细胞生物学实验指导

1、细胞生物学实验指导书实验一 细胞形态与细胞器的观察一、实验类型验证性实验二、实验目的1、观察各种不同细胞的形态大小，从而对细胞的分类，进化及分化有所了解。 2、 判断和识别光学显微镜下各种细胞器的形态， 大小和数目。三、预习要求 了解显微镜的组成原理及使用方法，预习各种细胞及其细胞器的形态大小、数目、分布特点。四、实验原理细胞是构成生物有机体最基本的结构和功能单位，其物种、部位和功能的不同在形态与大小上也呈现一些区别。由于细胞比较小，细胞器大部分在 0.1m 和10m 之间，而光学显微镜的最高分辨率为 0.2m，所以我们要借助于显微镜才可以观测出细胞形态大小的差异。每种细胞器都有特殊的形态、大

2、小、分布位置及数目，并且通过特异性染色方法可把细胞器各种特殊结构区分开来，这也是我们判断和识别细胞器的依据。另外，细胞器在不同细胞、不同发育时期和不同生理状态下的形态大小也会有所不同。因此，对细胞器的观察可用来判断细胞的生理和发育情况。在取材和观察上要注意各种细胞器在不同细胞中的特殊性。不同细胞的形态大小可以借用目镜测微尺和镜台测微尺进行测量。测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微 尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两者配合使用，可以测量细胞大小。目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃圆片，圆片中央刻有一条直线，此线分为若干格。 物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长1mm，被等分为100格，长为0.0

3、1mm(10m)。当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用 目微尺。因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像，而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需要先用物微尺来标定，求出某一放大率时目微尺每 格所代表的实际长度，然后再用以测定细胞大小。将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：例如：目微尺是100格，其对应的物微尺是80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/100×10=8m。测量某一

4、细胞时，如果目微尺测得其横径为5格，则此细胞横径为8×5=40m。五、实验内容（一）实验器材1、器材 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀、恒温水浴箱、小培养皿、吸管、牙签、烧杯、吸水纸、擦镜纸等2、试剂 0.9%生理盐水、0.1%亚甲基兰、1% 碘液、蒸馏水、无水乙醇等3、材料 真核、原核细胞涂片或切片，动、植物不同组织的新鲜材料切片。4、溶液或试剂：香柏油，二甲苯。（二）操作步骤（一）、细胞形态结构的观察：1、涂片法：人口腔上皮细胞的观察：1）在洁净的载玻片中央，滴一滴生理盐水。2）用消毒牙签的一端，在漱净的口腔侧壁上轻轻地刮几下。3）把牙签上附有碎屑的一端，放在载玻片上的生理盐水

5、滴中涂匀。4）用镊子夹起洁净的盖玻片，将它的一边先接触载玻片上的生理盐水滴，然后，轻轻地盖在水滴上。然后在盖片的一侧加一滴0.1%亚甲基兰染液，在盖片的另一侧用吸水纸吸取，染色后细胞核被染成深蓝色，细胞质浅蓝色。5）用显微镜观察细胞形状，细胞呈扁平鳞状。2、撕片法：撕一小片植物表皮（洋葱、芹菜和韭菜），放在盛有一小滴蒸馏水的载玻片上，用镊子展平，盖上盖玻片在显微镜下观察。细胞大小和形状如何？（二）细胞大小的测定：1、将目微尺放于目镜内。2、将物微尺放在显微镜的载物台上。3、小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处。4、记录起点线到重合线之间的各尺的刻度

6、数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：目微尺每格所代表的实际长度 = 物微尺格数/目微尺格数 × 10M5、将制作的各种细胞临时装片置于载物台上，测定细胞的大小（包括长径和短径）。 六、注意事项：1、制作临时装片时避免产生气泡。2、用物微尺标定的目微尺每格长度的数值代表在某一放大系统下的情况，这一数值会随物镜的放大率而改变，因此，在什么放大倍数物镜下标定的目微尺只能在同一放大倍数的物镜下测定细胞的大小。实验二 细胞和细胞器活体染色一、实验类型综合性实验二、实验目的1、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布； 2、学习一些细胞器的超活

7、染色技术。三、预习要求 预习各种细胞及其细胞器染色原理和方法。四、实验原理 活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶

8、粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用

9、来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。 五、实验内容（一）实验器材1、器材 显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸等2、试剂 Wright 溶液、甲醇60ml、

10、苏木精、硝酸银、中性红-詹纳斯绿染液等（1）Ringer溶液： 氯化钠 8.5g (变温动物用6.5g) 氯化钾 2.5g 氯化钙 0.3g 蒸馏水 1000ml （2）1%、1/3000中性红溶液： 称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热 (3040)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。（3） 1%、1/5000詹纳斯绿B溶液 称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热(3040)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1

11、%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。 3、材料 真核、原核细胞涂片或切片，动、植物不同组织的新鲜材料切片。4、溶液或试剂：香柏油，二甲苯。（二）操作步骤1. 人口腔上皮细胞线粒体的活体染色及观察实 验 方 法1、人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上 滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液 用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞 刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中 染色10l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) 盖上盖玻片,显微镜下观察 2、植物细胞液泡系的超活染色

12、与观察 取豆芽的根尖 用刀片纵切根尖 放入中性红染液滴中，染色510min。 吸去染液，滴一滴Ringer液 盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察) 实 验 结 果 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。实验报告（1）描述口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布 （2）细胞中液泡形态与分布实验三 酸性磷酸酶（AC

13、P）的显示方法一、实验类型验证性实验二、实验目的让学生熟悉并掌握细胞内酸性磷酸酶的显示方法和原理；了解植物液泡在化学组成上的特点。掌握显示细胞中ACP的操作步骤，观察酸性磷酸酶在细胞内的分布状况。三、预习要求 预习组织细胞制片及染色的过程；理解细胞吞噬作用、溶酶体功能和分布以及溶酶体标志酶的性质。四、实验原理酸性磷酸酶广泛存在于各种动物植物组织细胞的溶酶体中，当溶酶体膜保持稳定和完整时，底物不易渗入溶酶体中，溶酶体内的酸性磷酸酶活力微弱或无活性。酸性磷酸酶在组织退变过程中活性增强。当细胞被固定，并在合适的pH值下，溶酶体膜的通透性被改变而变得不稳定，其底物渗透入溶酶体中，酸性磷酸酶显现活力。故

14、其在研究溶酶体异常时有意义。酸性磷酸酶分解磷酸脂而释放出磷酸基。在PH5.0的环境中，磷酸基与铅盐反应形成磷酸铅。但磷酸铅是无色的，所以再与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。本实验的技术特点是：用较短的作用时间，可避免细胞质 内其它蛋白质及核内出现阳性假象，保证了实验的可靠性。Gomori硝酸铅改良法是根据：以磷酸酯为底物，其被磷酸酶水解后释放出磷酸基，在 pH5左右和铅盐结合成磷酸铅盐，但磷酸铅无色，须经硫化铵作用使其变成棕黄色至棕黑色的硫化铅沉淀。五、实验内容（一）试剂与器材1.材料：洋葱。2.试剂： Gomori硝酸铅作用液、1硫化铵溶液等。

15、1） 10%中性福尔马林(pH6.87.2) 甲醛                               10ml 醋酸钠            

16、0;                2g 蒸馏水                             90ml 2）酸性磷酸酶作用液 蒸馏水

17、60;                            90ml 0.2mol/L 醋酸缓冲液(pH4.6)         12ml 5%硝酸铅      

18、60;                     2ml 3.2%-甘油磷酸钠                   4ml 先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份，一份中加醋酸铅溶液，另份加甘油磷酸钠溶液，然后

19、再将两者缓缓混合，边混匀边搅匀。若PH5.0，可加少量醋酸调节。临用前配制。配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀，否则将严重影响实验结果。 3) 1%硫胺溶液 硫化胺                                 1ml 蒸溜水  

20、;                               9ml 4)  姬姆萨染液(1:30) 姬姆萨原液              

21、;               3 滴 磷酸盐缓冲液(PH6.8)                    5ml 3.器材：冰箱，显微镜、注射器、解剖用具、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片，内有湿纱布的小铝盒等。（二）操作步骤。 1.取洋葱内表皮

22、（1cm×0.6cm每瓶放3片）沉于10%中性富尔马林液中，4下固定30分钟，（置冰箱贮藏室），对照实验置50烘箱中。（加液至青霉素瓶1/2体积）2.去福尔马林液，自来水漂洗5分钟。（青霉素瓶水加满，换3次）3.去水，加酸性磷酶作用液，室温下置30分钟。（加液至青霉素瓶1/3体积）4.去作用液，自来水漂洗10分钟。（青霉素瓶水加满，换3次）5.去水，加1%硫化铵处理3-5分钟。（加液至青霉素瓶1/3体积）6.去硫化铵，加水漂洗。（青霉素瓶水加满，换1次）7.置载玻片上，加盖玻片。8.显微镜观察（注意液泡中标黑色的小颗粒，表示有酸性磷酸酶的活力）。9.显微数码拍照。六、注意事项作对照实

23、验：在处理过程中，对照组的作用液中不加入甘油磷酸钠而加入蒸馏水，则呈阴性。七、实验报告实验四 细胞膜的渗透性一、实验类型验证性实验二、实验目的1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。2.了解溶血现象及其发生机制。3掌握普通光学显微镜下细胞及细胞碎片的形态。三、预习要求 预习细胞膜的组成及功能特点。四、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞 胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶

24、 质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。五、实验内容（一）试剂与器材1.材料：血细胞。2.器材：普通显微镜、试管、试管架、滴管、载玻片、盖玻片、擦镜纸、记号笔等。3. 试剂：0.128 mol/L NaCl溶液、0.128 mol/L NH4Cl溶液、0.128 mol/L 醋酸铵溶液、0.128 mol/L草酸铵溶液、 0.128 mol/L NaNO3溶液、0.24mol/L 葡萄糖、0.24mol/L甘油、

25、0.24mol/L 乙醇、 0.24mol/L 丙酮、蒸馏水。（1）Alsever溶液葡萄糖 2.05g 柠檬酸钠(Na9C6H5O7.2H2O) 0.89g 柠檬酸（C6H6O7.H2O） 0.05g 氯化钠 0.42g 蒸馏水 100ml 调 PH 至 7.2，过滤灭菌或高压灭菌 10min，置 4冰箱保存。（二）操作步骤1血细胞悬液的制备：取从集市处接新鲜血5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsever溶液瓶中，匀后置冰箱保存备用（1周内使用）。 2.使用前，取用 Alsevers 液保存的新鲜鸡血 5ml，加入 8ml 0.128mol/L 的 NaCl 溶液，小心混匀，1000

26、 rmin离心 5min，如此 3 次洗涤，最后成 30%的鸡红细胞（CRBC）悬液。3.取 10 支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各 3ml，作出标记后，各管均加入红细胞悬液 2 滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。4.显微镜检查细胞的完整性5.结果1）试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血；镜检红细胞完好为不溶血。2）如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（或）镜检有部分红细胞呈碎片。3）如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（），镜检发现细胞全部呈碎片。六、注意事项1.胶头滴管不可混用，以免造成溶液间的交叉污染。2. 鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。离心结束后，小心倾去上层血浆及中层血小板等成分，尽量控干。目测红细胞体积或置于带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液；试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。3. 结论应肉眼观察与镜检相结合。七、实验报告书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析，见表 1。 表 1 各种溶液的溶血现象观察结果编号测试溶液是否溶血分析原因1