铜胁迫对玉米幼苗生长

1、植物学通报2006, 23 (2: 129137Chinese Bulletin of Botany收稿日期 :2005-07-26;接受日期 :2005-12-20基金项目 :教育部科学技术研究重点项目 (103093*通讯作者Authorforcorrespondence. E-mail:zgshen.研究论文 .铜胁迫对玉米幼苗生长、叶绿素荧光参数和抗氧化酶活性的影响胡筑兵陈亚华王桂萍沈振国 *(南京农业大学生命科学学院南京210095摘要本文研究了铜 (Cu 胁迫下玉米 (Zeamays 幼苗生长、叶绿素含量、叶绿素荧光参数和抗氧化酶活性的变化。研究结果表明,520mol .L -1C

2、u 处理 10 天明显抑制玉米幼苗根系生长 , 并减少玉米幼苗的干物重 , 以及增加玉米幼苗地上部和根系含 Cu 量; 玉米幼苗吸收的 Cu 大部分积累在根系 , 在地上部分布较少。 Cu 处理还降低玉米叶片的叶绿素含量和 F v /F m 、ETR、q P 和 q y值。在 10 天的 Cu 处理期间 , 根系中 S O D 、P O D 、C A T 和 G R 活性呈现先上升后下降的趋势。而叶片中的 S O D、P O D、C A T 和 G R 活性在处理前期不受Cu 胁迫的显著影响 , 处理后期则因 Cu 胁迫而增强。实验表明抗氧化酶在抵御过量 Cu 引起的氧化胁迫中发挥了一定的作用

3、。关键词玉米 ,铜胁迫 ,叶绿素荧光 ,抗氧化酶Effects of Copper Stress on Growth, Chlorophyll FluorescenceParameters and Antioxidant Enzyme Activities ofZea mays SeedlingsZhubingHu,YahuaChen,GuipingWang,ZhenguoShen *(College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095AbstractG rowth,c hlorophyllc o

4、ntent,c hlorophyllf luorescencep arametersa nda ctivityo fa ntioxi-dantenzymesincornseedlingswereinvestigatedunderhydroponicssuppliedwith different concen-trationsof Cu.Rootgrowthofcornseedlingswassignificantlyinhibitedanddryweightwasde-creasedwith5-20m ol .L -1Cu.ChlorophyllcontentandF v /F m ,ETR

5、,q Pandq yinleaveswerealsosignificantlydecreasedunderexcessCu.TheCuconcentrations inshootsandrootsincreasedwith increasingCuconcentrationinthenutrientsolution.However,mostabsorbedCubycornseedling waslocatedinroots.At all levels of Cutreatment, the amount of Cuwassubstantiallyhigherinroots thaninshoo

6、ts. During the 10-day Cutreatment, theactivitiesofSOD,POD,CATandGRinitially increasedandthendecreased inroots.Butfortheleaves,short-termtreatmentwithexcessCuhadno significanteffectonthese enzymeactivities.Prolongedexposure for4daysresultedinincreased enzyme a ctivities.T hus,a ntioxidante nzymesh av

7、ef unctionst oa lleviatet het oxiceffectso fo xidative stresscausedbyexcessCu.KeywordsZeamays ,copperstress,chlorophyllfluorescence,antioxidantenzymes13023(2铜(Cu 是植物生长的必需微量元素 , 参与植物的光合作用等许多过程 , 在植物的正常生长发育过程中起着重要的作用 , 但植物组织中过量的 Cu 又会对植物产生毒害作用 (Marschner, 1995。过量的 Cu 能够降低植物叶片中叶绿素含量 , 破坏类囊体上的色素蛋白复合体的结构

8、,影响植物的原初光化学反应和PS的光合电子传输 (P?tsikk? et al., 1998; Mys liwa-Kurdziel and S trzatka, 2002; M ysliwa-Kurdziel et a l., 2002; P?tsikk? et al., 2002。Cu 是可变价金属离子 ,植物细胞中的 Cu 可以通过Haber-Weiss和 Fenton反应促使植物细胞累积羟自由基 (.O H 和过氧化氢 (H2O2(Polle and Schzendb el, 2003。累积的活性氧可以引发脂质和蛋白质的过氧化作用 , 从而严重干扰植物正常的生理代谢 (Maksymiec

9、, 1997; LombardiandSebastiani, 2005。活性氧产生后 ,植物体内清除系统会启动以减轻或消除活性氧累积对植物的伤害,主要有酶促系统和非酶促系统两类。前者主要包括超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD、过氧化氢酶 (catalase, CAT 、过氧化物酶(peroxidase,POD、抗坏血酸过氧化物酶 (ascorbate peroxidase,APX 和谷胱甘肽还原酶 (glutathionereductase, GR,后者主要指抗坏血酸 (ascorbicacid,AsA 、类胡萝卜素 (carote-noid, Car 以及一些含

10、巯基的低分子化合物等 (Mittler, 2002; Jiang and Zhang, 2002a。重金属胁迫下 , 抗氧化系统清除活性氧能力的高低直接与植物对重金属的耐性强弱有关(江行玉和赵可夫 ,2001。本文通过测定不同浓度 Cu 处理下玉米幼苗生长、叶绿素荧光参数和抗氧化酶活性等的变化 , 探讨过量铜对玉米 (Zea mays 幼苗生长和光合作用的影响以及抗氧化酶在植物抵御铜胁迫中的作用 , 以期为深入揭示植物耐 Cu 的机理提供一定的理论依据。1 材料与方法1.1实验材料与实验设计供试材料玉米 (Zea mays, 毒 10 分钟 , 用自来水冲洗干净品种为农大 108。种子经 ,

11、在 20下浸种 12 小时 ,10 在%NaClO 表面消25光照培养箱中催芽。挑选露白一致的玉米种子播于石英砂中,幼苗长出后,将其转移到Hoagland 营养液中 , 置于温室中培养 (温度 20 30, 湿度 30% 40 %, 光通量密度 60 80mol.m-2.s-1, 每 2 天更换 1 次营养液。待苗长至两叶一心后进行不同浓度 Cu 处理 , Cu 处理浓度设为 : 0.32、5、 10 和 20 mol.L-1, Cu 以 CuCl2.2H2O 的形式加入。 Cu 处理后的第 1、4 、7 和 10 天取样 , 测定 CAT 、POD、GR、S O D 和 A P X 活性以及

12、最大光化学效率 (F v/ F m、光化学猝灭系数 (qP、实际量子产额 (q y、电子传输速率 (ETR 的值。 Cu 处理后的第 10 天取样测定叶片叶绿素、叶片丙二醛 (M D A 含量、根系长度、根系 M D A 含量以及根系和地上部 Cu 含量和干物量。每个处理设 3 个重复。处理期间调节处理液 pH 为 5.5。1.2测定方法1.2.1 在丙酮 :乙醇 (V:叶绿素含量的测定V=1:1 溶液中24 小时,取 0.1g 叶片 ,用剪刀剪碎 ,浸泡浸泡液为待测液。测定方法参照张宪政 (1992 的方法。1.2.2MDA 含量测定MDA 含量参照赵世杰等 (1994 改进的方法进行测定。

13、1.2.3Cu 含量的测定烘干的植物样品用玛瑙研钵磨碎,用HNO3-HClO4(V:V=87:13 混合液消煮(Zhaoetal.,1994,之后用TAS-986 火焰原子吸收分光光度计(AAS测定Cu 含量。1.2.4叶绿素荧光参数的测定样品测定前,用湿纱布保湿,暗适应30 分钟。在室温下,用PAM210 叶绿素荧光仪(HeinzWalz,Germany程序 3 标准参数 (作用光通量密度600mol.m-2. s-1PAR 测定。 F v/F m、q y、q P和 ETR 的值由 DE-TACH 软件直接读出。1.2.5酶液提取、酶活性及蛋白质含量的测定取 0.5g 叶片 ,加入预冷的 3

14、.0mL50mmol.131 2006胡筑兵等 :铜胁迫对玉米幼苗生长、叶绿素荧光参数和抗氧化酶活性的影响L-1 磷酸缓冲液 (内含 1磨至匀浆 ,4冷冻离心 (10在提取液中加 1.0mmol.L-1mmol.L-1 乙二胺四乙酸和 1%聚丙烯吡咯烷酮研000g,30 分钟 ,上清液为酶提液。 APX 的提取需AsA 。 S O D、C A T 、A P X 和 G R 活性参照 J i a ng 和 Zhang(2002b的方法测定。 SOD 活性以抑制氮蓝四唑 (NBT 光氧化还原 50%的酶量为 1 个酶活性单位 (U,活性用 U.mg-1protein 表示。 CAT 活性用 ?A2

15、40tein.min-1 表示 ; APX 活性用 ?A290tein.min-1 表示 ; GR 活性用?A340tein.min-1 表示。不同波长下的吸光度变化用岛津UV-2450 分光光度计连续测定。 POD 活性参照 Hammerschmidt 等 (1982 的方法测定 , 用岛津 UV-2450 分光光度计连续测定 460 nm 处的吸光度 , POD 活性用 ?A460 tein.min-1 表示。蛋白质含量测定参照 Bradford(1976 的方法。1.3数据统计实验中数据均采用Excel 统计标准差 ;采用

16、SPSS11.5 软件根据最小显著差数法 (LSD 法进行差异显著性 (P0.05 分析。2 结果与分析2.1Cu 胁迫对植株生长、叶绿素含量、含C u 量和 MD A 含量的影响与对照 (0.32mol.L-1Cu 相比 ,520mol.L-1Cu 处理明显抑制玉米幼苗根系生长 ,减少玉米幼苗根系和地上部干物重(P0.05(表 1。Cu 处理也显著降低叶片叶绿素含量 (P 0.05,而 10和 20mol.L-1 Cu 处理显著增加玉米根系和叶片中的 MDA 含量 (P 0.05 (表 1。2.2Cu 胁迫对叶绿素荧光参数的影响图 1 显示了不同浓度Cu 处理下的玉米幼苗叶片F v/F m、

17、 ETR、q P 和q y 的变化趋势。与对照相比,520mol.L-1Cu 处理4 天显著降低玉米幼苗叶片的F v/F m、 E T R、q P 和 q y 值。 Cu 处理浓度越高 ,F v/F m、ETR 、q P 和 q y 值的下降程度越大。而520mol.L-1Cu 处理 1 天则对叶片中的 F v/F m、 ETR、qP 和q y 值没有显著影响。2.3Cu 胁迫对根系抗氧化酶活性的影响不同浓度 Cu 处理下 , 玉米幼苗根系中 C A T 、P O D 和 S O D 活性的变化趋势见图 2。随着 Cu 处理时间的延长 , CAT 、POD 和 SOD表 1Cu 处理 10 天

18、对玉米幼苗根系长度、干物重、含Cu 量、叶绿素含量和 MDA 含量的影响 Table1Rootlength,dryweight,Cucontent,chlorophyllcontentandMDAcontentofseedlingsofZeamaysgrownu nder excess Cu supply for 10 daysCu concentrations ( mol.L-10.3251020 Root Length (cm.plant-116.4 0.3a14.7 0.1b13.5 0.3c11.1 0.1d Root dry weight (mg.plant-124.8 0.4a21

19、.3 1.2b21.0 1.1b20.5 0.9b Shoot dry weight (mg.plant-195.2 2.4a75.0 12.5b71.5 4.8b80.0 2.6b Root Cu content ( g.g-1DW96.95.2d591.4 49.3c715.9 78.1b1012.3 24.4a Shoot Cu content ( g.g-1DW16.20.3b21.9 2.0a20.5 1.6a24.2 2.8a Chlorophyll content (mg.g-1 FW 3.16 0.30a2.69 0.04b 2.250.22c 2.15 0.08c Root

20、MDA content (nmol.g-1 FW 1.37 0.19b 1.51 0.18b 1.940.40a 1.930.29a Leave MDA content (nmol.g-1 FW 3.15 0.21b 3.36 0.15b 3.750.15a 3.770.26a 注: 表中数值为 : 平均值 标准误差 ,不同字母表示差异显著 (P 0.05, LSD test.Notes:DataDifferentlettersLSDtest.aremeanpresentedsignificantintheformatdifferenceat Pofmean 0.05s tandard err

21、or; according to13223(2活性的变化趋势基本相同。在Cu 处理的前 4 天,520mol.L-1Cu 处理植株的根系 CAT 、POD 和 SOD 活性均高于对照 ,这 3 种酶活性均有随着Cu 处理浓度的增加而升高的趋势。但过量Cu处理延长到 7 天,根系 CAT 活性明显降低并低于对照 ,而 SOD 活性降低到对照植株的水平。过量Cu 处理植株根系 POD活性则在处理的第10 天降低到对照水平以下。短时间的过量 Cu 处理 (1 和 4 天 ,有提高玉米幼苗根系中GR 活性的趋势 ,但延长 Cu 处理时间则降低GR 活性 (图 2。如 20mol.L-1Cu 处理 10

22、 天 ,GR 活性比对照减少了28%。与对照相比 ,5 和 10mol.L-1Cu 处理对玉米幼苗根系 APX 活性没有显著影响 ,但 20mol.L-1Cu 处理显著提高根系中APX 活性(图 2。2.4Cu 胁迫对叶片抗氧化酶活性的影响与对照相比,520mol.L-1Cu 处理1 天对玉米幼苗叶片中CAT、POD、S O D和GR 活性没有显著影响(图3。Cu 处理时间延长至4 天,叶片POD 和SOD 活性提高并显著高于对照,而 CAT 活性则在处理的第7 天才显著提高 (图 3。GR 活性从 Cu 处理时间的第 4 天开始 , 随 Cu 处理时间的延长而逐渐提高 , 并显著高于对照 (

23、图 3。而叶片中 APX 活性变化与其他酶具有一定差异 , 在 Cu 处理的第 1 天 , APX 活性明显低于对照 , 但随着 Cu 处理时间的延长 , APX 活性逐渐上升 ,并显著高于对照 (图 3。133 2006胡筑兵等 :铜胁迫对玉米幼苗生长、叶绿素荧光参数和抗氧化酶活性的影响3 讨论本实验结果显示 5 mol.L-1 Cu 即对玉米幼苗产生毒害作用。与对照相比 , Cu 胁迫下的玉米幼苗根系和地上部生长受到明显抑制 , 并且随着营养液中 Cu 浓度的增加 , 生长的受抑制程度也越明显 (表 1。植物对重金属的耐性可以分为排斥机制和耐性机制 , 在排斥机制中 ,植物 （） 通过减少

24、根系吸收和向地上部运输来降低重金属含量（，）；而在耐性机制中，物通过 植 合成蛋白质、多肽、氨基酸和有机酸等化合物来螯合细胞内的游离金属离子（，； ，；，； ，）。 本实验结果显示玉米幼苗吸 收的 以上累积在根系，随着营养液中 浓度的增加（），叶片含量的 胡筑兵等： 铜胁迫对玉米幼苗生长、叶绿素荧光参数和抗氧化酶活性的影响 上升并不明显（表），显示玉米幼苗对过量铜的 耐性机理主要是排斥机制，这与其他植物的耐 机制相一致（，； ， ；，；， ）。 同时，本实验结果表明 ； ，）。 在诱导 活性氧产生方面，可以直接接受中电子形成，将氧化成， 然后通过反应生成 .O和（ zendb， ）。 活性氧能

25、够攻击质膜和细胞器膜中的不饱和脂肪酸，引起膜脂过氧化，膜透性增大 （，）。 本实验结果也显示过量 处理下含量明显上升（表）。 因此，膜 脂过氧化可能是 毒害植物的重要途径之一。目前有许多研究结果表明 对抗氧化酶 （，和等）活性的影响可能同时表现为促进和抑制两个方面。一方面， 过量明显提高抗氧化酶在转录水平的表达，诱导同工酶的表达，及对酶蛋白结构进行加工 以 与修饰，提高酶的总活性（， ；，）。 另一方 面， 胁迫下产生的活性氧可以破坏 、 和蛋白质的结构，因而破坏抗氧化酶的表 达系统和结构，降低酶的活性（ ，； ，； ，； ，）。 在处理初 期（天），一些抗氧化酶活性的升高可能与植物适应诱导活

26、性氧增加有关，而延长处 理时间降低一些抗氧化酶活性则可能是细胞中过量可能直接作用于酶蛋白或影响基因表达的结果。至于玉米幼苗叶片在 处理初期 （天），因运输到地上部的较少而对抗氧化酶活性没有产生显著影响。但随 处理的延 长和地上部积累量的增加，也一定程度上诱 导增加抗氧化酶的活性（图）。 结果表明抗氧 化酶的增强可能是玉米幼苗对胁迫的早期响应之一，根系抗氧化酶对过量的响应明显早于叶片抗氧化酶的响应。此外，我们的研究 结果显示在过量的胁迫下叶片中抗氧化酶活性与叶绿素荧光参数的变化趋势相一致（图 和图），表明抗氧化酶在抵御过量引起的氧 化胁迫中发挥了一定的作用。处理后，叶片中含量上升均不明显，但叶

27、片中光合作用的指标和抗氧化酶活性变化显著（表， 图和图），我们推测处理后根系中高含量可能作为一种信号分子，激活叶片中 的活性氧清除系统（，）。 同时，过 量能明显引起根系累积， 是一个重 要的信号分子，也是一种主要的活性氧（，）。根系中过量的 可能被转移到叶片 中，引起叶片中的氧化胁迫，脂质过氧化程度增 加，光合作用能力下降（，）。 过量能明显降低植株叶片色素含量，破 坏内囊体膜结构，饰加工色素分子和降低色素修 合成酶的活性等，从而降低植物光合作用效率（P?tsikk? et al., 1998; ysliwa-Kurdziel and Strzatka, 2002; Mysliwa-Kurd

28、ziel et al., 2002; P?tsikk? et al., 200）。 叶绿素荧光技术被认为是快速检测植物光合机构无损伤的最灵敏的探针。 用于度量 原初光能转换效率， 则表示通过 的电子传输速率。是 天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的份额，较低的 反映中开放的反应中心比例和参与 固定的电子减少。是 的实际光化学效率， 反映吸收的光子供给 反应中心的效率（焦德茂， ）。 我们的实验结 果显示， 过量 明显降低 、 、 和 值（表和图）， 表明玉米幼苗利用光能的 效率明显下降，的电子传递严重受阻， 这必 然导致光合作用效率的降低。过量 降低叶 片的光合作用效率可能是抑制植物生长的

29、原因之一。 氧化胁迫是毒害的一种重要机制（ ， ； ， ； ch zendbel， S 1015. （） 参考文献 江 行 玉 ， 赵 可 夫 （）植物重金属伤害及其抗性机 理应用与环境生物学报， 焦 德 茂 （）运用光合机理揭示生理育种途径（北京：中国农业出版社）， 张 宪 政 （）作物生理研究法（北京：农业出版社）， 赵世杰， 许长成，邹 琦 ，孟 庆 伟 （）植物组织中丙 二醛测定方法的改进植物生理学通讯 ， Baker, A.J.M. (1981. Accumulatiors and excluders. Strategies in the response of plants to

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