RT-PCR实验步骤

1、/*RT-PCR实验有三步：抽提 RNA , RT, PCR。要求:1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，贝肉前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1） RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须在RT时，引物设计有3 种方法即 a： Random 9mers ; b : OligodT-Adaptor Primer ;和c：特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用

2、此产物做PCR的模板继续扩增。如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？htt P： /www. ncbi. nl m. 问题: 在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因, 结果从一种组织中可以扩出我的目的基因， 条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带， 尝试其他条件同样无 法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织 中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来） 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异 还很大，会不会和这有关呢？ 请咼手指教!解答:1.RT-PCR有两种做法:条件具备的话可用kit

3、进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步 进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。（Promega ）。2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA （保留后可做5 ，3' RACE）;引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑 RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。3. RACE我做过 RACE（ 3' RACE 是宝生物的 Kit ； 5 RACE 是 Gi

4、bico），但现在再进行另一个同源基因的 3 RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3' UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3 UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b actin和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。有关内参:RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因 和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。问：我曾经作过同一管的 PCR，内有act in和目的基因引

5、物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度?答: it should determ ined the amount of RNA. but it not for the qua ntitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer forpublicationand editor if he don not know the preoc

6、edure much. but the amoun t just using "accurate pip tte" is wron g. itshoud be remembered to do the innercon trolof housekee ping gene everytime.在同一管中做RT,其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶 本来就是过量的八-八，（平时做Pcr的时候，完全可以再省一些taq 酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕

7、，开个玩笑）虽然用不着，但是 摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的 好了，还要考虑比较的不同的模板中的量， 所以我们不建议再同一管 中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。有关内参的建议:定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的 电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几 封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做 的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多 少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量 RT- PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的,

8、3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省 PCR管和 taq。关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不 对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的 文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的， 酶一直是过量，再加酶也没 用，引物ntp都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所

9、以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在*帖过。关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内 含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用 于基因组PCR）、长度小于500bp 600bp等等。引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的, 要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这 样任何几个都可以拿来披，也不用查。我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因 在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了, 怎么考虑内含子的问题呢?18s的引物也和著名的P a

10、ct in 样是设计的，只要拿到序列就可以了, 但是限制是只能用总RNA为模板，但是比act in和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。18s除了在细胞中更相同（量） 外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想, 不知对不对，请几位主任和 eeflyi ng指教。我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看 家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其

11、序列和genbank号。正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的act in的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？ 原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的 盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是 了。正义反义也容易理清。我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条，许多 专业书都有详细的描述，但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得 不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同 等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性，我的以下经历说明

12、: 做实验时各人的情况不同，做不出时还是要好好动一下脑子。记得我开始我的RT PCR时，按常规方法，提取总RNA后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录， 不断改变反应条件，进行了N 次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的 PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片 断（尽管她用这些RT PCR产物做模版再进行PCR时也没办法 重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断, 然后用她的RT-PCR产物作模板 （有点改进，逆转录反应换用了 9 mers随机引物），用我的引进物进行一般 PCR,终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个

13、经历别人很人遇到，但足可以 说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要， 但有 时也不定要受到书本框框和别人经验的限制请问:1引物的特异退火温度怎样设定？可以根据 gc和at含量算出吗?可以用引物报告单上的Tm值吗?2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？ MgCI2应加多少？各个成分的量有无确定标准?3 PCR结果跑电泳，act in有，但跑不出目的条带，有几种原因？与 cDNA的量少有关吗？ Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性?般来说引物报告单伤得是对的，也可以自己算，实际上重要的各条引 物一致，剩下的可以摸的.20中是指体积还是量？只要不明显改变体系的离子强

14、度，加1,2ul都可以的.mg要调的，但我总觉得没有书里讲的那么玄乎，我都是常年不变如果内参照有，目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸原因书里应该都 说了.在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的 RNA o而实验 失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛 存在而稳疋，一般反应不需要辅助因子。因而 RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制 备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA 的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性 RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内

15、源性的RNA酶oRNA酶可耐受多种处理而不被灭活, 如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘 中。在其它分子生物学实验中使用的 RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180 C的高温下干烤6hr或更长 时间。2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H

16、2O2室温10min ,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC,在37 C处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22阿 滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从 而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑

17、制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中 解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin ):从大鼠肝或人胎盘中提取得来 的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和 多种RNA酶结合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。mRNA的分离与纯化真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有 5 '端帽子结构(m7G)和3'端的Poly(A)

18、尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞 mRNA的3 '端存在20-30个腺苷酸组成的Poly( A)尾，通常用Poly (A+)表示。这种结构为真核 mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化 mRNA的理论基础就在于此。mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用 mRNA 3 '末端含有Poly（ A+ ）的 特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（d

19、T）纤维柱后, 即可得到较高纯度的mRNA。寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA、试剂准备1 . 3M 醋酸钠(pH 5.2 )2. 0.1M NaOH3. 1 X 上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6); 0.5M NaCl ; 1M EDTA（pH 8.0 ）;0.1%SLS（十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCI（pH7.6）、NaCl、EDTA （pH 8.0 ）的母液，经高压消毒后按各成分确切 含量，经混合后再高压消毒，冷却至65 C时，加入经65 C温育（30min ） 的10%SLS至终浓度为0.1%。4 .洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl( pH 7.

20、6); 1mM EDTA (pH 8.0) 0.05% SDS 5 .无水乙醇、70%乙醇6. DEPC二、操作步骤1.将0.5-1.0g寡聚(dT)-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。2 .用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚(dT)-纤维 素装柱0.5-1mI ,用3倍柱床体积的DEPC H20洗柱。3 .使用1 X上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4 .将RNA溶解于DEPC H2O中，在65 C中温育10min左右，冷 却至室温后加入等体2X上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用 1 X上样缓冲液洗柱，继续收 集流出液。5 .

21、将所有流出液于65 C加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集 流出液。6 .用5-10倍柱床体积的1 X上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集,OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的 OD260值很高,其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的 OD260值很低或无吸收。7 .用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱 Poly(A+)RNA，分部收集,每部分为1/3-1/2柱体积。8. OD260测定Poly(A+)RNA 分布，合并含Poly(A+)RNA 的收集 管，加入1/10体积3M NaAc (pH5.2 )、2.5倍体积的预冷无水乙 醇，混匀，-20 C放置30m

22、in。9. 4 C离心，10000g X15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉 淀。注意：此时Poly(A+)RNA 的沉淀往往看不到。4 C离心，10000gX5min，弃上清，室温晾干。10.用适量的DEPC H2O 溶解RNA。三、注意事项1 .整个实验过程必须防止Rnase的污染。2 .步骤(4)中将RNA溶液置65 C中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是 mRNAPoly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA 的回收率；另一个目的是能解离 mRNA 与rRNA 的 结合，否则会导致rRNA的污染

23、。所以此步骤不能省略。3.十二烷基肌氨酸钠盐在18 C以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流 动，若室温低于18 C最好用LiCl替代NaCI。4 .寡聚(dT)-纤维素柱可在4 C贮存，反复使用。每次使用前应该 依次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。5 .一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5Poly(A+)RNA , 约相当于上柱总 RNA量的1%-2% 。RNA 酶保护试验(RNase ProtectionAssay,RPA)是通过液相杂交的方式，用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点: 1.检测灵敏度

24、比Northern杂交高。由于Northern 杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2 .由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程,因此，分析的数据真实性较高。3.由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。4. 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，

25、无竞争性问题。检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。、试剂准备1 . GACU POOL :取 lOOmM ATP、CTP、GTP 各 2.78 gl、lOOmMUTP 0.06 讪，力口 DEPC H2O 至 100 讪。2. 杂交缓冲液 IPES 0.134g、0.5M EDTA (pH8.0 ) 20 小 5M NaCl 0.8ml、甲酰胺 8ml，力口 DEPC H2O 至 10ml。3. RNase 消化液：5M NaCl 120 讪、1M Tris-HCl(pH7.4) 20小 0.5MEDTA (pH8.0 ) 20 讪、RNase A(10mg/

26、ml) 8 讪、RNase T1(250U/讪)1 M，加 DEPC H2O 至 2ml二、操作步骤1 .反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也 可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。(1)设计含T7启动子的PCR引物由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游 引物5'-端要含T7启动子序列：T7 启动子序列为：5 ' -TAATACGACTCACTATAGGG引物设计的其他要求与一般 PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑 100-400bp 长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一

27、较长的片段，再以该片段为模板 扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示:上游引物下游引物n T7启动子序列下游引物I(2) PCR先用上游引物和下游引物I进行 PCR,再以PCR产物为模板，用上游引物和下游引物n -T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。(3)探针合成标记与纯化在0.5ml离心管中加入下列试剂:RNasin （40U/ 讪）0.5 讪GACU POOL GAC（含 GTP、CTP、ATP 各 2.75 mM,UTP 61 讪/1） 2 讪a-32PUTP（10 aCi/ 讪）2.5 山DTT （二硫苏糖醇，0.1M） 1讪5 X转录buffer 2讪模板（50n

28、g/讪）1讪T7 RNA聚合酶（15U） 1讪混合后，短暂离心，37OC保温1hr。加入 DNase I （10U/ 讪）1 讪，37OC 15min, 然后 75 OC 10min 以 灭活DNAse I和T7 RNA 聚合酶。加入：饱和酚50讪氯仿50讪酵母tRNA （2呃/讪）4讪DEPC H20 100 讪室温下充分混匀，离心lOOOOg X2min。取上层液置另一 0.5 ml离心管中，加入100 M氯仿，混匀，离心lOOOOg X2min。将上层液转 移至另一 0.5ml离心管中，再加入3M NaAc 10小预冷无水乙醇 250 山混匀后，-20OC 静置 30min。4OC 离心

29、 13500g X10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100讪洗涤，4OC离心13500g X2min.弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入 50 M杂交缓冲液溶解沉淀,4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。2 .杂交（1）RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为 1刚讪。(2)取8讪RNA加入1-3讪探针(根据探针检测结果调整)于0.5ml离心管中。(2) 80OC 保温 2min，然后 40-45OC 下杂交 12-18hr 。3.消化(1)杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温 30min。 加入10%SDS 10

30、讪、10呃/讪蛋白酶K 20讪，混匀，37 OC保温 10min。 加入65讪饱和酚和65讪氯仿，混匀，室温离心，10000g X2min。转移上层液到另一 0.5离心管中，加入10讪酵母tRNA和3MNaAc 15讪,再加入200讪异丙醇，混匀后，置-20OC 30min , 4 OC离心,135000g X10min。(5)弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8讪上样缓冲液溶解沉淀。4、电泳与放射自显影(1)配制凝胶：(50ml)40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19 : 1)6.25ml5XTBE 10ml尿素24g加 H2O 至 50ml溶解后加入25%过硫酸胺50讪,TEMED 50山，

31、混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。(2)预电泳以1 XTBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测 序电泳装置，电压应达 2000v以上，功率设定为100w，温度设为 50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。(3)加样将已溶解在加样缓冲液中的样品 80 0C加热2min ,立即加样到胶孔 中，电泳1-2hr。(电泳条件同预电泳)。(3) 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张 X片，盖上暗盒，-70OC曝光 1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。三、注意事项1 .本实验大部分为RNA操作，注意RN

32、A酶的污染。2. RNase消化液消化未杂交的单链 RNA和探针RNA ,当探针与样 品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的 杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此,标记时间不宜过长。RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞 说的是套式PCR,可以在你的第一次 PCR两个引物内，再设计一对引物进行第二次PCR就行了 如果你的第一次PCR刚好包括目的片段，那只好设计个更长的了 第二次的引物设计要求可以

33、低一点 以50讪体系为例第一次PCR产物5讪二次PCR和巢式PCR,即设计两对引物进行扩增，不是一个概念, 它是拿第一次的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物, 从新进行扩增反应，以期增加产物的量我做RT-PCR时，提总RNA时，都是用灭菌DEPC水，按1:100稀释后 测OD260 和OD280,后根据公式:RNA 浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用1mg total RNA 分离mRNA.做逆转录及PCR,效果 很好.luoyu10 wrote:各位大哥: 我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm 的比 值最低为多少，如果太低是不是

34、会影响结果?最低到1.8，最好2.0，我感觉稍微低一点影响不算太大。问：我是RT PCR的新手，想请教引物如何设计?好的引物所具有的令人满意的特点:*典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对 序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。*选择GC含量为40 %到60 %或GC含量反映模板GC含量的引物。*设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。*避免引物对3'末端存在互补序列，这会形

35、成引物二聚体，抑制扩增。*避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。*避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。*避免存在可能会产生内部二级结构的序列， 这会破坏引物退火稳定 性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序 列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道 氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸 所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。

36、为了增加特异性，可以参 考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄 嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1沏 到3训），因为许多简并混合 物中的引物不是特异性针对目的模板。【经验】如何确认RNA的质量 各位都知道，提取到质量良好的 RNA （包括总RNA和mRNA，以 下同）是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢?或许各位非常关心呢，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家 的说明书，各位也同样可以看到的，内容当然都是一样的了，所以实 验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望大家自己多多 思考啊