霉菌试验工作流程修订原件2霉菌试验技术手册

1、霉菌试验工作流程二零零零年四月二十五日二零零二年十一月 待修改目 录一、试验前的准备1、 灭菌方法（附录A）2、 选择菌种3、 制备培养基4、 倒平板5、 菌种的移植、培养及保藏6、 无机盐溶液、浸渍（营养）液的制备方法7、 试验设备准备8、 试验场所及用具的灭菌9、 试验所需用具10、 对照样品的准备11、 试验样品的准备12、 安装试验样品及对照样品13、 预处理二、制备混合孢子悬浮液三、试验四、样品出箱及最终检测五、出具试验报告及资料归档六、附录A灭菌方法（包含整个霉菌试验过程中的灭菌方法）一、 试验准备1、 选择菌种1.1 菌种来源 菌种来源必须是经国家认可的菌种保藏和研究机构提供的纯

2、正菌种。1.2 试验菌种按照试验标准有关条款规定的菌种名称和菌号准备菌种（各行业标准要求试验菌种名称和菌号见表1、各种菌种受影响的材料见表2）。1.3 菌种检查 在菌种移植前，对试验用菌种进行纯度检查，如有不纯或变异的菌种应及时更换。菌种留试验备用及菌种贮存。2、 制备培养基 霉菌试验中常用的培养基有：查氏培养基（Ca）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。菌种保存时查氏培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）应交替使用,防止菌种退化。2.1 查氏培养基2.1.1 主要成份硝酸钠（NANO3） 3.0g磷酸氢二钾（K2HPO4） 1.0g氯化钾（KCL） 0.5g硫酸镁（MgSO47H2O） 0

3、.5g硫酸亚铁（FeSO47H2O） 0.01g蔗糖 30g琼脂 （1520）g蒸馏水 1000mlPH 6.8表1 各行业标准要求试验菌种名称和菌号标准代号菌种名称菌种编号备注GJB150.10-86HB5830.13-86黑曲霉 Aspergillus niger3.3928 黄曲霉 Aspergillus flavus3.3950 杂色曲霉 Asprygillus versicolor3.3885绳状青 Penicillum funiculosum3.3875,3.3872 球毛壳霉 Chaetomium globosum3.4254 GJB.150.10A-200X(未实施)黑曲霉 A

4、spergillus nigerAS 3.3928 两组选择一组，或根据需要附加菌种。土曲霉 Aspergillus terreusAS 3.3935 宛氏拟青霉 Paecilomyces variotiAS 3.4253 绳状青霉 Penicillum funiculosumAS3.3875AS3.3872 赭绿青霉 PenicillumochrochloronAS3.4302 短柄帚霉 Scopulariopsis brevicaulisAS 3.3985 绿色木霉 Trichoderma virideAS 3.3942 黄曲霉 Aspergillus flavus3.3950杂色曲霉 A

5、sprygillus versicolor3.3885绳状青霉 Penicillum funiculosum3.3875,3.3872 球毛壳霉 Chaetomium globosum3.4254 黑曲霉 Aspergillus nigerAS 3.3928 GB/T2423.16-99黑曲霉 Aspergillus nigerAS 3.3928 土曲霉 Aspergillus terreusAS 3.3935 出芽短梗霉 Aureobasidium pullulansAS 3.3984 宛氏拟青霉 Paecilomyces variotiAS 3.4253 绳状青霉 Penicillum f

6、uniculosumAS3.3875AS3.3872赭色青霉 Penicillium ochrochloronAS 3.4302光孢短柄帚霉 Scopulariopsis brevicaulisAS3.3985 绿色木霉 Trichoderma virideAS 3.3942 GJB4.10-83黑曲霉 Aspergillus niger3.3928 萨氏曲霉 Asperaillus sydowi3.3943宛氏拟青霉 Paecilomyces varioti3.4253 球毛壳霉 Chaetomium globosum3.4254 腊叶芽枝霉 Cladosporium herbarum3.3

7、897康宁木霉 Trichoderma koningii3.4004 产黄青霉 Penicillium chrysogenum3.3890 土曲霉 Aspergillus terreus3.3935 顶青霉 Penicillium chrylophilum3.3889 注：菌种编号为中国科学院北京微生物研究所保藏的菌种编号表2 各菌种受影响的材料序号菌种名称、编号及受影响的材料1黑曲霉 Aspergillus niger 3.3928 在许多材料上广泛生长，对铜盐有抵抗性2黄曲霉 Aspergillus flavus 3.3950 皮革 3杂色曲霉 Asprygillus versicolor

8、 3.3885 皮革 4绳状青霉 Penicillum funiculosum3.3875,3.3872 织物、塑料、棉织品 5球毛壳霉 Chaetomium globosum 3.4254 纤维素 6土曲霉 Aspergillus terreus AS 3.3935 帆布、纸板、纸 7宛氏拟青霉 Paecilomyces varioti AS 3.4253 塑料、皮革 8绳状青霉 Penicillum funiculosum AS 3.3875,3.3872 织物、塑料、棉织品 9绿色木霉 Trichoderma viride AS 3.3942 塑料、织物 10出芽短梗霉 Aureobas

9、idium pullulans AS 3.3984 侵蚀涂料与皮革 11赭色青霉 Penicillium ochrochloron AS 3.4302 对铜盐有抵抗性，侵蚀塑料与纺织品 12光孢短柄帚霉 Scopulariopsis brevicaulis AS 3.3985 侵蚀橡胶 13萨氏曲霉 Asperaillus sydowi 3.3943 纤维素 14康宁木霉 Trichoderma koningii 3.4004 15产黄青霉 Penicillium chrysogenum 3.3890 16顶青霉 Penicillium chrylophilum 3.3889 2.1.2 制备

10、方法a) 材料和器皿 DT100单盘天平，电炉子或电磁炉，石棉网，烧杯，1000ml的容器，漏斗，试管，玻璃棒等。 其它F20APH计，牛角匙，洁净纱布、棉花等。b) 方法和步骤 预先在容器内倒入半量的蒸馏水（500ml）； 用DT-100单盘天平称出各种成份（详见电子天平称的使用说明书）； 配制时除磷酸氢二钾以外，其余成份和蔗糖依次溶入蒸馏水中； 每加一种成份后应用玻璃棒充分搅拌，待完全溶解后再加第二种； 磷酸氢二钾另溶于200ml的蒸馏水中，然后加入上述的溶液中，最后加蒸馏水至规定体积，并加入琼脂；6 将装有各种成份的烧杯放在石棉网上，用文火加热并用玻璃棒徐徐搅拌，使各种试剂完全溶解，放入

11、蔗糖，溶化后加蒸馏水至1000ml；7 初配好的查氏培养基是偏酸性的，故要氢氧化钠（NaOH）调PH；为避免过碱，应缓慢加入氢氧化钠（NaOH），边加边搅拌并不时地用F20APH计测试或用PH试纸测得PH值为6.8；8 过滤培养基可用2层纱布趁热过滤（适宜温度应为50左右）。9 分装试管将查氏培养基趁热加至漏斗上。分装时左手并排地拿数根试管，右手控制弹簧夹开关，将培养基依次加入各试管。用于制作斜面培养基时，装量不超过试管（15mm×150mm）高度的1/5（约3ml4ml）。分装时谨防培养基沾在试管口上，以免使棉塞沾上培养基而造成染菌。 灭菌将上述冷却后的查氏培养基斜面试管放入高压蒸

12、气湿热灭菌锅内进行灭菌（灭菌方法详见附录A中培养基或接种液灭菌法）。2.2 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）2.2.1 主要成份马铃薯 200g葡萄糖 20g琼脂 （1520）g蒸馏水 1000mlPH 5.82.2.2 制备方法a) 材料和器皿 DT100单盘天平，电炉子或电磁炉，石棉网，烧杯，1000ml的容器，漏斗，试管，玻璃棒等。 其它F20APH计，牛角匙，洁净纱布、棉花等。b) 方法和步骤 将马铃薯用水洗干净，去皮挖去芽眼，切成小块，称取200g。然后再称取葡萄糖20g; 用DT-100单盘天平称出各种成份备用（详见电子天平称的使用说明书）; 加热溶解将备好的200g马铃薯放入洁净并装

13、有1000ml的蒸馏水中，加热煮沸1小时后用纱布过滤，在添加蒸馏水使之达到1000ml，注入20g琼脂再加热，待琼脂完全溶化后，加入20g葡萄糖； 调节PH初配好的马铃薯培养液是偏酸性的，故要氢氧化钠（NaOH）调PH。为避免过碱，应缓慢加入氢氧化钠（NaOH），边加边搅拌并不时地用F20APH计测试或用PH试纸测得PH值为5.8； 过滤培养基可用2层纱布趁热过滤（适宜温度应为50左右）； 分装试管将马铃薯葡萄糖培养基趁热加至漏斗上。分装时左手并排地拿数根试管, 右手控制弹簧夹开关，将培养基依次加入各试管。用于制作斜面培养基时，装量不超过试管（15mm×150mm）高度的1/5（约3

14、ml4ml）。分装时谨防培养基沾在试管口上，以免使棉塞沾上培养基而造成染菌； 灭菌将上述冷却后的马铃薯葡萄糖培养基斜面试管放入高压蒸气湿热灭菌锅内进行灭菌（灭菌方法详见附录A中培养基或接种液灭菌法）。2.3 马铃薯葡萄糖琼脂（生化试剂）2.3.1 主要成份马铃薯葡萄糖琼脂2.3.2 制备方法a) 材料和器皿 DT100单盘天平，电炉子或电磁炉，石棉网，烧杯，1000ml的容器，漏斗，试管，玻璃棒等。 其它牛角匙，洁净纱布、棉花等。b) 方法和步骤 称取马铃薯葡萄糖琼脂62克，加入1升蒸馏水中，加热溶解，后在12120min高压灭菌备用。 分装试管斜面试管分装方法同2.2.2中及灭菌。 倒平板

15、方法和步骤同3中3.1.3、 倒平板(用于霉菌孢子活力检验以及菌种分离)3.1 方法和步骤 融化培养基取装在三角瓶内的培养基置于水浴中煮沸、融化后取出，待冷却至温度50左右（以不烫手为宜），供倒平板用。 将若干无菌培养皿叠放在左侧，便于拿取； 点燃酒精灯，将火焰调到适中（空气不要太大，以免气流过急）； 倒平板时，先用左手握住三角瓶的底部，倾斜三角瓶，用右手旋松棉塞，然后用右手的小指和手掌边缘夹住棉塞并将它拨出（切勿将棉塞放在桌面上），随之将瓶口的周缘在火焰上过一下（不可灼烧，以防爆烈），以杀死可能沾在瓶口处的杂菌。然后将三角瓶从左手传至右手中（用右手的拇指、食指和中指拿住三角瓶的底部），在这操

16、作过程中瓶口应保持在离火焰2-3cm处，瓶口始终向着火焰，左手拿起一套培养皿，用中指、无名指和小指托住培养皿底部，用食指和大拇指托住皿盖并开启一缝，恰好能让三角瓶口伸入，迅速倒入培养基约12ml，加盖后平置于桌面上，用手轻轻推摇培养皿，使培养基均匀分布（手持不稳，容易造成平面歪斜），平置于桌面上待凝。然后将三角瓶移至左手，瓶口再次过火并塞紧棉塞； 贴标签 将完全凝固后并无冷凝水的培养皿在皿底贴上标签，并注明检测类型、组别及日期等（也可用记号笔书写在皿底）； 培养 把装有培养基的培养皿倒置放入25-30的恒温箱内培养三天； 检测培养皿 将培养三天后的无菌培养皿从恒温箱内取出。若培养皿内培养基有杂

17、菌或被污染就淘汰掉，没有杂菌或未被污染的培养皿备用。4、菌种的移植、培养4.1菌种的移植 贴标签将注有菌名、接种日期和接种者姓名的标签贴在试管培养基斜面的正上方（离试管口约3-4cm处）； 点燃酒精灯 点燃酒精灯，并将火焰调至适中； 旋松棉塞经灭菌后的棉塞纤维常粘在试管壁上，为了接种时易于拔出，故应先旋松棉塞（切勿将棉塞拔出）； 手持试管将菌种管及待接种的斜面试管并排放置在左手的食指、中指的无名指之间,试管一般宜保持水平位置，两个试管口要平齐，斜面朝上，用拇指按住试管的基部（注意勿使拇指遮住整个斜面）。 灼烧接种针（环）右手握在接种针（环）的胶木柄上（如握铅笔状）。将镍铬针（环口）和其余部分在

18、火焰的氧化焰部位烧红，然后将接种针（环）的金属柄也通过火焰两三次，进行灭菌。 用右手无名指和小指掌边先后夹住两支试管的棉塞，在火焰旁轻轻地拔出，同时将试管口通过火焰两三次，然后让试管稍离火焰，仍应保持水平状态，以防杂菌由管口进入污染菌种。 移植将烧红的接种针（环）伸入菌种管中，先使针（环）端轻触斜面的顶端或边缘，令其冷却后再挑取少许菌苔快速移至待接种试管斜面上，自基部开始划至一条线（要求培养基不能划破）。接种完后，移出接种针（环），同时将两支试管口依次过火，最后塞上棉塞，并将试管插在试管架上。 杀灭接种针(环)上的残菌接种完后应立即灼烧接种针（环），以杀死残留的菌体。如接种针（环）上的菌丝较粘

19、湿，则应先烧红接种针（环）柄部分，再逐渐移至接种针（环）口处灼烧，否则残留于针（环）上的菌体会因骤然灼烧而四处飞溅并造成污染。同时把灼烧后的接种针（环）放入装有盛有酒精的锥形瓶中。 清洗 废弃的菌种试管应放入高压蒸气灭菌锅内进行灭菌（灭菌方法见附录A）。灭过菌后的菌种试管应拔去棉塞放入浸泡在配制好的84消毒液中，48小时内刷洗干净。 无菌培养室内的灭菌（灭菌方法见附录A） 超净工作台灭菌（灭菌方法见附录A）4.2 菌种培养 将新移植的菌种试管再次旋紧了防脱落。然后插在试管架上，放置在2530的恒温箱内培养1421天。菌种培养期间应及时观察菌苔在试管培养基上的生长情况，经培养后可取生长良好的菌株

20、作为保藏菌种 结果记录将新培养菌种过程、结果记录于附表3中 试分析斜面接种成败的原因 对培养1421天合格的菌种拍摄照片并记录存档。5、 菌种的保藏(见附录B)6、 试验设备准备试验前，对所有的试验设备进行检查维护工作。 主要有：更换湿球纱布；给加湿水箱加满蒸馏水；给湿球纱布补水槽加蒸馏水至标线位置；检查冷机或风机皮带松紧度，如有破损即更换；检查试验箱内加湿出水有无堵塞，及时清理；检查箱内灭菌灯开关是否在“关”的正常位置；检查箱室通气开关是否处于“关”的正常位置；根据所依据试验标准中规定的试验条件和设备操作规程启动试验箱，设置试验参数（含温度、湿度上下限、风速、加湿水箱等），当检查试验设备处于

21、正常工作状态时，即关机待用。7、试验样品的准备7.1 外观检查记录试验样品的初始状态。逐一进行严格的外观检查。如样品表面的光洁度、缺陷及材料工艺等，并作详细记录。7.2 试验样品的清洁处理试验样品不般是不进行清洁处理的。如果试验目的是考核试品材料的耐霉性、试品所用防霉剂的效果或委托方要求需对样品进行清洁处理时（但在试验报告中一定要注明此样品已清理）。那么试品就需要进行清理，以排除试验样品表面的油污、汗渍、灰尘等外来物的干扰，真实地反映出试验样品的耐霉性。 清洁试品时可用75%或95%的已醇或蒸馏水，轻轻擦抹、晾干（清洁要在试验进行前72小时进行），以让任何挥发物质蒸发。7.3 性能检测如试验样

22、品需要进行性能检测时，应作好记录。7.4 安装试验样品及对照样品试验样品置放在样品架上或悬挂到挂钩上悬挂，应尽量减少其接触部分，试验样品与试验样品之间距离应大于5cm，与箱壁间距离应大于10cm，样品之间的距离应保持空气自由流动。对照样品垂直悬挂在箱门与试验样品同高，靠近试验样品处，不与样品接触。7.5 预处理试验样品和对照样品安装结束后，按试验所依据的标准要求，试验箱开机运行。样品在所设定的试验条件下，预处理4h后进行接种。8、对照样品的准备8.1 制备对照样品 对照样品应选用白棉布或滤纸制成，尺寸约3×13cm(或共长度与试验样品同高)，每次试验的样品不得少于3件（应参照各标准所

23、要求的不同进行来处理对照样品）。8.2 配制对照样品的浸渍溶液或营养液(表3、表4) 9、试验所需用具及灭菌（见附录A） 100ml锥形量杯3个； 玻璃棒20根； 150ml锥形磨口瓶6个（瓶中含有45ml蒸馏水和5075粒直径为5mm的玻璃球）； 直径为5cm玻璃漏斗10个； 离心试管6包(每包6个)；蒸馏水1000ml; 50ml量筒2个； 20ml磨口带盖试管6支；移液管20支； 喉头喷雾器2个； 15cm2过滤纱布6块，15cm2清洁纱布10块； 装有培养基的培养皿6个； 250ml长颈；纱瓶2个； 玻璃刮产6个； 离心试管瓶塞6包（每包6个）； 废液瓶1个。表3 浸渍（营养）液的制备

24、方法浸渍（营养）液制备方法项目GB/T2423.16GJB4.10-83GB/T2423.16GJB4.10-83成份磷酸二氢钾（KH2PO4）0.7g磷酸氢二钾（K2HPO4）0.3g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g硝酸钠（NaNO3）2.0g氯化钾（KCL）0.5g硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）0.01g蔗糖 30.0g蒸馏水加至100ml液体查氏培养基1、将浸渍溶液的的成份按量称好，依次放入洁净的盛有100ml蒸馏水的容器内。2、用氢氧化钠或盐酸调PH值至5.3把对照样品浸入新配制的液体查氏培养基中，取出滴干，立即应用。表3（续） 浸渍（营养）液的制备方法浸

25、渍（营养）液制备方法项目GJB150.10-86HB5830.13-86GJB150.10-86HB5830.13-86成份甘油 10g磷酸二氢钾（KH2PO4）0.1g硝酸铵（NH4NH3）0.1g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.025g酵母膏 0.005g蒸馏水 加至100ml1、将无机盐溶液的各成份按量称好，依次放入洁净的盛有100ml蒸馏水的容器内。2、调PH值用氢氧化钠或盐酸调PH值至6.06.5之间，否则应重新配制。二、制备混合孢子悬浮液（以GJB150中规定的方法为例,其它各标准可按有关条款的规定执行，没有具体要求的可参照此方法）1、工作台内向培养14-21天的菌种

26、试管中注入无菌水溶液10ml。2、用接种针（环）或玻璃棒将培养基上生长的菌种刮入溶液中。3、将试管中的孢子溶液倒入装有45ml无菌水和50-70粒直径5mm实心玻璃球的容积为150ml的带盖锥形瓶内，并向瓶中注入每升含0.05g湿润剂（吐温80或吐温60）。4、充分摇动锥形瓶，粉碎孢子团，使孢子打散（也可把锥形瓶放在振荡器上以每分钟300转的速度粉碎孢子团）。表4 无机盐溶液、浸渍（营养）液的制备方法一、 无机盐溶液的制备方法无机盐溶液配制方法项目GJB150.10-86HB5830.13-86GJB150.10-86HB5830.13-86成份磷酸二氢钾（KH2PO4）0.7g磷酸氢二钾（K

27、2HPO4）0.7g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.7g硝酸铵（NH4NH3）1.0g氯化钠（NaCl）0.005g硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）0.002g硫酸锌（ZnSO4·7H2O）0.002g硫酸锰（MnSO4·7H2O）0.001g蒸馏水 1000ml1、将无机盐溶液的各成份按量称好，依次放入洁净的盛有1000ml蒸馏水的容器内。2、调PH值用氢氧化钠或盐酸调PH值至6.06.5之间，否则应重新配制。注：其它各标准在做混合孢子悬浮液时用无菌蒸馏水稀释5、孢子悬浮液用装有双层纱布的玻璃漏斗过滤到6个离心试管中，再放入离心机中。6、用离心机（

28、转动约3分钟）分离孢子悬浮液，倒弃离心试管中的上层清液。7、将沉淀物用45ml无菌水再次悬浮，离心分离共进行三次。8、孢子记数 镜检计数室先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洁后才能进行计数。血球计数板中间的大格为记数室，每个大格的面积为1mm2，载波片与盖波片之间的高度为0.1mm，记数室体积为0.1mm3每个大格分为25个中格，每个中格又分为16个小格，测数时以四角四个中格和中间中格共五个中格内总孢子的平均数（每格内最好有3-5个孢子为宜，达到标准中要求每ml孢子悬浮液含：孢子数/毫升=5个中格内孢子总数÷5×25×104×稀释倍数。共有1,

29、000, 000±20%个孢子数）。测数时压格两边的孢子要计算在内，而压另两边的孢子不计算在内。 加样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖波片，把装有各菌种的孢子原溶液用无菌移液管吸取1ml，由盖波片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。 显微镜计数静止5分钟后, 先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。看其浓度是否符合要求，如不符合其标准规定所要求的孢子数量则将进行稀释（反复稀释，直至满足试验所需的浓度要求）。 稀释用无菌移液管吸取1ml的无机盐溶液滴入各菌种的孢子原溶液中，后再重复、中的步骤。9、

30、孢子活力检查在配制成混合孢子悬浮液之前，将镜检合格的每种单一的孢子悬浮液用无菌移液管吸取（不得重复使用）0.2-0.3ml成三点式或用玻璃刮产涂布均匀分别滴入土豆葡萄糖琼脂平板上，。放在2530培养箱中培养7-10天，检查其生长情况，每一种试验菌种都应生长正常，否则使用该混合孢子悬浮液进行的试验无效。 注：使用新鲜制备的混合孢子悬浮液，若不能当天使用，则必须在25保葳，不得超过7天。 注意：如试验所依据的标准中无规定检查每毫升孢子悬浮液的孢子含量，即可将2-3种菌种倒入一个锥形瓶中进行孢子粉碎和离心分离，最后用无机盐溶液或营养液（含无菌水） 将孢子悬浮液稀释(如GB2423.16中规定用无菌水

31、或营养液将孢子悬浮液稀释至500ml)。 以上工作完成后，应立即对霉菌培养室、超净工作台以及制备用具进行灭菌，灭菌方法见（附录A）。三、试验1、样品接种及灭菌将配制好的混合孢子悬浮液倒入喉头喷雾器中，以细雾状将混合孢子悬浮液喷到试验样品及对照样品的所有暴露的表面上，喷到液珠凝露但不滴落为止。喷菌结束后，立即关上箱门，检查记录设备的运行状态和显示数据。并立即对室内及使用后的物品进行灭菌处理（灭菌方法见附录A）。2、对试验箱的工作状态实施监控，使施加标准规定的试验条件于设定的容差的范围内。3、换气及检查长霉情况样品在接种后的第七天，打开外箱门，从玻璃观察窗外检查对照样品的长霉情况，若霉菌覆盖面积大

32、于90%，试验继续进行；若小于90%则停止试验。4、孢子活力检查7天后，从恒温箱中取出各菌种培养皿观察。任一试验菌种在培养皿平板内应生长正常。否则，使用该混合孢子悬浮液进行的试验无效。5、试验中断处理在试验中，如发现停电或试验设备出现故障而中断试验时，应根据不同标准规定的试验中断处理方法来处理，同时做好记录。四、样品出箱及最终检测1、 样品外观检查试验结束后，试验箱关机。这时逐件将样品取出，检查长霉情况，试验箱相对湿度保持不小于70%。先用肉眼检查样品的长霉程度，若肉眼看不清楚，就借助放大镜进行检查，并记录霉菌生长的部位、复盖面积、颜色、生长形式、生长密度和生长厚度；观察产品外观受霉菌侵蚀的面

33、积比例来确定，严格的分级要求各标准中都很具体。2、 试验结果等级评定（表5）将外观检查结果与试验前情况比较，并按各试验标准所依据的长霉等级进行逐一评定长霉等级，必要时可拍摄照片并存档。3、 对照样品的检查对照样品的长霉程度如要比第7天时减弱，则试验无效。五、出具试验报告及资料归档 要详细、清楚、真实地记录和整理各种试验原始资料，出具试验报告。办理样品交接手续后交付试验样品，后完成资料归档。表5 军用和民用航空设备长霉等级评定表等级长霉程度长霉情况说明GJB150.10-86HB5830.13-860不长霉未见霉菌生长无霉菌生长1微量长霉霉菌生长和繁殖稀注或局限。生长范围小于试验样品总面积10%

34、，基质很少被利用或未被破土。几乎未发现化学、物理与结构的变化。霉菌生长和繁殖稀少或局限2轻微长霉霉菌的菌落断续蔓延或松散分布于基质表面，霉菌生长占总面积30%经下，中量程度繁殖。有断续蔓延或松散布着的菌落，霉菌中等程度繁殖。3中等长霉霉菌较大量生长和繁殖，占总面积70%以下，基质表面呈现化学、物理结构变化。霉菌较大量生长繁殖，试验样品呈现化学、物理和结构变化，试品被霉菌覆盖面占上31%70%。4严重长霉霉菌大量生长繁殖，占总面积70%以上，基质被分解或迅速劣化变质。霉菌大量生长繁殖，试验样品被分解或迅速变质，试品被霉菌覆盖面积占71%100%。GB/T2423.16-99GJB4.10-830

35、在标称放大约50倍下无明显长霉肉眼看不到试验样品表面有霉菌生长。1肉眼看不到或很难看到长霉，但在显微镜下可见明显长霉。试验样品表面有微量菌丝生长，或有极少量的直径小于1毫米的霉斑。2肉眼明显看到长霉，但在样品表面的覆盖面积小于25%。试验样品表面有稀疏网状的菌丝生长,分布或有少量的直径约23毫米的霉斑，生长区面积小于25%。3肉眼明显看到长霉，在样品表面的覆盖面积大于25%。试验样品表面菌丝呈茂密的绒毛状覆盖层或有大量霉斑分布面积大于50%。附录A灭菌方法（包含整个霉菌试验过程中的灭菌方法）在霉菌试验过程中有许多步骤是要求无菌操作的，因此灭菌是整个试验中的重要环节。灭菌的彻底与否将直接影响试验

36、结果的准确程度，能否确切地反映霉菌试验的真实情况，也是关系到试验结果的可靠性。常用灭菌方法有热力灭菌、化学灭菌及物理灭菌。一、 热力灭菌1、 干热灭菌1.1高温箱（恒温箱）灭菌 恒温箱主要是用来培养霉菌菌种、检测培养皿、菌种分离、孢子活力检查等。我们在恒温箱空闲时，就要对恒温箱进行灭菌。恒温箱灭菌时，温度要缓慢的上升（右边大旋钮放在INCUBATOR位置）升到160180时保持4小时（常用165）。灭菌后温度要逐渐下降到60以下再打开箱门,慢慢地再让箱内温度下降到最低.1.2酒精灯灭菌在菌种移植、分离及培养时用的接种针（环）、试管口、倒平板以及金属工具如刀、剪、镊等的灭菌在酒精灯的火焰上烧；也

37、可用酒精浸过后在火上将酒精烧去，连续数次即可。都能达到灭菌目的及保证无菌操作。2、 高压湿热蒸气灭菌主要是利用高压蒸气的灭菌作用，它有较大的渗透力，容易使蛋白质凝固和变性。高压湿热蒸气灭菌是一种可靠的灭菌方法，提高灭菌锅内蒸气温度来达到灭菌目的。它能杀死一切微生物。它的特点是杀菌可靠、经济、快速、无嗅、无味和无毒性，能达到安全有效。 灭菌时，先在灭菌锅的底部放入适量的清水（水刚温过电阻丝）这时将待灭菌的器皿以及被霉菌污染的物品用纸（牛皮纸、旧报纸）包装好，放入高压灭菌锅内，用报纸把整个锅内盖好,然后盖上盖，旋紧锅盖关闭放气阀。把电压调到220V开始加热，等压力在0.05Mpa下面一格时，将放气

38、阀缓慢的打开，这时锅内的冷气一点一点的排除掉,直到冷气完全排尽(蒸气从气门有力的冲击)关闭气门,随之压力上升,直到指针到0.105Mpa为止，锅内温度121，时间保持在30min）。电压调至140V，保持30min，开始计算时间。灭菌时间即将结束时，停止加热，让灭菌锅自行降压，等压力锅指针回到接近零时即可开启放气阀，使锅内蒸气排空，然后揭盖取出已灭菌的物品。 灭菌过程中，由于蒸气的冷凝，使灭菌物品的包皮受潮容易发生再污染，因此从灭菌锅中取出灭菌物品前应设法在锅内干燥后，再取出物品。 其灭菌的步骤如下： 预热 排除锅内冷空气 关闭放气阀 灭菌（达到灭菌压力恒压保持） 排气（打开放气阀） 干燥 结

39、束。凡是在霉菌试验中所有用过的物品都应先在高压蒸气灭菌后方可洗涤，当物品过于污浊或压力蒸气锅内空气未被完全排除时，此方法灭菌无效，须重新灭菌。二、化学灭菌 化学灭菌即利用化学药剂进行灭菌。在霉菌试验中一般用于被霉菌污染过的物品，如试验箱、试件、衣物以及试验箱周围被污染的环境灭菌。常用化学杀菌剂的浓度及应用范围见表6：表6 常用化学杀菌剂的浓度及应用范围序 号名 称常用浓度应用范围 1乙醇75%95%喷洒、浸泡、擦拭、皮肤及器械消毒 2次氯酸钠溶液常温24下，蒸馏水稀释1:9(10000ppm)喷洒、擦拭、浸泡 3来苏儿2%5%（稀释25倍）空气消毒、喷洒及擦拭室内的桌面、椅子 4重铬酸钾（工业

40、用）浓H2SO4(工业用)100ml重铬酸钾(工业用)50g自来水850g移液管、玻璃棒、试管刷及难以清洗的器具三、物理灭菌（辐射灭菌）物理方法灭菌是利用紫外线灯照射。霉菌对紫外线敏感，对之抵抗力强，霉菌大于细菌550倍，较长时间照射也能杀死霉菌和破坏毒素。紫外线照射时不可以超过1.2米为宜，为了加强灭菌效果，在开紫外线灯之前，可先在无菌室内喷洒2%5%的来苏儿溶液，照射时间应在4小时。紫外线对人体有害，不能直视开着紫外线灯。四、霉菌试验过程中采用的灭菌法1、玻璃器皿灭菌法玻璃器皿可采用高压湿热蒸气灭菌、化学（药剂）灭菌。在试验前对用牛皮纸或旧报纸包装好的所需玻璃器皿和在试验后被霉菌污染过的玻

41、璃器皿及物品放入高压湿热蒸气灭菌锅内，上面覆盖一层旧报纸，灭菌锅指针到0.105Mpa，锅内温度121，电压调至140V，保持20min。试验后灭菌过的玻璃器皿放入1:9(1000ppm)次氯酸钠溶液中浸泡30分钟后洗刷干净并用旧报纸包装好后备用。3、 培养基（或接种液）灭菌法培养基和接种液一般采用高压蒸气灭菌法，将装有培养基或接种液的试管塞好棉塞，用旧报纸包好后放入高压锅内，上面覆盖一层旧报纸，以免蒸馏水落下打湿棉塞，然后进行灭菌。注意玻璃瓶或试管中盛培养基的量不宜过满，以容器的为宜，量太多灭菌不易彻底，在灭菌后放气时培养基的温度下降速度往往比较灭菌锅温度的下降稍慢，如放气过快培养基过满，培

42、养基可因沸腾而沾湿棉塞。查氏培养基与接种液需在锅内温度121，灭菌锅指针到0.105Mpa，电压调至140V，保持30min。马铃薯琼脂培养基需在锅内温度121，灭菌锅指针到0.105Mpa，电压调至140V，保持30min。4、 被霉菌污染过的物品灭菌法被霉菌污染过的物品如试管、器皿、衣物、小金属械等均可采用高压蒸气灭菌，锅内温度121，灭菌锅指针到0.105Mpa，电压调至140V，保持30min。5、 无菌室、霉菌试验箱（室）的灭菌无菌室、霉菌试验箱（室）的灭菌采用化学、紫外线灯照射灭菌法。无菌室应在每周一次用2%5%浓度的来苏儿溶液来擦拭超净工作台内包括接种针（环）、桌面、椅子，然后室

43、内用紫外线灯照射4小时。 霉菌试验箱（室）在入箱后用酒精擦拭箱门把手、室内开紫外线灯照射4小时。出箱后，均可用1:9(1000ppm)次氯酸钠溶液、喷洒地面及箱内后，关闭箱门20分钟后用水冲洗试验箱，反复两次即可。附录B菌种的保藏微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。常用的菌种保藏方法有：斜面或半固体穿刺菌种的冰箱保藏法，石蜡油封藏法，砂土保藏法，冷冻干燥保藏法和液氮保藏法等。目前我们通常采用斜面冰箱保藏法和石蜡油封藏法二种方法的保藏。一、斜面冰箱保藏法此方法主要是利用低温来抑制微生物的生

44、命活力。通常是将已培养好的纯菌种直接放入25左右冰箱中保藏，使微生物在低温下维持其缓慢生长。当培养基中营养成份被逐步耗尽后再重新移植于新鲜培养基上，如此间隔一段时间就移植一次，故又称定期移植保藏法或传代培养保藏法。一般丝状真菌约36个月移植一次。二、石蜡油封藏法将医用液体石蜡装入三角瓶中，装量不超过三角瓶总体积的1/3，塞上棉塞，外包牛皮纸（旧报纸），加压蒸气灭菌（121条件下灭菌30min），连续灭菌二次。在40温箱中放置二周（或置105110烘箱中烘2小时），以除去石蜡油中水份，使石蜡油变为透明状，备用。 加石蜡油 用无菌滴管吸取石蜡油于菌种管中，加入量以高出斜面顶端或直立柱培养基表面约1

45、cm为宜。如加量太少，在保藏的过程中会因培养基稍露出斜面而逐渐变干。 收藏 棉塞外包牛皮纸，把试管直立放置于25冰箱中保藏，一般可保藏2年。附录C防护措施由于霉菌中有些菌种对人体是有害的，因此，在霉菌试验进行过程中，以及在处理做过试验的试验样品时应注意以下几点：1、 进入无菌室及霉菌试验室进行试验操作时,应穿工作服，戴口罩、帽子、橡胶手套及鞋套以防止霉菌孢子弄到皮肤、衣物上或吸入呼吸道内；2、试验的某些操作如菌种移植、接种、分离、菌种检查等均应在专用的超净工作台或房间中进行。2、 为了减少霉菌与皮肤的接触，在操作过程中如配孢子悬浮液、接种、喷洒孢子悬浮液、检查长霉的试验样品时皆应带手套，使用后

46、应灭菌。3、 喷洒孢子悬浮液时均或能吸入霉菌孢子，因此，为了避免吸入霉菌孢子，应带一个可过滤霉菌孢子的口罩或防毒面具，或在专用设备中进行上述工作。5、培养过霉菌的试管、培养皿等器皿应用高压蒸气灭菌后再进行清洗；6、长霉试验的对比样件应进行很好的处理。不建议用燃烧法，因为燃烧时烟雾能将孢子带到空气中而污染大气。对比样件在最后处理前应用高压蒸汽灭菌法灭菌。7、严禁在操作试验过程中进食，离室前用肥皂洗手；8、每一试验结束后穿的工作服不应带出室外，更不应穿在身上到处走动。9、喷菌时要在喷菌箱（室）中进行，防止霉菌孢子扩散到空气中；10、长霉试验后，试验样品不应乱放，应及时处理。最好集中在一个房间内用7

47、5%90%的酒精擦拭后，再用紫外线灭菌灯进行灭菌4小时或更长时间。附录B军用和民用航空设备霉菌试验用菌种及受影响的材料项 目GJB150.10-86HB5830.13-86试验菌种及编号受影响的材料黑曲霉 Aspergillus niger 3.3928 在许多材料上广泛生长，对铜盐有抵抗性黄曲霉 Aspergillus flavus 3.3950 皮革杂色曲霉 Asprygillus versicolor 3.3885 皮革绳状青霉 Penicillum funiculosum3.3875,3.3872 织物、塑料、棉织品球毛壳霉 Chaetomium globosum 3.4254 纤维素

48、GJB.150.10A-200X(未实施)黑曲霉 Aspergillus niger AS 3.3928 在许多材料上广泛生长，对铜盐有抵抗性土曲霉 Aspergillus terreus AS 3.3935 帆布、纸板、纸宛氏拟青霉 Paecilomyces varioti AS 3.4253 塑料、皮革绳状青霉 Penicillum funiculosum AS 3.3875,3.3872 织物、塑料、棉织品赭绿青霉 Penicillumochrochloron AS3.4302 塑料、织物短柄帚霉 Scopulariopsis brevicaulis AS 3.3985 橡胶绿色木霉 T

49、richoderma viride AS 3.3942 塑料、织物黄曲霉 Aspergillus flavus 3.3950 皮革杂色曲霉 Asprygillus versicolor 3.3885 皮革绳状青霉 Penicillum funiculosum 3.3875,3.3872 织物、塑料、棉织品 球毛壳霉 Chaetomium globosum 3.4254 纤维素黑曲霉 Aspergillus niger AS 3.3928 在许多材料上广泛生长，对铜盐有抵抗性GB/T2423.16-99黑曲霉 Aspergillus niger AS 3.3928 在许多材料上广泛生长，对铜盐有

50、抵抗性土曲霉 Aspergillus terreus AS 3.3935 帆布、纸板、纸出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans AS 3.3984 侵蚀涂料与皮革宛氏拟青霉 Paecilomyces varioti AS 3.4253 塑料、皮革绳状青霉 Penicillum funiculosum 织物、塑料、棉织品赭色青霉 Penicillium ochrochloron AS 3.4302 对铜盐有抵抗性，侵蚀塑料与纺织品光孢短柄帚霉 Scopulariopsis brevicaulis AS 3.3985 侵蚀橡胶绿色木霉 Trichoderma viride AS

51、 3.3942 塑料、织物GJB4.10-83黑曲霉 Aspergillus niger 3.3928 在许多材料上广泛生长，对铜盐有抵抗性萨氏曲霉 Asperaillus sydowi 3.3943宛氏拟青霉 Paecilomyces varioti 3.4253 塑料、皮革球毛壳霉 Chaetomium globosum 纤维素腊叶芽枝霉 Cladosporium herbarum 3.3897康宁木霉 Trichoderma koningii 3.4004 产黄青霉 Penicillium chrysogenum 3.3890 土曲霉 Aspergillus terreus 3.3935 帆布、纸板、纸注：菌种编号为中国科学院北京微生物研究所保藏的菌种编号附录C一、培养基的制备一、 查氏培养基（Ca）材料和器皿： 琼脂 器皿：DT100单盘天平（或天平），电炉子，石棉网，烧杯，1000ml的容器，漏斗，试管，玻璃棒等。 其它：PH试纸或F20APH计，牛角匙，棉花，洁净纱布等。方法和步骤：二、 查氏培养基的成份硝酸钠（NANO3