基因工程的基本操作程序2016512

1、非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 ：能编码蛋白质：能编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区：由编码区上游和编码区下游的：由编码区上游和编码区下游的DNADNA序序列组成，不能编码蛋白质。列组成，不能编码蛋白质。 有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游该序列中，最重要的是位于编码区上游的的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子：能编码蛋白质：能编码蛋白质 编码区

2、编码区非编码区非编码区：由编码区上游和编码区下游的：由编码区上游和编码区下游的DNADNA序序列组成，不能编码蛋白质。列组成，不能编码蛋白质。 有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游该序列中，最重要的是位于编码区上游的的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：是一段有特殊结构的是一段有特殊结构的DNADNA片段，位于基因片段，位于基因的首端，它是的首端，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，有了聚合

3、酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出它才能驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得所需要的蛋，最终获得所需要的蛋白质。白质。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA短片短片段，它能阻碍段，它能阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模模板链上脱离下来，使转录终止。板链上脱离下来，使转录终止。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子RN

4、ARNA聚合酶聚合酶: :由多个肽链构成的蛋白质。能够识由多个肽链构成的蛋白质。能够识别调控序列中的结合位点并与其结合，催化别调控序列中的结合位点并与其结合，催化DNADNA转录为转录为RNARNA。编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编

5、码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基

6、因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取 什么是目的基因？什么是目的基因？主要是编码蛋白质的基因；主要是编码蛋白质的基因；也可以是一些具有调控作用的因子。也可以是一些具有调控作用的因子。 获取目的基因的常用方法有哪些获取目的基因的常用方法有哪些? ? 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 用化学方法人工合成目的基因用化学方法人工合成目的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因（一）从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？什么是基因文库？ 2.基因文库的分类基因文库的分类:只包含了一种生

7、物的只包含了一种生物的部分部分基基因，如：因，如：cDNAcDNA文库。文库。含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因基因组文库：基因组文库：部分基因文库：部分基因文库：一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因（一）从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？什么是基因文库？ 2.基因文库的分类基因文库的分类:3.怎样从基因文库中得到我们所需要的基因呢？怎样从基因文库中得到我们所需要的基因呢？据目的基因的有关信息，获取目的基因。据目的基因的有关信息，获取目的基因。一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因（一）从基因文库中获取目的基因1.什

8、么是基因文库？什么是基因文库？ 2.基因文库的分类基因文库的分类:3.怎样从基因文库中得到我们所需要的基因呢？怎样从基因文库中得到我们所需要的基因呢？4.怎样构建基因文库？怎样构建基因文库？求求异异思思维维 你能推测出由你能推测出由mRNAmRNA反转录形成反转录形成cDNAcDNA的过程大的过程大致分为哪些步骤吗？致分为哪些步骤吗？寻寻根根问问底底1.1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？的生物体内提取不行吗？ 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一

9、种生物体内只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。文库。 构建基因文库是获取目的基因的方法之一，构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过已知

10、，就可以通过PCRPCR方式从含有该基因的生物方式从含有该基因的生物的的DNADNA中，直接获得，也可以通过反转录，用中，直接获得，也可以通过反转录，用PCRPCR方式从方式从mRNAmRNA中获得，不一定要构建基因文库。中获得，不一定要构建基因文库。一、目的基因的获取一、目的基因的获取（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR： （1 1）概念）概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段 （2 2）PCRPCR技术是由技术是由_等人于等人于

11、_年发明的，年发明的， 为此为此19931993年获得年获得_奖奖 穆里斯穆里斯19881988诺贝尔化学诺贝尔化学（3 3）原理：）原理：DNADNA双链复制双链复制PCRPCR的原理的原理（DNADNA体内复制相关知识）体内复制相关知识）项目项目相关内容与作用相关内容与作用时间时间有丝分裂、减数分裂间期有丝分裂、减数分裂间期场所场所细胞核细胞核 线粒体线粒体 叶绿体叶绿体酶酶DNA解旋酶解旋酶使氢键断裂，打开使氢键断裂，打开DNADNA双链双链DNA聚合酶聚合酶催化合成催化合成DNA子链子链模板模板DNA母链母链提供复制模板提供复制模板原料原料脱氧核苷酸脱氧核苷酸合成子链的原料合成子链的原

12、料引物引物使使DNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3/端开端开始连接脱氧核苷酸始连接脱氧核苷酸条件：条件：引物：引物：DNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，而只，而只能从引物的能从引物的3端延伸端延伸DNA链。因此复制需链。因此复制需引物引物一、目的基因的获取一、目的基因的获取（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR： （1 1）概念）概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段 （2 2）PCRPCR技术是由技术是

13、由_等人于等人于_年发明的，年发明的， 为此为此19931993年获得年获得_奖奖 穆里斯穆里斯19881988诺贝尔化学诺贝尔化学（3 3）原理：）原理：DNADNA复制复制一段已知目的基因的核苷酸序列，以一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。便根据这一序列合成引物。条件：条件：引物：引物：DNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，只能，只能将单个核苷酸连接到已有的将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上片段上(从从3端延伸端延伸DNA链链)。因此复制需引物。因此复制需引物模板模板DNA： dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTP热稳定热稳定DNA聚合酶（聚

14、合酶（Taq酶）酶） 变性变性复性复性延伸延伸条件条件PCR技术扩增过程：技术扩增过程：当温度上升到：当温度上升到9095以上时，双链以上时，双链DNA解聚为单链解聚为单链每个循环包括：每个循环包括：温度下降到：温度下降到5560 左右，两种引物通左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链过碱基互补配对与两条单链DNA结合。结合。：温度上升到：温度上升到7075 左右，溶液中的四左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下，根据碱基酶的作用下，根据碱基互补配对原则从引物起进行互补链的合成。互补配对原则从引物起进行互补链的合成。变性变性复性复性延伸延伸5 5 3 3 G GG GT

15、 TC C3 3 5 5 A AG GC CC C5 5 3 3 A AG G引物引物5 5 3 3 G GG G引物引物变性变性90959095o oC C复性复性55605560o oC C延伸延伸70757075o oC CPCR技术扩增过程：技术扩增过程：5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸高温变性低温复性重复13步30轮PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原则原

16、则条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子一、目的基因的获取一、目的基因的获取（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（一）从基因文库中获取目的基因（一）从基因文库中获取目的基因（三）化学方法直接人工合成目的基因（三）化学方法直接人工合成目的基因（基因比较小（基因比较小, ,核酸序列已知核酸序列已知) )1 1、目的：、目的： 使目的基

17、因在受体细胞中稳定存在，并使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。表达和发挥作用。它们各自的作用是什么它们各自的作用是什么? ?复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因1.1.转化：转化： 3.3.转化转化方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法2.2.受体细胞受体细胞

18、 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力子叶植物没有感染能力 植物体受损伤处细胞会分泌酚类化合物吸引植物体受损伤处细胞会分泌酚类化合物吸引农杆菌，农杆菌农杆菌，农杆菌TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。原理：原理：过程：过程：优点：优点：经济和有效经济和有效（2 2）基因枪法）基因枪法（3 3）花粉管通道法）花粉管通道法常用于单子叶植物，成本较高常用于单子叶植物，成本较高简便经济简便经济2 2、将目的基因导入、将目的基因导

19、入动物细胞动物细胞显微注射法显微注射法方法：方法：受体细胞：受体细胞：程序：程序：3 3、将目的基因导入、将目的基因导入微生物细胞微生物细胞原核生物特点：原核生物特点：大肠杆菌细胞最常用的转化方法：大肠杆菌细胞最常用的转化方法：检查是否成功检查是否成功（1 1）方法）方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2 2）过程）过程: :（一）、检测（一）、检测提取出转基因生物基因组提取出转基因生物基因组DNADNA用放射性同位素用放射性同位素等标记含目的基因等标记含目的基因的的DNADNA片段作为探针片段作为探针探针和转基因生物的基因组探针和转基因生物的基因组DNADNA杂交杂交若显示出杂交带若显示

20、出杂交带, ,表明目的基因已插入染色体表明目的基因已插入染色体DNADNA中中检查是否成功检查是否成功方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交方法方法: :分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法: : 抗原抗原抗体杂交抗体杂交（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）（一）、检测（一）、检测抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等归纳步骤抗虫棉的接种实验抗虫棉的接种实验基因工程操作流程图基因工程操作流程图小小 结：结：寻根问底寻根问底 将目的基因直接导入受体细胞不

21、是更简便吗？将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？如果这么做，结果会怎样？ 有人采用总有人采用总DNADNA注射法进行遗传转化，即将一注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总个生物中的总DNADNA提取出来，通过注射或花粉管通提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物，此法目前争议颇法确定什么基因导入了受体植物，此法目前争议颇多，严格讲不算基因工程。多，严格讲不算基因工程。思考与探究思考与探究1.1.作为基

22、因工程表达载体，只需含有目的基因就可以作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。终止子和标记基因等。2.2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论若想将一个抗病基

23、因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？上说，你应该如何做？ 原因：主要酚类诱导物，这些物质主要在双子叶植物原因：主要酚类诱导物，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这是单子叶细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。 如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱有的农杆菌菌株都可以侵染单子

24、叶植物；要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的（趋化性）和激活农杆菌的VirVir区（诱导性）的基因，使区（诱导性）的基因，使T-T-DNADNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNADNA上。上。3 3、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？ 有些

25、蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。蛋白是不可能的。4 4、-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程

26、的方法，使大肠杆菌生产出鼠的让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？想一想，应如何进行设计？（1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。）。（2）将）将cDNA前序列接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加前序列接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌。如果表达载体未进入大肠素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取从中提取-珠蛋白。珠蛋白。练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷