DNA提取过程中各种试剂的作用及原理

1、D N A 提取过程中各种试剂的作用及原理、亠 液溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的P -1,4糖苷键，因而具有 溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA (1)螯合Mg牡、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解 作用(DNase作用时需要一定的金属离子作 辅基)；(2) EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。溶 液 II N a O H -NaOH核酸在pH大于5,小于9的溶液中，是稳定的。 但当pH> 12或

2、pHv 3时，就会引起双链之间 氢键的解离而变性。 在溶液II中的NaOH浓度为/L,加抽提液时，该系统的pH就高达，因而促使 染色体DNA与质粒DNA勺变性。SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有： 溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。 解聚细胞中的核蛋白。SDS能与蛋白质结合成为R-0-S03-R+ -蛋白质的复合物，使 蛋白质变性SDS(1)(2)(3) 而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除 干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。3. 溶液III-3mol /L NaAc()溶液：NaAc的水溶液呈碱

3、性，为了调节 pH至， 必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用的NaAc溶液是为了把的抽提液， 调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的 3mol/L NaAc有利于变 性的大分子染色体DNARNA以及SDS蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少 相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使 沉淀更完全。4. 为什么用无水乙醇沉淀 DNA用无水乙醇沉淀DNA这是实验中最常用的沉淀 DNA勺方法。乙醇的优点是可以 任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNAf艮安

4、全，因此是理想的沉淀剂。DNA容液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水 分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加 2倍体积的无水乙醇与DNA 相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵）。但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA 损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA一般在室温下放置15- 30分钟即可。5. 在用乙醇

5、沉淀DNA时，为什么一定要加 NaAc或NaCl至最终浓度达L?在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCI, 使Na冲和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成 DNA沉淀不完全，当加入的盐 溶液浓度太高时， 其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA的酶切等 反应， 必须要进行洗涤或重沉淀。6. 加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与 KAc来处理？加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化 DNA

6、又必须去除之，加SDS可使 它们成为SDS蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾 盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉 淀，去除RNase在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。7. 为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（PKa=）和硼酸系统（PKa=）等虽然也都符 合细胞内环境的生理范围（pH），可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根 离子的种类及数量将与 Ca2+产生Ca3（PO4）2沉淀，在DNA反

7、应时，不同的酶对 辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度， 采用Tris-HCl （PKa=的缓冲系统，由于缓冲液是 TrisH+/Tris ，不存在金属 离子的干扰作用，故在提取或保存 DNA时，大都米用Tris-HCl系统，而TE缓 冲液中的EDTA更能稳定。氯仿的作用主要是使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇的作用是 消除抽提过程中出现的泡沫。氯仿是强蛋白质变性剂，抑制 RNA酶的活性，除去蛋白质污染。基因组DNA- CTABtCTABt原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide,十六

8、烷基三甲基溴化铵）,是一种 阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.在高离子强度的溶液中（L NaCI）,CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能 沉淀核酸.通过有机溶剂抽提 ,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可 使核酸分离出来 .注:CTAB溶液在低于15C时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15C.基因组DNA- CTABtCTABS取缓冲液的经典配方Tris-HCl 提供一个缓冲环境 , 防止核酸被破坏 ;EDTA螯合 Mg2+或 Mn2离子,抑制 DNase活性；NaCl提供一个高盐环境,使DNP充分溶

9、解,存在于液相中；CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离；P-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌,避免褐变，使酚容易去除基因组DNA- CTAB法ctaB提取缓冲液的改进配方PVP聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效 去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖. 基因组DNA勺提取核酸分离,纯化采用吸附材料吸附的方式分离 DNA寸，应提供 相应的缓冲体系采用有机 （酚/氯仿）抽提时应充分混匀 ,但动作要轻柔离心分离 两相时 , 应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点 , 在提取过程中辅以相应 的去杂质的方法基因组DNA勺提取

10、核酸分离，纯化 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS,异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白 酶处理核酸分离 , 纯化 多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时 ,在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5M NaCI, 高盐可溶解多糖 . 用多糖水解酶将多糖降解 . 在提取缓冲液中加一定量的氯苯 （1/2体积），氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖.用PEG800代替乙醇沉 淀 DNA在 500 卩 L DNA液中加入 200 卩 l 20%PEG8000：含 M NaCI）,冰浴 20min. 核酸分离 , 纯化多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：P -巯基乙醇，抗坏血酸，半 胱氨酸,二硫

11、苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP聚乙烯吡咯酮）,PEG（聚 乙二醇）,它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA勺结合 盐离子的去除 ：70%的乙醇洗涤核酸吸附 , 沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附 核酸,其它的杂质均被洗掉,达到纯化DNA勺目的另一种方式加入1/10体积的 NaAc,3M）,用预冷的乙醇或异丙醇沉淀 RNA®附或沉淀后应用70%勺乙醇洗涤, 以除去盐离子等若长期储存建议使用 TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+ 或Mn 2+离子,抑制DNase pH值为,可防止DNA发生酸解。基因组DNA提取常见问题DNA中含有蛋白,多糖,多酚类杂质DNA在溶解前

12、,有酒精残留,酒精抑制后续酶解 反应DNA中残留有金属离子有RNA的存留原因对策重新纯化DNA过吸附柱去除 蛋白,多糖,多酚等杂质重新沉淀DNA让酒精充分挥发增加70聽醇洗涤的次数 （2-3次）加入RNase降解RNA问题一 :DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCF反应.DNA提取常见问题材料不新鲜 或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料 , 低温保存材料避免反复冻融液氮 研磨或匀浆组织后 , 应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的 材料的DNA寸，可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻 柔所有试剂用无菌水配制，耗材