医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆课件

1、医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆我的细胞培养计划我的细胞培养计划（手写和打印均可）（手写和打印均可）应包括如下内容：应包括如下内容：1 1、培养目的：、培养目的：2 2、实验室条件：、实验室条件：已具备的条件；尚未具备的条件。已具备的条件；尚未具备的条件。3 3、培养方法：、培养方法： 1 1）培养基的选用（含应补充的附加成分）及培养所需的其它用液；）培养基的选用（含应补充的附加成分）及培养所需的其它用液； 2 2）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）；）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）； 3 3）培养过程的观察的注意事项；）培养过程的观察的注意事项；4 4、目的细胞的

2、鉴定方法：、目的细胞的鉴定方法： 1 1）具体方法（可列）具体方法（可列1 13 3种）；种）； 2 2）应出现的结果：阳性；阴性。）应出现的结果：阳性；阴性。5 5、困难及解决办法：、困难及解决办法：本作业作为成绩评定依据之一本作业作为成绩评定依据之一医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆我的细胞培养计划我的细胞培养计划（手写和打印均可）（手写和打印均可）注意事项：注意事项：1 1、作业上交时间及地点：、作业上交时间及地点： 时间：校历第时间：校历第1616周（周（08.12.1908.12.19）前）前 地点：地点：104104馆三楼（组胚教研室）馆三楼（组胚教研室）2 2、作业必须

3、标明的项目：、作业必须标明的项目：题题 目目学号学号 姓名姓名 专业专业 导师导师本作业作为成绩评定依据之一本作业作为成绩评定依据之一医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆体外培养的原理与技术体外培养的原理与技术薛庆善薛庆善 主编主编广西医科大学组胚教研室广西医科大学组胚教研室何少健何少健电话：；电话：；( (办办) )E-mail: E-mail: 医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆体外培养的基本原理与技术体外培养的基本原理与技术一、从体内生存环境到体外生长条件一、从体内生存环境到体外生长条件二、体外培养的基本方法和过程二、体外培养的基本方法和过程三、体外培养物的生长生物学三

4、、体外培养物的生长生物学四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化五、细胞系（株）、细胞克隆五、细胞系（株）、细胞克隆六、培养物的观察检测方法六、培养物的观察检测方法医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化从有机体组织分离得到的细胞悬液以及从动物体液获得从有机体组织分离得到的细胞悬液以及从动物体液获得的细胞一般都包含多种细胞成分，为异质性的混合物。的细胞一般都包含多种细胞成分，为异质性的混合物。而进行体外细胞培养的目的，不外乎研究特定细胞的特而进行体外细胞培养的目的，不外乎研究特定细胞的特性、功能或其它特殊用途，故一般必须获取分离开的和尽可性、功能或其它特殊用

5、途，故一般必须获取分离开的和尽可能均一的细胞群体。能均一的细胞群体。在进行体外细胞培养时，不仅要将拟培养组织材料制备在进行体外细胞培养时，不仅要将拟培养组织材料制备成成分离（离散）的细胞（分离（离散）的细胞（dissociated celldissociated cell），），以细胞悬液以细胞悬液的形式接种并培养，更重要的是从所制备的细胞悬液中的形式接种并培养，更重要的是从所制备的细胞悬液中分离分离(separation or isolation)(separation or isolation)出成分尽可能单一的细胞用于出成分尽可能单一的细胞用于培养。培养。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细

6、胞系细胞克隆细胞分离（细胞分离（cell separation)cell separation)指的是将组织材料分散制成细胞悬液后，从中获取目的指的是将组织材料分散制成细胞悬液后，从中获取目的细胞的过程。（细胞分离是针对于细胞成分而言，而不针对细胞的过程。（细胞分离是针对于细胞成分而言，而不针对生物化学成分）。生物化学成分）。细胞纯化（细胞纯化（cell purification)cell purification)强调从原代培养前、成分混杂的异质性细胞悬液中或者强调从原代培养前、成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞分离和纯

7、化过程，使得培养物成为单一型培养通过细胞分离和纯化过程，使得培养物成为单一型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者即物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者即细胞系细胞系（cell line）或或细胞株细胞株。四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆分离和纯化两概念之间没有截然的界限。许多情况分离和纯化两概念之间没有截然的界限。许多情况下，细胞分离和纯化并不是完全彻底的，培养物中只能下，细胞分离和纯化并不是完全彻底的，培养物中只能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度，所以也常达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度，所以也常称为称为富集（富集（en

8、richmentenrichment）。）。分离和纯化细胞的过程不仅仅是在原代培养之前进分离和纯化细胞的过程不仅仅是在原代培养之前进行，有时候，分离和纯化细胞的过程还贯穿在原代与继行，有时候，分离和纯化细胞的过程还贯穿在原代与继代培养的过程之中，甚至主要依靠培养过程实现分离与代培养的过程之中，甚至主要依靠培养过程实现分离与纯化细胞的目的。纯化细胞的目的。培养物中细胞成分是否单一或者培养物中细胞成分是否单一或者目的细胞目的细胞在培养物在培养物中的比例如何，常常是衡量某一培养工作是否成功的中的比例如何，常常是衡量某一培养工作是否成功的重重要指标要指标。四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化医药卫生第

9、4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆根据所要分离纯化的对象和目的不同，可以采用不同根据所要分离纯化的对象和目的不同，可以采用不同的细胞分离纯化方法，从简单的手工操作技术到使用自动的细胞分离纯化方法，从简单的手工操作技术到使用自动控制的特别是电脑控制的尖端仪器。控制的特别是电脑控制的尖端仪器。从成分混杂的细胞悬液中将不同的细胞区分开来达到从成分混杂的细胞悬液中将不同的细胞区分开来达到分离纯化，主要是根据不同的细胞所具有的各种各样特性分离纯化，主要是根据不同的细胞所具有的各种各样特性而实现的，或者是利用细胞的而实现的，或者是利用细胞的物理特性物理特性如密度、体积、电如密度、体积、电荷等，或者是利用细

10、胞的荷等，或者是利用细胞的生物学特性生物学特性如特异性表面标志和如特异性表面标志和功能。功能。四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法3.3.根据细胞表面电荷的细胞分离方法根据细胞表面电荷的细胞分离方法4.4.基于不同黏附特性的细胞分离方法基于不同黏附特性的细胞分离方法5.5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法6.6.利用其它细胞学特性分离纯化细胞的方

11、法利用其它细胞学特性分离纯化细胞的方法四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离将用于体外细胞培养的动物组织材料制备成细胞悬将用于体外细胞培养的动物组织材料制备成细胞悬液，然后接种并培养，是原代培养的液，然后接种并培养，是原代培养的最常规方法最常规方法。由于从体内切取的大多数组织（少数结缔组织如血由于从体内切取的大多数组织（少数结缔组织如血液、骨髓、淋巴等除外），均是由细胞和少量的细胞间液、骨髓、淋巴等除外），均是由细胞和少量的细胞间质（后者内一般含有纤维成分）紧密

12、结合而成的实体组质（后者内一般含有纤维成分）紧密结合而成的实体组织。如果直接将所取的组织块用来培养（此即为植块培织。如果直接将所取的组织块用来培养（此即为植块培养），在培养的组织块大于养），在培养的组织块大于1 mm1 mm3 3时，培养过程中时，培养过程中只有只有位位于植块周边的细胞容易获得营养而存活和生长发育。于植块周边的细胞容易获得营养而存活和生长发育。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离由于受组织内部的纤维成分的束缚，能够从植块由于受组织内部的纤维成分的束缚，能够从植块内部迁移出来的细胞

13、很少。大部分位于植块内部的细胞内部迁移出来的细胞很少。大部分位于植块内部的细胞会因营养物质和气体渗透困难而缺乏营养和会因营养物质和气体渗透困难而缺乏营养和O O2 2供应，以供应，以致生长发育不良或者死亡，这也是植块培养法难以进行致生长发育不良或者死亡，这也是植块培养法难以进行长期体外培养的长期体外培养的主要原因主要原因。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆为了获得大量细胞培养物，必须将组织解离，将组织为了获得大量细胞培养物，必须将组织解离，将组织块内部细胞与细胞之间的块内部细胞与细胞之间的“组织关系组织关系”解除，将细胞解除，将细胞“解解放放”，使之成为分离（离散）的细胞，这个过程即

14、为，使之成为分离（离散）的细胞，这个过程即为细胞细胞分离（离散）分离（离散）或或分散（分散（cell dissociation)cell dissociation)。细胞分离（离散）或分散并不等于细胞分离和纯化，细胞分离（离散）或分散并不等于细胞分离和纯化，但是，细胞分散是细胞纯化的前提。目前所建立的体外分但是，细胞分散是细胞纯化的前提。目前所建立的体外分离和纯化细胞的方法，绝大多数是从细胞悬液中进行分离离和纯化细胞的方法，绝大多数是从细胞悬液中进行分离和纯化的。和纯化的。将所切取的组织制备成细胞悬液，是细胞分离和纯化将所切取的组织制备成细胞悬液，是细胞分离和纯化的基础。的基础。1.1.解离（

15、散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆如何通过不同的机械分离与酶学解离方法实现对如何通过不同的机械分离与酶学解离方法实现对目的目的细胞细胞一定程度的分离纯化呢？一定程度的分离纯化呢？一方面一方面，可根据所取组织的细胞构成，尤其是细胞的，可根据所取组织的细胞构成，尤其是细胞的大小不同进行分离纯化；大小不同进行分离纯化；另一方面另一方面，根据不同组织的，根据不同组织的细胞细胞间质间质特性不同而实现。特性不同而实现。在每一次培养接种时，应尽量先以各种方法使得细胞在每一次培养接种时，应尽量先以各种方法使得细胞悬液中悬液

16、中目的细胞目的细胞之比例提高。之比例提高。为实现此目的，可从下列步骤的进行中最大限度地获为实现此目的，可从下列步骤的进行中最大限度地获得得目的细胞目的细胞。1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆（1 1）取材）取材取材是整个体外培养过程的开始。准确的取材是获得某取材是整个体外培养过程的开始。准确的取材是获得某一特定培养对象的一特定培养对象的关键关键。在切取动物组织块时，要在切取动物组织块时，要尽量剔除尽量剔除所附带的其它组织和所附带的其它组织和残余结构。残余结构。（2 2）机械分离过程）机械分离过

17、程在机械分离所取组织的过程中，能够进行初步的细胞分在机械分离所取组织的过程中，能够进行初步的细胞分离纯化的手段之一，就是按照组织内不同细胞的大小差异，离纯化的手段之一，就是按照组织内不同细胞的大小差异，以一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞。以一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞。 1)1)网搓法：网搓法：2 2）细胞悬液过滤：）细胞悬液过滤： 1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆（3 3）用酶学方法分离纯化）用酶学方法分离纯化用酶学方法达到部分分离纯化的主要依据是：不同组织用酶学方法达到部分分离纯

18、化的主要依据是：不同组织的细胞和间质的构成不同。例如，上皮组织的细胞间质少，的细胞和间质的构成不同。例如，上皮组织的细胞间质少，间质内的纤维成分少，最有效的蛋白酶是间质内的纤维成分少，最有效的蛋白酶是胰蛋白酶胰蛋白酶。而结缔。而结缔组织、肌肉组织的细胞间质中纤维成分较多。要消化结缔组组织、肌肉组织的细胞间质中纤维成分较多。要消化结缔组织、肌肉组织中的间质成分，需要使用织、肌肉组织中的间质成分，需要使用胶原酶胶原酶和和其它酶其它酶，胰，胰蛋白酶的消化作用不明显。蛋白酶的消化作用不明显。 （4 4）培养过程中的选择性分离）培养过程中的选择性分离 在体外分散细胞培养过程中，培养物本身有一种自然在体外

19、分散细胞培养过程中，培养物本身有一种自然纯化的特性。纯化的特性。 1) 1) 机械刮除法：机械刮除法：2 2）选择性酶消化法：）选择性酶消化法：1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法细胞可视为一种完整的颗粒并且表现出与此有关的细胞可视为一种完整的颗粒并且表现出与此有关的物理物理性状性状。不同类型细胞的物理性状可能互不相同，这些差异正。不同类型细胞的物理性状可能互不相同，这些差异正是部分或完全地分离纯化细胞的依据之一。是

20、部分或完全地分离纯化细胞的依据之一。基于基于物理性状物理性状的细胞分离纯化技术，由于无需对细胞进的细胞分离纯化技术，由于无需对细胞进行化学处理，也不像多数生物学方法那样需要行化学处理，也不像多数生物学方法那样需要抗原抗原抗体抗体、受体受体配体配体相互作用，故可避免细胞发生变化，因而这类技相互作用，故可避免细胞发生变化，因而这类技术具有其自身的优越性。术具有其自身的优越性。细胞分离纯化中细胞分离纯化中最常利用最常利用的物理性状是的物理性状是细胞的体积细胞的体积（大（大小）、小）、密度密度和和表面电荷表面电荷。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆利用细胞利用细胞体积体积和和密度密度进行分离

21、纯化的技术均基于进行分离纯化的技术均基于沉降作沉降作用用。不同类型细胞往往具有不同的体积和密度，可以采用沉。不同类型细胞往往具有不同的体积和密度，可以采用沉降技术将其分离开来。降技术将其分离开来。其基本原理是其基本原理是，悬液中细胞的沉降率，悬液中细胞的沉降率与与细胞体积细胞体积、细胞密度细胞密度和其周围和其周围介质密度介质密度之差成正比。之差成正比。应用沉降技术，使之应用沉降技术，使之沉降的沉降的细胞的密度细胞的密度应该比介质大，应该比介质大，而使之而使之漂浮的漂浮的细胞的密度细胞的密度则应比介质小。因此，实施沉降技则应比介质小。因此，实施沉降技术分离纯化细胞的术分离纯化细胞的关键在于关键在

22、于选择选择密度梯度形成介质密度梯度形成介质，故沉降，故沉降技术也称为技术也称为密度梯度（离心）技术密度梯度（离心）技术。2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆选择选择密度梯度形成介质密度梯度形成介质的的一般原则一般原则是：是：所形成溶液的密度应包括所需要的密度范围；所形成溶液的密度应包括所需要的密度范围；形成的溶液黏度较低；形成的溶液黏度较低；具有某些性质如折射率，据此可测定它的浓度（或密度）；具有某些性质如折射率，据此可测定它的浓度（或密度）；不损伤细胞或不改变细胞的生物学特性；不损伤细胞或不改变细胞的生物

23、学特性；离心分离后易于除去；离心分离后易于除去；不妨碍分离组分的分析。不妨碍分离组分的分析。按照上述原则来选择，分离细胞常用的按照上述原则来选择，分离细胞常用的密度梯度形成介质密度梯度形成介质有：有：（1 1）牛血清白蛋白牛血清白蛋白（bovine serum albuminbovine serum albumin，BSA)BSA)（2 2）聚蔗糖聚蔗糖（polysucrosepolysucrose）（3 3）泛影酸盐泛影酸盐（DiatrizoateDiatrizoate）（4 4）硅胶颗粒硅胶颗粒2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法医药卫生第4次细

24、胞分离与纯化和细胞系细胞克隆（1 1）牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（bovine serum albuminbovine serum albumin，BSA)BSA)由于由于BSABSA是血清蛋白，它对细胞活性的影响很小，是早期应用连续是血清蛋白，它对细胞活性的影响很小，是早期应用连续或不连续密度梯度分离细胞的最常用介质，但或不连续密度梯度分离细胞的最常用介质，但BSABSA黏度很高，分离细胞黏度很高，分离细胞必须长时间离心，且用量大，费用高，故现在已经部分被其它分离介质必须长时间离心，且用量大，费用高，故现在已经部分被其它分离介质取代。取代。（2 2）聚蔗糖（聚蔗糖（poly-sucrosep

25、oly-sucrose）是一种合成的蔗糖聚合物，是一种合成的蔗糖聚合物，商品名商品名叫叫FicollFicoll, ,常用的是：常用的是：M Mr r400 000 400 000 PaPa, ,名为名为Ficoll 400Ficoll 400。FicollFicoll不渗入生物膜，渗透压也很小，不影响细胞活性和酶活性，不渗入生物膜，渗透压也很小，不影响细胞活性和酶活性，但其渗透毒性有随浓度成指数增加的趋势，且高浓度但其渗透毒性有随浓度成指数增加的趋势，且高浓度FicollFicoll溶液的黏度溶液的黏度大，可导致细胞凝集，故常以低浓度大，可导致细胞凝集，故常以低浓度FicollFicoll和

26、其它物质如泛影酸盐合用和其它物质如泛影酸盐合用以增加溶液的密度。以增加溶液的密度。Ficoll 400Ficoll 400是目前常用的细胞分离介质之一，商品是目前常用的细胞分离介质之一，商品含量为含量为4040（w wV V），也可用），也可用FicollFicoll干粉来配制。干粉来配制。2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法（3 3）泛影酸盐泛影酸盐泛影酸盐泛影酸盐离子强度低，可配制成高密度而低渗透毒性的溶液，离子强度低，可配

27、制成高密度而低渗透毒性的溶液，而且黏度比而且黏度比FicollFicoll小，很适合密度梯度分离细胞，常与小，很适合密度梯度分离细胞，常与FicollFicoll配合配合使用。使用。国外常用商品国外常用商品IsopaqueIsopaque或称或称Triasil (sodium metrizoate)Triasil (sodium metrizoate)和和Hypaque (sodium diatrizoateHypaque (sodium diatrizoate），与），与FicollFicoll配制的溶液商品名为配制的溶液商品名为Ficoll-Isopaque(Triosil)Ficoll-

28、Isopaque(Triosil)或或Ficoll-HypaqueFicoll-Hypaque，泛影酸盐价格较贵。，泛影酸盐价格较贵。国内常用造影剂泛影葡胺（国内常用造影剂泛影葡胺（meglumini diatrizoicimeglumini diatrizoici）代替，）代替，其商品名为其商品名为Urografin,Urografin,含量通常为含量通常为60%60%或或75%,75%,其与其与FicollFicoll配制的溶配制的溶液商品名是淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），密度液商品名是淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），密度1.0771.077士士0.0010.001，主要用于人单个核细胞

29、的分离。主要用于人单个核细胞的分离。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法（4 4）硅胶颗粒硅胶颗粒 用用聚乙烯毗咯烷酮聚乙烯毗咯烷酮（polyvinylpyrolidone, PVP)polyvinylpyrolidone, PVP)包被包被硅胶颗粒硅胶颗粒， 商品名为商品名为PercollPercoll。 PercollPercoll具有以下具有以下优点优点：稳定性很好，可长期保存；稳定性很好，可长期保存；密度稀释范围较大，可包括大多数哺乳动物细胞的密度；密度稀释范围较大，可包括大多数哺乳动物细胞的密度；

30、在溶液内产生的渗透压很小，故在全部密度范围内能保持等张；在溶液内产生的渗透压很小，故在全部密度范围内能保持等张；黏度低，即使在最大密度时也是如此，因此用较小的离心力和较短的时黏度低，即使在最大密度时也是如此，因此用较小的离心力和较短的时间就可达良好的分离效果；间就可达良好的分离效果；对细胞无毒性，且易于从细胞制剂中洗涤除去；对细胞无毒性，且易于从细胞制剂中洗涤除去；在高速离心（在高速离心（1010，000 r/min)000 r/min)时，可形成连续密度梯度；时，可形成连续密度梯度；价廉，分离细胞时用量少。价廉，分离细胞时用量少。 因此，因此，PercollPercoll是一种很优良的分离介

31、质，是现在用于分离多种哺是一种很优良的分离介质，是现在用于分离多种哺乳动物细胞的乳动物细胞的最常用介质之一最常用介质之一。商品商品PercollPercoll的密度一般为（的密度一般为（1.131.13士士0.0050.005） 医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法不同细胞的分离方法：不同细胞的分离方法：A.A.一步一步密度梯度离心法密度梯度离心法B.B.等等密度梯度离心法密度梯度离心法C.C.速度沉降法速度沉降法D.D.离心淘析分离技术离心淘析分离技术血细胞的分离血细胞的分离玫瑰花环细胞的分离玫瑰花环细胞

32、的分离连续连续BSABSA密度梯度离心法密度梯度离心法非连续非连续BSABSA密度梯度离心法密度梯度离心法连续连续PercollPercoll密度梯度离心法密度梯度离心法非连续非连续PercollPercoll密度梯度离心法密度梯度离心法低速离心速度沉降法低速离心速度沉降法单位重力沉降法单位重力沉降法简单重力沉降法分离白细胞与红细胞简单重力沉降法分离白细胞与红细胞简单重力沉降法分离粒细胞简单重力沉降法分离粒细胞医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法A.A.一步密度梯度离心法：一步密度梯度离心法：一步密度梯度离

33、心法分离细胞的一步密度梯度离心法分离细胞的依据依据是细胞的是细胞的密度密度和和体体积积。将细胞悬液加于一种高密度介质上，应用低速离心，密将细胞悬液加于一种高密度介质上，应用低速离心，密度大于介质的细胞通过介质而沉淀于管底，而密度低于介质度大于介质的细胞通过介质而沉淀于管底，而密度低于介质的细胞则滞留于介质之上，体积较大的细胞沉降较快，体积的细胞则滞留于介质之上，体积较大的细胞沉降较快，体积较小的细胞沉降较慢，从而将具有不同密度和大小的细胞分较小的细胞沉降较慢，从而将具有不同密度和大小的细胞分离开来。离开来。一步密度梯度离心法常用于分离血细胞和形成玫瑰花环一步密度梯度离心法常用于分离血细胞和形成

34、玫瑰花环的淋巴细胞。的淋巴细胞。一步密度梯度法常用的分离介质是：一步密度梯度法常用的分离介质是：Ficoll-Hypaque,Ficoll-Hypaque,也可用也可用Percoll,Percoll,动物血清动物血清,BSA,BSA等。等。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法B.B.等密度梯度离心法等密度梯度离心法等密度梯度离心法分离细胞的等密度梯度离心法分离细胞的依据依据是细胞的是细胞的密度密度。在在等密度连续梯度等密度连续梯度分离中，细胞在强离心力的作用下，分离中，细胞在强离心力的作用下，通过密度逐渐增

35、高的介质沉降，当其到达某一沉降距离，细通过密度逐渐增高的介质沉降，当其到达某一沉降距离，细胞的密度恰好等于梯度介质的密度，因此沉降速度为胞的密度恰好等于梯度介质的密度，因此沉降速度为0 0。在平衡状态下，细胞在此特定位置形成一条区带而不再在平衡状态下，细胞在此特定位置形成一条区带而不再继续沉降，所以具有不同密度的细胞群体便在梯度介质的不继续沉降，所以具有不同密度的细胞群体便在梯度介质的不同位置上形成区带。同位置上形成区带。因此，等密度梯度离心法分离细胞仅仅依赖于细胞的密因此，等密度梯度离心法分离细胞仅仅依赖于细胞的密度。反过来，通过测定细胞停留处梯度介质的密度，可以确度。反过来，通过测定细胞停

36、留处梯度介质的密度，可以确定细胞的密度。定细胞的密度。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法B.B.等密度梯度离心法等密度梯度离心法非连续非连续密度梯度离心法密度梯度离心法分离细胞的原理与分离细胞的原理与连续连续密度梯度密度梯度离心法离心法是相同的，但细胞集中在介质和介质之间的界面上。是相同的，但细胞集中在介质和介质之间的界面上。等密度梯度离心法采用强离心力，其目的仅仅是加快达等密度梯度离心法采用强离心力，其目的仅仅是加快达到平衡的速度和减少扩散的混合效应。到平衡的速度和减少扩散的混合效应。虽然细胞体积的大小

37、可影响建立平衡的速度，但不影响虽然细胞体积的大小可影响建立平衡的速度，但不影响达到平衡时细胞在梯度上所处的位置。达到平衡时细胞在梯度上所处的位置。应用本技术分离细胞常用的梯度介质有应用本技术分离细胞常用的梯度介质有BSABSA和和PercollPercoll。因为建立平衡的速度与介质的黏度成反比，故采用因为建立平衡的速度与介质的黏度成反比，故采用PercollPercoll等等低黏度介质所制备的密度梯度离心分离细胞，可在低离心力、低黏度介质所制备的密度梯度离心分离细胞，可在低离心力、短时间内达到平衡。短时间内达到平衡。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆2.2.利用细胞体积和密度进行分

38、离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法C.C.速度沉降法速度沉降法在速度沉降中，细胞的体积和密度共同影响细胞的分级在速度沉降中，细胞的体积和密度共同影响细胞的分级分离，但分离，但细胞体积细胞体积为主要决定因素。为主要决定因素。细胞在单位重力下通过低密度介质（约细胞在单位重力下通过低密度介质（约1.01 g/ml1.01 g/ml）沉）沉降，或在低离心力（通常为降，或在低离心力（通常为100 g100 g）作用下通过密度梯度层）作用下通过密度梯度层而沉降，此种细胞分离方法即速度沉降。而沉降，此种细胞分离方法即速度沉降。前者称为单位重力沉降法，后者即所谓低速离心速度沉前者称为单位重力沉降

39、法，后者即所谓低速离心速度沉降法。降法。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法D.D.离心淘析分离技术离心淘析分离技术离心淘析（离心淘析（centrifugal elutriationcentrifugal elutriation）分离技术是通）分离技术是通过含细胞介质溶液的流力和浮力与细胞所受离心力之间相互过含细胞介质溶液的流力和浮力与细胞所受离心力之间相互作用而分离细胞的一种技术。作用而分离细胞的一种技术。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆3.3.根据细胞表面电荷的细胞分离方法根据细胞表面电荷的

40、细胞分离方法细胞表面均带有电荷，在电场中可向一定的方向泳动，细胞表面均带有电荷，在电场中可向一定的方向泳动，此即细胞电泳。细胞在电场中的泳动速度与其所带电荷密度此即细胞电泳。细胞在电场中的泳动速度与其所带电荷密度有关。有关。在生理在生理pHpH条件下，绝大多数细胞带负电荷，在电场中条件下，绝大多数细胞带负电荷，在电场中将向正极泳动，但不同细胞所带负电荷密度不同，故在电场将向正极泳动，但不同细胞所带负电荷密度不同，故在电场中泳动速度不同，据此可将不同类型的细胞分离开。中泳动速度不同，据此可将不同类型的细胞分离开。电泳分离细胞需要特殊的仪器设备。用于细胞电泳的仪电泳分离细胞需要特殊的仪器设备。用于

41、细胞电泳的仪器型号很多，其操作原理也不尽相同。某些仪器仅用于分析，器型号很多，其操作原理也不尽相同。某些仪器仅用于分析，有些则既可用于分析，也可用于制备。有些则既可用于分析，也可用于制备。用于制备目的用于制备目的最常用的细胞电泳技术最常用的细胞电泳技术是是自由流动电泳自由流动电泳和和密度梯度电泳密度梯度电泳。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆1.1.自由流动电泳分离技术自由流动电泳分离技术采用自由流动电泳仪可以进行细胞的连续分离，目前多用的仪采用自由流动电泳仪可以进行细胞的连续分离，目前多用的仪器是器是EIPhor VaPEIPhor VaP细胞电泳仪。细胞电泳仪。细胞电泳分离技术已

42、用于人和动物细胞电泳分离技术已用于人和动物T,BT,B淋巴细胞及其它一些细胞淋巴细胞及其它一些细胞的分离，尤其以分离大鼠的分离，尤其以分离大鼠T,BT,B淋巴细胞比较成功。淋巴细胞比较成功。优缺点：细胞电泳分离技术的优点是所分离的细胞完整无损，优缺点：细胞电泳分离技术的优点是所分离的细胞完整无损，活性较高，保持原来的生物学特性，可用于许多方面的研究。其不活性较高，保持原来的生物学特性，可用于许多方面的研究。其不足之处是分离方法还不太理想，重复性较差，设备复杂且价格昂贵，足之处是分离方法还不太理想，重复性较差，设备复杂且价格昂贵，故一直未能推广应用。故一直未能推广应用。2.2.密度梯度电泳分离技

43、术密度梯度电泳分离技术密度梯度电泳分离法是用聚蔗糖或聚蔗糖蔗糖制成密度梯度密度梯度电泳分离法是用聚蔗糖或聚蔗糖蔗糖制成密度梯度进行电泳分离细胞的技术，样品经分离后，不同的细胞群体在此梯进行电泳分离细胞的技术，样品经分离后，不同的细胞群体在此梯度上形成稳定的区带。常用的密度梯度电泳仪是度上形成稳定的区带。常用的密度梯度电泳仪是Buchler Poly-Buchler Poly-Prep 200Prep 200电泳仪。电泳仪。密度梯度电泳技术分离细胞方法复杂，设备价格昂贵，现在应密度梯度电泳技术分离细胞方法复杂，设备价格昂贵，现在应用并不广泛。用并不广泛。3.3.根据细胞表面电荷的细胞分离方法根据

44、细胞表面电荷的细胞分离方法医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆4.4.基于不同黏附特性的细胞分离方法基于不同黏附特性的细胞分离方法黏附于某些固相物质如玻璃或塑料的表面，是某些类黏附于某些固相物质如玻璃或塑料的表面，是某些类型细胞的基本生物学特性之一，但另一些细胞却缺乏这种型细胞的基本生物学特性之一，但另一些细胞却缺乏这种能力；或某些细胞的黏附能力强、黏附作用快，而另一些能力；或某些细胞的黏附能力强、黏附作用快，而另一些细胞黏附能力弱或黏附作用慢。细胞黏附能力弱或黏附作用慢。根据这种差异，可用下列方法根据这种差异，可用下列方法分离分离或或消除消除某些类型的某些类型的细胞。细胞。A.A.差

45、速黏附处理差速黏附处理B.B.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-10G-10过柱法过柱法C.C.羰基铁粉法羰基铁粉法D.D.尼龙毛分离法尼龙毛分离法医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆4.4.基于不同黏附特性的细胞分离方法基于不同黏附特性的细胞分离方法A.A.差速黏附处理差速黏附处理根据不同细胞在玻璃或塑料培养瓶皿表面上黏附能力的根据不同细胞在玻璃或塑料培养瓶皿表面上黏附能力的差异，将异质性细胞悬液接种在培养瓶皿内，在培养箱内孵差异，将异质性细胞悬液接种在培养瓶皿内，在培养箱内孵育一定时间；使细胞悬液中黏附能力较强的细胞先黏附在瓶育一定时间；使细胞悬液中黏附能力较强的细胞先黏附在瓶皿的壁上，然后

46、收集尚未黏附的细胞或者已经黏附的细胞，皿的壁上，然后收集尚未黏附的细胞或者已经黏附的细胞，再用于种植和培养。这种将黏附较快的细袍与黏附较慢（或再用于种植和培养。这种将黏附较快的细袍与黏附较慢（或无黏附能力）的细胞分开并分别收集的处理过程就称为无黏附能力）的细胞分开并分别收集的处理过程就称为差速差速黏附处理黏附处理。差速黏附处理差速黏附处理常用于分离常用于分离细胞悬液中的细胞悬液中的成纤维细胞成纤维细胞与其与其它组织细胞。另外，像它组织细胞。另外，像巨噬细胞巨噬细胞之类的具有强黏附能力的细之类的具有强黏附能力的细胞也常借此方法而与其它黏附能力较差的细胞相分离。胞也常借此方法而与其它黏附能力较差的

47、细胞相分离。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆B.B.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-10G-10过柱法过柱法4.4.基于不同黏附特性的细胞分离方法基于不同黏附特性的细胞分离方法葡聚糖（葡聚糖（sephadexsephadex）是葡萄糖的聚合物，在水中膨胀时可形成凝）是葡萄糖的聚合物，在水中膨胀时可形成凝胶。葡聚糖胶。葡聚糖G-10G-10凝胶具有极小的微孔，常用于分离生物大分子，但也凝胶具有极小的微孔，常用于分离生物大分子，但也可用来分离细胞。可用来分离细胞。其分离细胞的其分离细胞的原理原理是：利用细胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖是：利用细胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝胶从而将异质性细胞

48、悬液中的具黏附能力的细胞去除。凝胶从而将异质性细胞悬液中的具黏附能力的细胞去除。C.C.羰基铁粉法羰基铁粉法用羰基铁粉处理，能有效地去除异质性细胞悬液中用羰基铁粉处理，能有效地去除异质性细胞悬液中具有黏附能力具有黏附能力的细胞。的细胞。该法的该法的基本原理基本原理是：把铁粉加入异质性细胞悬液中后，具有黏附是：把铁粉加入异质性细胞悬液中后，具有黏附活性的细胞将黏附于铁粒子，在器皿外用磁铁将铁粒子连同黏附其上活性的细胞将黏附于铁粒子，在器皿外用磁铁将铁粒子连同黏附其上的细胞吸至底部，收获细胞悬液，即为去除了黏附细胞的细胞制剂。的细胞吸至底部，收获细胞悬液，即为去除了黏附细胞的细胞制剂。此法此法通常

49、用于通常用于去除免疫细胞悬液中的去除免疫细胞悬液中的单核巨噬细胞单核巨噬细胞。在此情况。在此情况下，单核巨噬细胞可吞噬铁粒子，这一特性也有助于将其清除。下，单核巨噬细胞可吞噬铁粒子，这一特性也有助于将其清除。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆4.4.基于不同黏附特性的细胞分离方法基于不同黏附特性的细胞分离方法D.D.尼龙毛分离法尼龙毛分离法 尼龙毛尼龙毛(nylon wool)(nylon wool)就是聚酰胺纤维。应用尼龙毛柱就是聚酰胺纤维。应用尼龙毛柱可从混合白细胞悬液中获得富含可从混合白细胞悬液中获得富含T T淋巴细胞的制剂。淋巴细胞的制剂。 其其基本原理基本原理是：是：B B

50、淋巴细胞和单核巨噬细胞易黏附淋巴细胞和单核巨噬细胞易黏附于尼龙毛表面，当白细胞悬液通过尼龙毛柱时，于尼龙毛表面，当白细胞悬液通过尼龙毛柱时，B B淋巴细淋巴细胞、浆细胞及单核巨噬细胞将黏附于柱上，而无黏附能胞、浆细胞及单核巨噬细胞将黏附于柱上，而无黏附能力的力的T T细胞则通过柱子，收集流出的细胞即获细胞则通过柱子，收集流出的细胞即获T T淋巴细胞。淋巴细胞。 此法此法主要用于主要用于从淋巴细胞中分离从淋巴细胞中分离T T淋巴细胞淋巴细胞和和B B淋巴细淋巴细胞胞或从白细胞或单个核细胞中纯化或去除或从白细胞或单个核细胞中纯化或去除T T淋巴细胞。淋巴细胞。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细

51、胞克隆5.5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法根据细胞表面标志的不同，利用相应的抗体特别是单克隆抗体和根据细胞表面标志的不同，利用相应的抗体特别是单克隆抗体和配体，已经建立了多种基于亲和原理的细胞分离纯化方法。配体，已经建立了多种基于亲和原理的细胞分离纯化方法。从理论上讲，根据表面标志的细胞分离方法应该是获得高纯度细从理论上讲，根据表面标志的细胞分离方法应该是获得高纯度细胞群或细胞亚群的最可靠、最有发展前途的分离技术，而实践也证明胞群或细胞亚群的最可靠、最有发展前途的分离技术，而实践也证明的确如此。的确如此。A.A.免疫溶解法免疫溶解法B.B.盘化法盘化法C

52、.C.凝集素凝集法凝集素凝集法D.D.玫瑰花环分离法玫瑰花环分离法E.E.流式细胞分选术流式细胞分选术F.F.免疫磁珠分离技术免疫磁珠分离技术医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆5.5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法A.A.免疫溶解法：免疫溶解法： 免疫溶解法也称免疫消除法。免疫溶解法也称免疫消除法。当补体存在时当补体存在时，用抗细胞某一表面标，用抗细胞某一表面标志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育，可以使具有该特异性表面标志志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育，可以使具有该特异性表面标志的细胞溶解。利用这一原理，将待消除细胞的特异性表面标志的抗体和的

53、细胞溶解。利用这一原理，将待消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加入细胞悬液或细胞培养物中，使抗体及补体作用于具相应抗原的补体加入细胞悬液或细胞培养物中，使抗体及补体作用于具相应抗原的细胞并溶解之。细胞并溶解之。B.B.盘化法（盘化法（panningpanning） ： 是一种在固相表面进行亲和分离细胞的技术，它利用蛋白质分子可是一种在固相表面进行亲和分离细胞的技术，它利用蛋白质分子可吸附于聚苯乙烯塑料表面和吸附于聚苯乙烯塑料表面和抗原一抗体抗原一抗体或或配体一受体配体一受体特异性结合的原理，特异性结合的原理，以聚苯乙烯塑料作为亲和剂的不溶性基质，将抗体（或抗原）、配体以聚苯乙烯塑料作为亲和剂

54、的不溶性基质，将抗体（或抗原）、配体（或受体）蛋白吸附于其表面，加上异质性细胞悬液，带有相应表面抗（或受体）蛋白吸附于其表面，加上异质性细胞悬液，带有相应表面抗原或表面受体（或配体）的细胞将结合于塑料表面，从而将其从异质性原或表面受体（或配体）的细胞将结合于塑料表面，从而将其从异质性细胞悬液中分离出来（阳性选择）或除去（阴性选择）。细胞悬液中分离出来（阳性选择）或除去（阴性选择）。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆5.5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法C.C.凝集素凝集法：凝集素凝集法： 凝集素凝集素(lectin)(lectin)是一类以两价或

55、多价与糖结合的非酶非抗体蛋白质，是一类以两价或多价与糖结合的非酶非抗体蛋白质，能凝集具有一个以上相应互补性糖类的细胞或其它物质。细胞表面能与能凝集具有一个以上相应互补性糖类的细胞或其它物质。细胞表面能与凝集素结合的结构称为凝集素结合的结构称为该凝集素的受体该凝集素的受体，通常为膜蛋白，但凝集素是对，通常为膜蛋白，但凝集素是对糖特异的，一般只与糖蛋白或多糖的末端非还原糖基反应。几乎所有的糖特异的，一般只与糖蛋白或多糖的末端非还原糖基反应。几乎所有的细胞都存在一到几种凝集素的受体，而不同类型细胞往往具有不同凝集细胞都存在一到几种凝集素的受体，而不同类型细胞往往具有不同凝集素受体。素受体。根据细胞表

56、面凝集素受体的不同，可采用不同的凝集素使之凝根据细胞表面凝集素受体的不同，可采用不同的凝集素使之凝集而与其它细胞分离开来。集而与其它细胞分离开来。原则上讲，所有细胞，包括细菌细胞及单细原则上讲，所有细胞，包括细菌细胞及单细胞原生动物，都可以采用不同的凝集素来进行分离纯化。胞原生动物，都可以采用不同的凝集素来进行分离纯化。D.D.玫瑰花环分离法：玫瑰花环分离法： 某些细胞如人某些细胞如人T T淋巴细胞具有异种红细胞的受体，在一定的条件下，淋巴细胞具有异种红细胞的受体，在一定的条件下，T T淋巴细胞可与红细胞相互识别而结合，形成一个淋巴细胞可与红细胞相互识别而结合，形成一个T T淋巴细胞被数个红细

57、淋巴细胞被数个红细胞围绕的现象，在显微镜下观察宛如一支玫瑰花，故形象地称为玫瑰花胞围绕的现象，在显微镜下观察宛如一支玫瑰花，故形象地称为玫瑰花环环(rosette)(rosette)。医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆E.E.流式细胞分选术：流式细胞分选术： 流式细胞仪（流式细胞仪（flow cytometer, FCMflow cytometer, FCM）是一种将）是一种将流体喷射技术、激流体喷射技术、激光技术、空气计数、光技术、空气计数、射线能谱术射线能谱术及及电子计算机电子计算机等技术与等技术与显微荧光光度显微荧光光度计计密切结合的仪器，流式细胞术（密切结合的仪器，流式细胞术

58、（flow cytometryflow cytometry）就是应用）就是应用FCMFCM检测、检测、分析生物颗粒（包括细胞）的物理和或化学特性或借这些特性进行分分析生物颗粒（包括细胞）的物理和或化学特性或借这些特性进行分离纯化的技术。离纯化的技术。 FCMFCM是随着计算机科学、激光技术、流体力学、单克隆抗体制备、定是随着计算机科学、激光技术、流体力学、单克隆抗体制备、定量细胞化学和定量荧光细胞化学等方法和技术的应用而日益完善的，其量细胞化学和定量荧光细胞化学等方法和技术的应用而日益完善的，其检测分析对象范围越来越大，如大的免疫复合物、病毒、脂质体、细胞检测分析对象范围越来越大，如大的免疫复

59、合物、病毒、脂质体、细胞器、原核细胞、真核细胞以及某些简单的多细胞生物，而且对所有生物器、原核细胞、真核细胞以及某些简单的多细胞生物，而且对所有生物都普遍适用，已广泛应用于生命科学的几乎所有分支学科，特别是细胞都普遍适用，已广泛应用于生命科学的几乎所有分支学科，特别是细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血液学、药物学等的研究。生物学、肿瘤学、免疫学、血液学、药物学等的研究。 目前，流式细胞术主要用于细胞的定性、定量研究。目前，流式细胞术主要用于细胞的定性、定量研究。5.5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法医药卫生第4次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆F.F.免疫磁珠分

60、离技术：免疫磁珠分离技术： 免疫磁性微珠（简称免疫磁珠）是以直径几个微米的磁性微珠作为载免疫磁性微珠（简称免疫磁珠）是以直径几个微米的磁性微珠作为载体，将抗体或抗原结合在此载体上，即成为带有免疫配基的磁性微珠。体，将抗体或抗原结合在此载体上，即成为带有免疫配基的磁性微珠。 磁性微珠是一种人工合成的、含金属的小颗粒，由三部分组成：磁性微珠是一种人工合成的、含金属的小颗粒，由三部分组成：核心核心是金属小颗粒，是金属小颗粒，核心的外层核心的外层均匀包裹一层高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯均匀包裹一层高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯等），乙烯等），最外层最外层是功能基团，如氨基（是功能基团，如氨基（NH2