不同成分淋巴细胞输注对荷瘤小鼠异基因骨髓移植的影响

1、不同成分淋巴细胞输注对荷瘤小鼠异基因骨髓移植的影响    作者：方烨，刘文超，薛妍，张红梅，黄颖，斯晓明，程捷    【关键词】 骨髓移植；淋巴细胞输注；移植物抗宿主病；嵌合状态 Effect of heterogenous DLI on tumorbearing mouse treated with alloBMT 【Abstract】 AIM: To establish a tumorbearing mouse model of allogenic bone marrow transplantation (al

2、loBMT) with nonlethal preconditioning, to observe the antitumor effect of heterogenous donor lymphocyte infusion (DLI) after alloBMT and to research the mechanism. METHODS: Recipient mouse was Balb/c (H2Kd)， and donor was C57bl/6(H2Kb). Hepatoma H22 cells were injected into the abdominal cavity of a

3、ll recipient mice， and after that the living status was observed. Five days later， the recipients were treated with preconditioning (TBI 3 Gy CTX 200 mg/kg). The bone marrow cells of the donors were transplanted to the recipients via vena caudalis. Fifty recipient mice were divided evenly into 5 gro

4、ups (A， B， C， D and E groups) at random， according to different DLI. Group A was injected 0.5×107 whole spleen cells from donor mice on day 1， 7 after transplantation; group B was injected 0.5×107 CD8 Tcelldepleted spleen cells from donor mice on day 1， 7; group C was injected 0.5×107

5、 CD4 Tcelldepleted spleen cells from donor mice on day 1， 7; group D， as control group， was just preconditioned but not transplanted or DLI; group E， the blank control group， was neither preconditioned neither transplanted nor DLI. After that life span， the chimerism， hematopoiesis recovery and graf

6、t versus host disease (GVHD) were observed. RESULTS: All recipients showed ascites. Life span of group E was (20.1±3.4) d， shorter than the others. The group C had a longest life span (35.6±3.1) d. Statistical difference was found between group B and C in life span (P<0.05). The chimeri

7、sm of group A， B and C was above 80%. The hematopoiesis of group D （control group）， recovered under no interference. The hematopoiesis recovery of group B was slower than the others. The GVHD scores of group B were higher than those of group A and C. Statistical difference was found between group B

8、and C in GVHD scores （P<0.05）. CONCLUSION: The nonlethal precondition (TBI 3 Gy CTX 200 mg/kg) of mouse model was suitable. When CD4 Tcelldepleted spleen cells were used for DLI， the recipients showed mild GVHD and survived longer due to the slow growth of the tumour cells). But CD8 Tcelldepleted

9、 spleen cells acted reversely. 【Keywords】 bone marrow transplant; lymphocyte transfusion; graft versus host disease; chimerism 【摘要】 目的：建立荷瘤小鼠非清髓异基因骨髓干细胞移植模型，探讨不同成分的供者淋巴细胞输注（DLI）对移植效果的影响及抗肿瘤机制. 方法： 受者鼠为Balb/c(H2Kd)小鼠，供者鼠为C57bl/6(H2Kb)小鼠，受者小鼠腹腔接种小鼠肝癌细胞株H22细胞，观察腹水生成情况及生存状况. 于接种瘤细胞后d5给予全身照射预处理，随后给受者小鼠尾静

10、脉输注供者鼠的骨髓细胞，建立荷瘤小鼠的MHC不相合亚移植模型. 依据不同DLI将荷瘤鼠受者鼠随机分为A,B,C,D,E组，每组10只. A,B,C,D组均给予预处理，A组预处理后于移植d1，7给予供者小鼠全脾细胞0.5×107个；B组分别于移植d1，7给予去除CD8 细胞供者鼠脾细胞0.5×107个；C组于移植d1，7给予去除CD4 细胞供者鼠脾细胞0.5×107个；D 组只接受预处理不作移植及DLI；E组为对照组，既不作预处理，也不接受骨髓细胞移植及DLI. 观察各组成瘤率、生存期、嵌合状态、造血恢复情况及移植物抗宿主病（GVHD）. 结果：所有小鼠均产生腹水，

11、成瘤率100；生存期C组最长为（35.6±3.1）d，B组为（23.7±10.9）d，B，C两组相比有统计学差异(P<0.05)；接受移植的A，B，C组嵌合率均高于0.80，只接受预处理的D组鼠白细胞计数自行恢复正常；GVHD评分C组与B组有明显差异(P<0.05). 结论：建立非清髓荷瘤小鼠异基因骨髓干细胞移植模型条件适宜，说明去除CD4 细胞的DLI能够有效地减轻GVHD反应，延长荷瘤鼠生存期;去除CD8 细胞的DLI会加重GVHD反应，影响移植. 【关键词】 骨髓移植；淋巴细胞输注；移植物抗宿主病；嵌合状态 0引言 造血干细胞移植(hematopoieti

12、c stem cell transplantation，HSCT)最初应用于治疗血液系统恶性肿瘤. 20世纪90年代以来，HSCT技术飞速发展，愈趋成熟，更为安全有效，不仅成为治愈白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液系统恶性疾病的有效方法，而且也是一些良性血液病和某些实体肿瘤治疗的重要方法之一1-2. 随着对HSCT研究的不断深入，人们对其原理有了更为理性的认识，自体造血干细胞移植虽然可以有效减少GVHD的发生，但是由于移植的细胞中肿瘤细胞很难清除干净，从而导致高复发率，另外肿瘤导致的免疫耐受，降低了移植物抗肿瘤（graft versus toumor，GVT）效果；异体同基因移植虽可以解决上述

13、问题但是适宜的供者难以得到，同种异基因移植便成为一种选择，而异基因移植易继发严重的GVHD，使其应用受到很大限制. 由于认识到植活主要是T细胞的早期功能事件，而GVHD 往往是植活以后发生. 完全去除T细胞的移植虽然可以有效地预防GVHD，但会降低移植的成功率、同时肿瘤的复发率及病毒、真菌的感染率增高. 如何提高移植后GVT效应，同时减少GVHD的发生成为研究的热点，近年来开展的供者淋巴细胞输注疗法主要用于造血干细胞移植后，防止或治疗白血病的复发，是一种过继免疫疗法. 而不同成分的淋巴细胞输注可以改变疗效，减轻GVHD反应. 本研究旨在建立荷瘤小鼠异基因骨髓移植模型，并在移植模型中通过改变DL

14、I成分来观察移植效果、抗肿瘤效果及GVHD的差别. 1材料和方法 1.1材料    受者鼠为Balb/c(H2Kd)小鼠雌性50只，供者鼠C57bl/6(H2Kb)小鼠雄性，均为第四军医大学动物中心提供，68周龄清洁级小鼠，质量(20.2±1.5) g，在无菌动物层流实验室按清洁级动物实验要求饲养. 小鼠在骨髓移植前1 wk接受添加红霉素(250 /)和庆大霉素(320 /)的饮水，并持续到移植后2 wk. 小鼠肝癌细胞株H22细胞由西京医院肝胆外科冯全新博士所赠. CD8 和CD4 选择分离免疫磁珠试剂盒（Dynal公司）H2KbFITCmA

15、b，CD4FITCmAb，CD8FITCmAb，CD3PEmAb，1640干粉（eBioscience公司）. 流式细胞分析在第四军医大学免疫实验室完成，60Co射线照射在第四军医大学动物辐照中心完成. 取C57bl/6小鼠，颈椎脱臼处死后，用750 mL/L乙醇浸泡消毒10 min，在超净台中取出小鼠胫骨和股骨，剪开干骺端，用注射器吸取RPMI 1640培养液冲洗出骨髓腔内骨髓，制成细胞悬液，调整细胞数为1.0×1011/L备用. 剖腹，取出脾脏，将脾脏置于200目金属网上，用匀浆器芯轻轻研磨，以RPMI 1640培养液冲洗，制成脾细胞悬液，调整细胞浓度为0.5×1011

16、/L. 取部分脾细胞悬液按CD8 选择免疫磁珠分离试剂盒使用说明的步骤：加抗体至待分离的脾细胞悬液静置20 min，再加入免疫磁珠20反应15 min，重悬后在磁场中反应2 min，吸取余液即为去除CD8 细胞的脾细胞悬液，调整细胞浓度为0.5×1011/L，经流式细胞仪检测（图1），分离前CD8 细胞占0.40 (A1)，分离后占0.02（A2），按照相同的方法制备去除CD4 细胞的供者鼠脾细胞悬液，经流式细胞检测，分离前CD4 细胞占0.35 (B1)，分离后占0.02（B2），分离效果明显(图1)，留作DLI备用. 1.2方法 给受者小鼠Balb/c (H2Kd)鼠腹腔接种H2

17、2细胞1.0×108个细胞，腹水成瘤率100. 接种瘤细胞后d 5接受预处理，所有受者鼠接受全身照射采用60Co射线照射，剂量3 Gy，剂量率60.24 cGy/min，照射d2开始移植，d3给予环磷酰胺200 mg/kg ip. 所有操作均在无菌环境下完成. 建立荷瘤小鼠的MHC不相合亚移植模型，流式细胞分析技术鉴定嵌合状态. 于60Co射线照射d2，经尾静脉注射制备好的供者鼠骨髓细胞2.0×107个，依不同DLI将荷瘤受者鼠随机分为A，B，C，D，E组，每组10只. A，B，C，D组均给予预处理，E组为空白对照组，不接受预处理及移植. A组预处理后于移植d1，7给予供者

18、小鼠全脾细胞0.5×107个；B组分别于移植d 1，7给予去除CD8 细胞供者鼠脾细胞0.5×107个；C组于移植d1， 7给予去除CD4 细胞供者鼠脾细胞0.5×107个；D组只接受预处理不作移植及DLI. 观察各组生存期、嵌合状态、造血恢复情况及移植物抗宿主反应. 从接种瘤细胞开始计算生存期. 骨髓移植后2 wk，取各组每只小鼠外周20 L，肝素抗凝，分别加入1 L H2KbFITCmAb，置4孵育45 min；以TrisNH4Cl溶解红细胞，磷酸盐缓冲液洗2遍后，进行流式细胞仪荧光强度的检测. 同时取3份正常C57bl/6小鼠外周血作为阳性对照标本，3份正常

19、Balb/c小鼠外周血作为阴性对照标本. 比较各组嵌合细胞百分率的差异. 分别于移植的d 1，d 3，d 7，d 11，d 15，d 20时采集尾静脉外周血常规白细胞计数. 移植后GVHD反应：观察有无腹泻、质量下降、弓背、耸毛、活动度差等表现，据此作临床GVHD评分. 质量重下降<10%为0分，10%25%为1分，>25%为2分. 无活动度下降、姿势异常、耸毛为0分，轻度活动度下降、耸毛、姿势异常判为1分，重度活动度下降、耸毛、姿势呈弓背样改变为2 分. 皮肤完整无脱毛为0分、小片浅溃疡、轻度溃疡为1分，大片溃疡、脱毛为2分3. 统计学处理： 统计学分析采用SPSS 10.0处理

20、，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSDt检验，组间生存期比较采用非参数统计方法. P<0.05为有统计学差异.    2结果 2.1生存期对照组E组未接受预处理及移植，带瘤生存期为(20.1±3.4) d，比A组(26.2±2.4) d，B组(23.7±10.9) d，C组(35.6±3.1) d和D组(21.1±0.99) d都短， 其中C组生存期，与其余组比较有统计学差异(P<0.05). 2.2嵌合状态C57bl/6(H2Kb)小鼠流式检测H2Kb百分率为0.97，而Balb/c(H

21、2Kd)小鼠也检测到有0.23的嵌合率，为H2KbmAb非特异性粘着，其余接受移植的A，B，C组嵌合率均在0.8以上(图2). 2.3白细胞变化所有小鼠接受移植前血象正常，接受移植后1 wk左右产生骨髓抑制，白细胞降至最低，至d20左右均能自行恢复正常，但B组接受去除CD8 细胞DLI组的白细胞恢复较其他组慢（图3）. 2.4GVHD反应接受移植的A,B,C组GVHD反应评分：B组得分最高(4.1±1.56)， A组(2.3±1.49)，C组(1.8±1.72)，B组与A,C组间比较有统计学差异(P<0.05)，A,C组间无统计学差异，D组未接受移植，故未统

22、计其GVHD评分. 3讨论 异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，alloHSCT)是近30年来血液学研究获重大进展的领域，也是治愈恶性血液病和某些恶性实体肿瘤、免疫及遗传性疾病的主要方法和根本途径. 非清髓性异基因造血干细胞移植(nonmyeloablative allogeneic stem cell transplantation，NAST)是在传统alloHSCT基础上发展起来的新移植领域. 由于NAST可显著减轻预处理强度，具有相对并发症轻，危险性小，患者存活质量高等优点，扩大了应用适应症，使很多高

23、龄体质差的患者有机会接受NAST治疗，因而备受关注，被称之为造血干细胞移植的新时代、新观念4. 我们基于GVT与GVHD可分的理论上，通过改变DLI成分来减轻GVHD，同时增强GVT效果. 在本实验中，采用小鼠肝癌细胞H22细胞腹腔接种，100形成腹水. 对照组E组未接受预处理及移植，带瘤生存期为(20.1±3.4) d，比其余四组都短，说明预处理及移植能够减轻瘤负荷延长生存期. C组移植后接受去除CD4 细胞的DLI组生存期最长(35.6±3.1) d，与其余组比较有显著统计学差异(P<0.05)，说明去除CD4 细胞的DLI抗瘤效果比其余组强，延长了生存期. 制备

24、DLI时分别采用免疫磁珠去除供者鼠全脾细胞中的CD4 或CD8 细胞，CD8 细胞分离前占全脾细胞0.40分离后占0.02；CD4 细胞分离前占全脾细胞0.35，分离后占0.02，分离效果明显. 预处理后对照组小鼠未接受移植处理，白细胞d7降至最低，并于移植后d20左右自行恢复至正常水平，说明非清髓条件适宜. 其中接受去除CD8 细胞的DLI组小鼠白细胞恢复最慢，GVHD评分结果也明显高于接受全脾细胞组和去除CD4 细胞的DLI组. 移植后d20检测嵌合体，未接受移植的Balb/c小鼠检测到有0.23嵌合率为非特异性粘着，其余嵌合率均在0.80以上，嵌合率较为满意.  &#

25、160; 综上所述，所有受者鼠接受全身照射TBI采用60Co射线照射，剂量3 Gy，剂量率60.24 cGy/min，d3给予环磷酰胺200 mg/kg ip的预处理条件适宜. 制备DLI时分别采用免疫磁珠去除供者鼠全脾细胞中的CD4 或CD8 细胞，方法可行，分离效果明显. 去除CD8 细胞的DLI表现了更严重的GVHD反应和较慢的白细胞恢复，而去除CD4 细胞的DLI组表现了较好的抗瘤效果和较轻的GVHD反应，从而延长了生存期. 这与既往用清髓性预处理实验的研究结果5相反，但与新近的用非清髓性预处理实验研究结果6相吻合. 分析原因可能是使用非清除性预处理方案，对组织的损伤较小，释

26、放的细胞因子、粘附因子和组织抗原较少，还可能与DLI使用剂量以及时机有关. 目前在小鼠体内已经建立起模型7，CD4 Thl和Th2细胞亚型调节作用的重要性，同时有关实验已经证实CD8 Tcl和Tc2亚群可以降低GVHD，介导GVT. 去除CD8 细胞的供者淋巴细胞中存在CD4 细胞，CD4 细胞分泌上述的多种细胞因子直接或间接地参与细胞毒效应，并使GVHD反应更加敏感，同时失去了CD8 Tc2细胞的抑制作用，因而表现了较严重的GVHD反应；去除CD4 细胞的供者淋巴细胞中含有CD8 细胞、NK细胞等杀伤细胞，移植后供者鼠CD8 细胞、DC细胞和NK细胞作为主要的杀伤细胞，与异种抗原相结合可清除

27、异种抗原及瘤细胞，减轻了瘤负荷，同时供者鼠DLI中的CD8 Tcl和Tc2亚群可以降低GVHD，介导GVT，CD4 细胞被去除，未能分泌上述的细胞因子，使GVHD反应没有那么敏感，从而减轻了GVHD反应. 当然这其中的机制是复杂的，随着人们的不断研究和探索，希望会在减轻GVHD，提高GVT效果上寻找最佳途径. 【参考文献】 1Kanda Y，Komatsu Y，Akahane M，et al. Graftversustumor effect against advanced pancreatic cancer after allogeneic reducedintensity stem cell transplantationJ. Transplantation,2005,79(7)：821-827. 2Carella AM. Autografting and nonmyeloablative allogeneic stemcell transplantation in metastatic breast cancer J. Hematologica,2002，87(Suppl1)：11-12. 3Bryson JS，Jennings CD，Lowery DM，et a