Clusterin抗原的表达、 抗体制备及其初步鉴定

1、Clusterin抗原的表达、 抗体制备及其初步鉴定         11-01-31 14:41:00     编辑：studa20          作者：张迎春, 刘莹, 杨金菊, 柳晓兰, 迟俊, 高建恩, 唐晓波, 朱大岭, 孙启鸿【摘要】  目的: 制备Clusterin（CLU）多克隆和单克隆抗体(mAb), 并进行特性鉴定。方法: 以成人肝cDNA 表达文库为模

2、板, 构建重组表达质粒pGEX4T1CLU和PET32aCLU。GSTCLU 融合蛋白在大肠杆菌中表达, 被作为免疫原制备兔多抗和鼠mAb。采用ELISA法和 Western blot鉴定抗CLU抗血清在重组蛋白和天然蛋白中的特异性。采用Western blot, 间接免疫荧光, 免疫组化鉴定mAb的特异性。结果: GSTCLU 融合蛋白在相对分子质量(Mr)约54000处呈现明显表达条带。Western blot鉴定表明, 制备的抗CLU兔多克隆抗体可特异地识别成人肝总蛋白中Mr约52000和58000的CLU蛋白。获得9株可稳定分泌抗CLU的杂交瘤细胞株可识别重组人CLU 蛋白, 其中有2

3、株可特异性结合HepG2细胞质中的蛋白, 4株可特异性结合成人肝脏组织肝细胞质中的蛋白。结论: 成功地制备出兔抗人CLU抗血清和9株抗CLU的mAb, 为进一步研究CLU在肿瘤中的功能奠定了实验基础。 【关键词】  Clusterin 原核表达 多克隆抗体 单克隆抗体Abstract  AIM: To prepare rabbit polyclonal antibodies (pAb) and mouse monoclonal antibodies (mAbs) against human clusterin(CLU) and characterize these anti

4、bodies properties. METHODS: CLU fragment was amplified from human liver cDNA library, and recombinant expression vectors pGEX4T1CLU and PET32aCLU were constructed. GSTCLU fusion protein was expressed in E.coli and then used as the immunogen. Properties of antiserum against human CLU were identified

5、by ELISA, Western blot, and the mAbs against human CLU was characterized by Western blot, indirect immunofluorescent staining and immunohistochemistry staining. RESULTS: The GSTCLU fusion protein was highly expressed with a molecular weight of 54000. Western blot analysis proved that the rabbit pAb

6、could specifically recognize 52000 and 58000 proteins in human liver total protein. All of the nine established mAbs recognized recombinant human CLU protein, two of which specifically bound to proteins in the cytoplasm of HepG2 cells and four of which specifically bound to proteins in the cytoplasm

7、 of adult liver tissue. CONCLUSION: pAb and mAbs against human CLU were successfully prepared, which will provide efficient tools for functional studies of CLU expressed in human tumors.Keywordsclusterin; prokaryotic expression; polyclonal antibody; monoclonal antibodyClusterin（CLU）是一种普遍存在的异源二聚体硫酸化糖

8、蛋白, 其基因定位于人类染色体8p21, 含449个氨基酸, 相对分子质量（Mr）为7500080000。它主要存在于细胞质中并被分泌到细胞内环境, 由于CLU mRNA不同的剪切翻译, 形成sClusterin（sCLU）和nClusterin（nCLU) 2种变体, 分别发挥抗凋亡和促进凋亡的作用1, 2, 因其功能多样化, 又名为 TRPM2, SGP2, XIP8, ApoJ (apolipoprotein J), SP 4040。在生理条件下, 主要参与脂质转运、 组织重建、  细胞与基质间相互作用及细胞凋亡等生物学过程3。在病理条件下, 近年来众多的研究结果表明, CLU

9、 在肾细胞癌、 卵巢癌、 乳腺癌、 前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生、 发展过程中起重要的癌基因作用1, 4。并且它的表达还受与肿瘤生长相关的多种细胞因子的调控, 如1,25二羟维生素 D3、 转化生长因子1、 电离辐射等。但是目前, CLU基因在恶性肿瘤发生发展中的确切分子机制仍然不清楚。我们主要从构建重组表达载体入手, 获得其融合表达蛋白后, 免疫家兔和BALB/c小鼠, 制备抗CLU抗血清和CLU的mAb, 并进行特性鉴定, 为进一步研究CLU的功能及其在肿瘤的发生、 发展及治疗中的作用奠定基础。1  材料和方法1.1  材料  成人肝cDNA表达文库购自Clo

10、neteck公司。大肠杆菌BL21感受态菌株, pGEX4T1和PET32a购自Amersham公司。限制性内切酶BamH I和Xhol I, ExTaq酶、 T4连接酶等购自TaKaRa公司。PCR回收试剂盒, 质粒提取试剂盒购自Omega Biotek公司。BALB/c小鼠和2.02.5 kg雄性大耳白兔子购自军事医学科学院动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0来自军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室。Hbt小鼠mAb分型试剂盒购自HyCult biotechnology b.v. 公司。鼠抗GST标签mAb, HRP羊抗鼠IgG, HRP羊抗兔IgG, FITC羊抗鼠 IgG, ECL

11、显色系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Poly Helper购自北京吉比埃生物技术有限公司。1.2  方法1.2.1  CLU 抗原的制备和纯化  根据Human Protein Reference Database中提供的CLU的氨基酸序列, 并结合应用生物信息学软件DNAstar lasergene 7.1(DNA*公司)的表位分析, 综合设计引物。在其上游引物设计BamH I 酶切位点, 下游引物设计Xhol I 酶切位点, 片段全长750个碱基（201449氨基酸）, 以成人肝cDNA表达文库为模板进行PCR反应。回收扩增的目的片段并分别与经BamH

12、 I和Xhol I双酶切后的pGEX4T1和PET32a载体, 进行连接, 转化大肠杆菌, 阳性克隆经测序正确后抽提质粒, 进行诱导表达。CLU在BL21细菌中表达形式为包涵体, 表达后进行了复性和纯化。1.2.2  GSTCLU融合蛋白的Western blot分析  将重组菌菌体蛋白经SDSPAGE凝胶电泳后将蛋白质转移至PVDF 膜上。封闭液封闭后, 加入鼠抗GST mAb与膜上的蛋白进行抗原抗体反应后, 用HRP羊抗鼠 IgG进行检测, ECL显色, 至目的条带染色清晰时终止反应。1.2.3  兔抗人CLU抗血清的制备  将纯化的CLU融合蛋白和

13、等体积弗氏完全佐剂充分混合后, 每只家兔皮下多点注射融合蛋白 600 g; 初次免疫4周后加强免疫1次, 接下来1周后耳缘静脉采血检测抗体效价。2周后颈动脉采血, 分离血清, 分装后置-20保存。1.2.4  兔抗CLU血清的特性鉴定  (1)ELISA检测抗血清效价: ELISA检测板用HisCLU融合蛋白以1 mg/L的浓度包被。按14梯度稀释抗血清每孔加入 100 L(阴性对照为正常兔血清代替兔抗CLU血清, 空白对照为TBST代替兔抗CLU血清), 37孵育30 min洗涤3次后, 加入16000稀释的HRP羊抗兔 IgG, 37孵育30 min洗涤3次后进行TMB

14、显色。(2)Western blot检测CLU融合蛋白: 将纯化后蛋白经120 g/L SDSPAGE凝胶电泳后, 并转膜, 依次加入兔抗人CLU血清及HRP羊抗兔 IgG, ECL显色后观察结果。(3)Western blot检测抗CLU抗血清: 将肝匀浆总蛋白以12 g/L的浓度上样, 经120 g/L SDSPAGE凝胶电泳后, 并转膜, 依次加入按110000稀释的兔抗人CLU多克隆抗体及HRP羊抗兔 IgG, ECL显色后观察结果。设阴性对照为正常兔血清代替抗CLU抗血清, 空白对照为TBST代替抗CLU抗血清5。1.2.5  鼠mAb的制备  3只68周龄, 质

15、量为1721 g的BALB/c小鼠。将人GSTCLU融合蛋白80 g溶于250 L生理盐水并与等体积弗氏完全佐剂进行充分乳化, 对BALB/c小鼠进行皮下和腹腔注射。首次免疫4周后进行第2次免疫, 免疫剂量减半, 并与等量弗氏不完全佐剂充分乳化。第2次免疫后7 d, 经尾静脉采血, 用ELISA法测定血清抗体的效价。加强免疫3 d 后, 取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0细胞按常规方法融合。用间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆化, 并按常规方法制备mAb 腹水6。1.2.6  抗CLU mAb的特性鉴定  （1）mAb的腹水效价及Ig亚类的测定: 腹水中mAb的效价采

16、用间接ELISA法测定。采用Hbt小鼠mAb分型试剂盒测定杂交瘤细胞培养上清中抗CLU mAb的Ig亚类。（2）mAb的特异性鉴定: Western blot检测, 将纯化后GSTCLU和HisCLU融合蛋白加入还原性SDSPAGE上样缓冲液中, 于100变性10 min。取4 L进行120 g/L SDSPAGE, 并转膜, 依次滴加杂交瘤细胞的培养上清及HRP羊抗鼠IgG, ECL显色后观察结果。设阴性对照为正常鼠血清代替杂交瘤细胞的培养上清, 阳性对照为融合鼠血清代替杂交瘤细胞的培养上清。间接免疫荧光检测, 将 HepG2细胞以1×108/L的浓度铺6孔板, 

17、0; 培养48 h后, 40 g/L多聚甲醛（10 g/L TRIton）固定10 min（PBS洗涤3次）; 羊血清封闭（37, 30 min）; 依次滴加杂交瘤细胞的培养上清（4过夜, PBS洗涤3次）; 滴加1200稀释的 FITC羊抗鼠 IgG（室温孵育30 min, PBS 洗3次）; 加染核试剂 Hochest（室温孵育30 min, PBS 洗3次; 800 g/L甘油封片, 镜检拍照。免疫组化染色, 将成人肝脏组织石蜡切片, 常规脱蜡至水, 30 mL/L的H2O2封闭（室温30 min）, 10 mmol /L的柠檬酸盐缓冲液中微波加热修复（9298, 15 min）, 羊血

18、清封闭（37, 30 min）, 依次加杂交瘤细胞培养上清（4孵育过夜, TBST洗涤3次）及Poly Helper（37孵育30 min, TBST洗涤3次）, HRP羊抗鼠 IgG（同上孵育及洗涤后）, 加DAB显色, 经苏木素复染、 脱水、 透明及封片后, 观察结果。2  结果2.1  GSTCLU 融合蛋白的表达与鉴定  SDSPAGE电泳检测, 观察到含重组质粒pGEX4T1CLU和PET32aCLU的菌经IPTG诱导后, 与大肠杆菌BL21 空菌对照相比在Mr约54000和47000处均出现1条新的蛋白带, 其大小与预测的CLU融合蛋白的Mr相一致, 表达量约占菌体总蛋白的50%60%, 融合蛋白主要以包涵体的形式表达（图1A）。通过Western blot检测, 应用抗GST的抗体能够在相应位置检测到GST和GSTCLU融合蛋白（图1B）。图1  CLU融合蛋白的SDSPAGE和Western blot分析（略）Fig 1  SDSPAGE and Western blot analysis of CLU fusion proteinA: 1: Protein