免疫法制备液相色谱生物样品的研究DD血中沙丁胺醇的分析

1、免疫法制备液相色谱生物样品的研究血中沙丁胺醇的分析袁倚盛 赵飞浪南京军区南京总医院 南京提 要 用动物免疫法制备了免疫亲和柱纯化水溶性的沙丁胺醇血浆样品琥珀酸酐交联沙丁胺醇和牛血清白蛋白获得抗原免疫家兔抗沙丁胺醇抗体 免疫球蛋白琼脂糖 与抗体交联制成免疫球蛋白亲和柱对高效液相色谱法测定中的一般提取方法和固相小柱提取法作了比较 后者具有内源性杂质干扰少的优点 是生物样品预处理的一种有效的方法关键词 高效液相色谱法 免疫亲和柱 沙丁胺醇 血浆分类号 Ù前言文献报道用色谱法分析血中沙丁胺醇有以下几种预处理生物样品的方法 液 液萃取后再衍生反应 离子对试剂庚烷磺酸 或双 乙基己基 磷酸酯 提

2、取后直接进样 固相小柱提取 作者对上述预处理方法作了验证 发现回收率偏低 内源性的杂质干扰大采用自制的固相小柱预处理这类水溶性的 有效浓度低的 与内源性物质相似的药物取得了满意的结果 本文介绍了免疫法纯化沙丁胺醇的生物样品琥珀酸酐交联沙丁胺醇与牛血清白蛋白 获得大分子抗原强行免疫家兔产生的抗沙丁胺醇兔血清 经纯化得到抗沙丁胺醇抗体 免疫球蛋白琼脂糖 与免疫球蛋白交联制成免疫球蛋白亲和柱含有沙丁胺醇的生物样品通过这种亲和柱后 沙丁胺醇被交联在柱上 杂质被洗去 再换用另一种溶剂洗脱交联上的沙丁胺醇本法回收率可达 在所有的预处理方法中杂质峰的干扰最小实验部分免疫试验制备抗原 沙丁胺醇分子量为 小分子

3、对动物无免疫原性本实验选用琥珀酸酐作交联剂 沙丁胺醇分子与大分子载体 牛血清白蛋白交联在一起 成为 琥珀酸沙丁胺醇酯大分子抗原经测定 本法的结果为 个 分子交联上 个沙丁胺醇分子 免疫动物 给家兔强行免疫注射上述抗原 次 共经历 个月处死动物后取血测定抗血清效价 测定结果为 抗兔血清 硫酸沙丁胺醇 制备免疫亲和柱 纯化抗体 取抗沙丁胺醇兔血清 加入等体积的生理盐水 边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液 使蛋白沉淀 置 冰箱 离心 Ù 得到的沉淀用 生理盐水重溶后 加入 饱和硫酸铵溶液沉淀蛋白 重复 次最后得到的沉淀蛋白加少量生理盐水溶解后装入透析袋内 Ù 含 Ù 溶液透析

4、除去硫酸铵 获得较纯的抗沙丁胺醇抗体 免疫球蛋白 制备免疫球蛋白亲和柱 在活化的琼脂糖 中缓慢加入抗沙丁胺醇抗体 搅拌 用生理盐水清洗后悬浮在生理盐水中 置于 冰箱中备用用时取 抗沙丁胺醇抗体 悬浮液加入小柱内 用 Ù 内含 Ù 清洗后备用这就是抗沙丁胺醇抗体 免疫亲和柱 亦称免疫球蛋白亲和柱血浆样品的预处理取含沙丁胺醇的待测血浆 加入 的 Ù 内含 Ù 溶液 混匀 缓慢 Ù 通过小柱用上述含有 的 溶液 洗 次 水洗 次第 卷第 期色 谱 年 月 本文收稿日期 修回日期抽干 甲醇洗脱交联的沙丁胺醇洗脱液在 空气流下吹干 流动相溶解进样 免疫球

5、蛋白亲和柱用含 的 溶液活化后可以反复使用色谱条件液相色谱仪和 可编程荧光检测器 惠普公司 柱 淮阴精细化工研究所 流动相为甲醇Ù醋酸铵溶液 Ù 流速 Ù 柱温 荧光检测器的激发波长 发射波长 结果与讨论精密度试验每日配制 份含 Ù 的沙丁胺醇血浆样品过免疫球蛋白亲和柱 共 日结果 日内为日间为 线性范围于空白血浆中加入沙丁胺醇标准液 使其浓度分别为 和 Ù 经免疫亲和柱处理 测得的峰面积与相应的浓度进行线性回归计算 得到回归方程 相关系数方程中表示峰面积 表示浓度最小检知浓度达 Ù 回收率试验取线性范围内 种浓度的沙丁胺醇 每种浓度

6、各 份一份加入空白血浆中过免疫亲和柱后进样 一份直接进样 以峰面积计算 得到平均回收率为 讨论免疫亲和法预处理生物样品具有特异性好 干扰少 回收率高的特点图 表示用本文的色谱条件分析 种预处理方法制备的含沙丁胺醇血浆色谱图在甲醇 乙腈沉淀蛋白后的色谱图中干扰峰很多 特异性差自制的固相提取小柱处理样品能满足设计要求 减少了干扰通过免疫亲和柱处理过的样品 干扰的杂质峰更少免疫亲和法制备生物样品是可行的 适用于含量极微而所含干扰物质又难以除去的生物样品的制备此法具有极高的特异性和富集功能 而且免疫亲和柱可以商品化这种方法的缺点是试验周期长 免疫动物的时间至少需要 个月 操作程序要求也严格某种待测药物的免疫亲和柱虽然可以反复使用 但专一性强 只能制备含某种药物的生物样品 不能他用 图 种方法制备沙丁胺醇血浆样品的色谱图 溶剂制备 固相小柱制备免疫亲和柱制备 为沙丁胺醇色谱峰Ù参考文献李 克 袁倚盛 张金辉等 药物