653.8Krishnamachary N, Center MS.The MRP gene associated with a non-p

25、-glycoprotein multidrug resistance encodes a 190 kD membrane bound glycoprotein J. Cancer Res, 1993,53：3658-3661.9Jedlitschky G, Leier I, Buchhdz U,et al. ATP-dependent transport of glutathione S-conjugates by the multidrug resistance-associated protein J. Cancer Res, 1994,54:4833-4836.10游力，赵跃然，王欣，等

26、.白血病细胞耐药基因mdr1和多药耐药相关蛋白的表达水平的研究J.中国肿瘤临床，1998，25(6)：428-429.11Cole SPC, Bharhuai G, Gerlash.JH, et al. Overexpressionof a transporter gene in a multidrug resistant human lunger cancer cell line J. Science, 1992,258:1650-1654.12Scheffer GL,Wi jngaard PLJ, Flens MJ, et al. The drug resistance related p

27、rotein LRP is a major vault protein J. Nat Med, 1995,1:578-581.13Lzquierdo MA, Shoemaker RH,Flens MJ, et al. Overlapping phenotypes of multidrug resistance among panels human cancer cell lines J. Int J Cancer ,1996,65:230-234.14Jancgeln D, Piacentin M.DNA Topo and Topo J. Molecular Pharmacology, 199

28、1,40:495-497.15JiKara H, Omita Y. The effect of Topo in treatment of Hcc J. Am J Obset Gynecol, 1992,167(1):207-209.16Bosari S, Hirose T, Upregulation by Topo in human TlymphocytesJ.Hum Pathol, 1992,23(7):755-758.17周江，齐会春，徐元基，等.GST同功酶基因在乳腺癌中的扩增与基因表达J. 生物化学杂志，1995，11：551-552.18Tsurou T, Harumil L, Sh

29、igenu T, et al. Overcoming of vincrinstine in P338 leukemia in Vitro and Vivo through enhanded cycotoxicity of vincrinstine and vinblastine by verapamail J. Cancer Res, 1981,41(5):1967-1969.19Steward DJ,Evans WK. Non-chemotherapeutic agens that potentiate chemotherapy efficacy J. Cancer Treatment Reviews, 1998,16:1-10.20Yusa K, Tsuruo T. Reveral mechanisms of multidrug resis