WesternBlot常见问题及处理总结

1、免 疫 细 胞 研 究 w est e r n b l o tWesternBlot 常见问题及处理总结阿木1、 westernblot 的优点答：2、答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论 上可达 pg 级。方便，特异性高。 为什么我的细胞提取液中没有目标蛋 白？原因有很多 :a） 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b）你的细胞中的蛋 白质被降解掉了，你必需加入 PMSF ，抑 制蛋白酶活性；C）你的抗体不能识别目标 蛋白，多看看说明，看是否有问题。3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清 亮，为什么呢？答：a）有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高 SDS 浓度，同时将样品

2、煮沸时间延长，b）也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。4、我做的蛋白质分子量很小 （10KD ），请 问怎么做 WB ？ 答：可以选择卩ml的膜，同时缩短转移时 间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 其他按步骤即可。5、我的目的带很弱，怎么加强？ 答：可以加大抗原上样量。这是最主要 的。同时也可以将一抗稀释比例降低。量，降低一抗浓度，改6、胶片背景很脏，有什么解决方法？ 答：减少抗原变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？HRP 催化答：你的一抗浓度较高，二抗 活力太强，同时你的显色底物处于一个临 界点，反应时间不长，将周围底物催化 完，形成了

3、空白即 “反亮现象 ”。将一抗和 二抗浓度降低，或更换新底物。8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？ 答：如果能够排除下面的几个问题那么问 题多半出现在一抗和抗原制备a）二抗的HRP活性太强，将底物消耗光；b）ECM 底物中 H 2O2 ，不稳定，失活；c）ECL底物没覆盖到相应位置；d）二抗失活。9、我在显影液中显影 1 分钟和 5 分钟后 ,底片漆黑一片 ,是什么原因呢 ?答：a）可能是红灯造成的，胶片本来就被曝 光了，可以在完全黑暗的情况下操作 .看是 否有改善 .； b ）显影时间过长。10、DAB 好还是 ECM 好？答： DAB 有毒，但是比较灵敏，是 HRP 最敏感的底物； ECM

4、 结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测 pg 级抗原。要看你实验的情况。11、抗原检测出的分子量比资料上的大， 是怎么回事？答：a）抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开体。b）蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时 Marker 转上去了，为什么？ 答：可能是：a）样品浓度过低；b）转移时 不够，。niH!i!i!13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加 NaF 等？答： NaF 是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在

5、，需要做免疫组化和 westernblot 试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？答：免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不 易与背景区分； Westernblot 可以特异性检 测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能 定位。两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实 验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或 者冰冻切片。!1!15、做 WesternBlot 时，提取蛋白后冻存 （未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一 抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上量已加到120pg换了个santacloz的一niR!i!1!i!抗仍不行。是什么原

6、因？蛋白酶抑制剂单 加 PMSF 行吗？ 答：怀疑是样品问题，可能是： 1 ，样品不 能反复冻融； 2，样品未加蛋白酶抑制剂。 同时，建议检查 WesternBlot 过程，提高 一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一 般加 PMSF 就可以了，最好能多加几中种 蛋白酶抑制剂。17、16、能，没有问题细胞水平要做 westernblot ，多少细胞 提的蛋白够做 westernblot ？ 答：一般5X106就足够了 同一样品能同时提 RNA 又提蛋白么？ 这样对 westernblot 有无影响？ 答：答：同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot 检测吗？当然可以，有的甚至可以同

7、时测几十种样品。18、性。MIR!i!NaF 去抑19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋 白，操作需要注意什么？ 答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去 垢剂要温和得多，这时最好加 制磷酸化酶的活20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不 到 1 微克，但是在转膜时经常会发现只有 一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染 胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是 颜色变淡了，有什么办法可以解决？ 答：你可以加大上样量，没有问题，还有 转移时你可以用减少电流延长时间，加 20甲醇21、想分离的蛋白是分子量 200kd 的，SDS-PAGE 电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易

8、作 WesternBlot 吗？答： 200kd 的蛋白不好做，分离胶用 7，积层胶。22、如果上样量超载，要用什么方法来增 量？答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白地，超载 30是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试的。23、蛋白变性后可以存放多久？80 C,两年没有冋题。最关键两 不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消 化掉 （也是被酶水解了 ）。我所测定的蛋白分子量是 105KD ,按 理说分离胶应当采用 % ,但资料却要求分 离胶和浓缩胶均采用 11的配方,不知为 何？ 述提到的两种凝胶均可以使用,因。一般答： 条：

9、24、!1!答：为 105KD 的蛋白在上述两种胶的线性分辨 范围内,但需注意条带位置。 抗是生物素化的抗体,三抗是亲和 素生物素体系,不知采用这样的方案后,25、封闭液是否要作调整,能否再用 5的脱 脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响 亲和素生物素的生成,是吗？始摸条件时，为了拿到解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉 中含生物素，用BSA代替应该好一点. 26、问一般一次上样的蛋白总量是多少， 跟目的蛋白的表达量有关系吗？ 答： WesternBlot 一般上样 30100 微克不 等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一 二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色 时间长短有关。开阳性结果，各个步

10、骤都可以量多一点时间 长一点，当然背景也就出来了。要拿到好 的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体 不好的话就需要反复地试了，当然有的不 适合 WesternBlot 的怎样做也不行。!1!27、做组织样品的 western 的时候，怎样处 理样品？ 答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋 白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白 需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可 能还要分步抽提 （超速离心 ）。还有一点就 是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑 制蛋白酶的活性（加入P MSF）问大分子量蛋白 200KD ，在做 western要注意什么呢？做 200kd 蛋白的 WesternBlot 时要注分离

11、胶最好选择 >7% 的；剥胶时要小28、缓冲液来稀释31、答： 意， 心；转移时间需要相应延长；要做分子量 参照（否则出现杂带不知道如何分析）。29、有什么方法可以提高上样量？ 答：a）可以浓缩样品；增大上样体积来增 大上样量；b）用5倍的 变性 30、蛋白的上样量有没有什么具体的要 求？ 答：上样量要根据实验的要求来定，如果 要求是定量和半定量的 WesternBlot 则上 量要均等，如果只是要定性，则没有太 大的关系，尽量多上就行了，但是不要超 载. 抗，二抗的比例是否重要？ 答：比较重要，调整好一抗，二抗的比 例，可以去掉部分非特异的本底。MIR!i!32、要做磷酸化某因子 We

12、sternBlot ，其抗有何要求？答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用 HRP 标记的二抗33、免疫组化和 WesternBlot 可以用同一种抗体吗？答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处 理的抗原决定簇 （又称表位） ，有些表位是 线性的，而有的属于构象型；线性表位不 受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋 白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结 构限制，煮后变性会消失。如果你所用的 抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸， 也就是线性表位，那么这种抗体可同时用 于免疫组化和 Western ，而如果抗体识别 构象形表位，则只能用于免疫组化。34、WesternBlot 中抗体的可以

13、重复应用 吗？ 答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使 用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用 2 3 次。稀释后应在 2 3天内使用， 4 度保 存，避免反复冻融。HIR35、在做 WesternBlot 时， PVDF 膜用甲醇浸泡的目的？答： PVDF 膜用甲醇泡的目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟 带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转 移时多加甲醇也是这个目的MIRMIK!i!i!36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？答：可以。37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么 大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢

14、，你延长转移时间和电流，大分子一端 就会好的多，但是小分子的就有可能会变 淡。38、做 WesternBlot 时，同样的抗体免疫 组化能做出，而 WesternBlot 却不能？ 答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说 明，是否能做 WesternBlot 和免疫组化。39、如果是6X8转印膜，要加多少一抗？答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的 一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育 体积一般最少为 35ml 。40、槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。答：无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液NIR!1!i!41、跑电泳的时候配的胶总是 “缩”是什么

15、 原因呢？是有的成分不对吗？ 答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸 发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加 点水保持湿度就可以了；也可能母液 （ 30% 聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观 察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用 好的试剂。42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离 小 21KD ，中至 66KD ，大至 170KD ，可以 一次做好吗？ 答：这么广的分布不好转移，一般建议： 21kd 和 66kd 可以一起转， 12 SDS-PAGE ，湿转 120mA，45-60min 就可 以了，可以根据你实验室的经验调节； 170kd 用 7%SDSPAGE ， 200mA90-120mi

16、n 。甲醇对43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜 上，转移效率低怎么样解决？ 答：可以考虑：转移缓冲液中加入 20% 甲 醇（是指终浓度） ，因为甲醇可降低蛋白质 洗脱效率，但可增加蛋白质和 NC 膜的结 合能力，甲醇可以防止凝胶变形， 高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓 冲液加入终浓度 %SDS ，也是为了增加转 移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径 的 NC 膜（微米） .o量 Marker 跑走44、我用的是可视 marker ，但是电泳总跑 不全 8 条带，请问什么原因？怎样改善？ 胶用过 8， 10， 12，都是这样。 marker 是新买的 答：一般来说，是小分子 了，增加胶浓

17、度或减少电泳时间试试看。 当然梯度胶也是不错的选择。45、是否 WesternBlot 实验半定量一定要加 ACTIN 内参？答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。46、核内抗原 WesternBlot 内参选择什么 合适？ 答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中 的表达是很稳定的，有很多都可以当成内 参，在网上查查就可以选出你要的内参。47、做半定量 WesternBlot，内参阳ctin ,GAPDH 哪个好？答：选用 beta-actin 就可以。!i!48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制 剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影 响？胞膜和胞浆有区别吗？ 答：一般来说提取时加入广谱的

18、蛋白酶抑 制剂就可以了，操作时保持低温。除非有 文献特别指明用特殊的方法，一般来说都 没有区别。!1!49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是 5% 的TBST 脱脂奶粉 ”，其中 TBST 最后那个 T是 Tween 吗，浓度多大？答：是Tween，配方如下:Tris-BufferedSal in eTwee n-20 (T BST),N aCl: 8g, Trisbase :加水 800ml 溶解，力口500-1000UI 的 Tween-20,用 HCI 调节 pH 至,加水定容至 1L.50、封闭，一抗，抗时的温度有没有什 么规定呢，比如在室温里做，或者要在 4 度下? 答：均可在室温进行，如果时间不够，一 抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4 度过夜。51、请问一下 PVDF 膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF 膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白 接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。 这样的话， PVDF 膜和蛋白接合较牢，不 易